姚力丹，祖玲玲，馬曉燕，依明·蘇來曼，決肯·阿尼瓦什（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

新疆巴什拜羊MSTN mRNA在不同月齡發(fā)育性變化研究

姚力丹，祖玲玲，馬曉燕，依明·蘇來曼，決肯·阿尼瓦什
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

運用熒光定量PCR技術(shù)對不同月齡（0日齡或初生、1月齡、2月齡、3月齡、4月齡、5月齡）新疆巴什拜羊肌肉和脂肪MSTN基因的表達量進行定量，2-ΔΔCT方法分析不同生長階段MSTN基因表達量的差異，以期獲取MSTN基因在不同月齡巴什拜羊的表達規(guī)律，同時豐富與肌肉生長相關(guān)基因的研究。結(jié)果表明：初生、3月齡新疆巴什拜羊肌肉中MSTN基因的表達量極顯著低于1、2、4、5月齡（P＜0.01），1月齡的表達量又極顯著高于其他各月齡（P＜0.01），2月齡顯著低于5月齡（P＜0.05）；初生時新疆巴什拜羊脂肪中MSTN基因的表達量極顯著低于4月齡和5月齡（P＜0.01），1月齡MSTN基因的表達量極顯著高于2月齡和3月齡（P＜0.01）、極顯著低于4月齡和5月齡（P＜0.01），5月齡MSTN基因的表達量極顯著高于4月齡（P＜0.01）。表明巴什拜羊肌肉生長發(fā)育在初生時較快，在1月齡和2月齡生長發(fā)育較慢，3月齡生長發(fā)育最快，隨后生長發(fā)育趨于平穩(wěn)；脂肪的生長發(fā)育在初生后略快于1月齡，2月齡和3月齡的生長發(fā)育較快，4月齡較慢，5月齡生長發(fā)育慢于其他各月齡。

巴什拜羊；MSTN基因；表達

隨著國家西部大開發(fā)進程的不斷推進，新疆居民的消費水平不斷提高，對肉類商品需求不斷增大，加之新疆所居住的龐大少數(shù)民族群體，羊肉一直處于供應(yīng)不足的狀態(tài)，而綿羊肉正是商品羊肉的重要組成部分。因此更需要從分子水平找到與綿羊產(chǎn)肉性能相關(guān)的基因，以指導(dǎo)肉羊生產(chǎn)。

肌肉生長抑制素（MSTN）也稱為生長分化因子GDF-8［1］。研究發(fā)現(xiàn)，該基因能控制肌肉量的增長，且呈現(xiàn)骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子活性，因此又稱為肌生成抑制素。Joulia-Ekazaa等［2］根據(jù)前人研究總結(jié)了MSTN基因抑制肌肉生長的主要調(diào)控機理，隨后多位學(xué)者對其進行了研究，認(rèn)為傳統(tǒng)雙臀肌品種在MSTN基因上存在移碼、缺失、插入、沉默等改變，而對應(yīng)其他品種在該基因上則沒有出現(xiàn)上述變化，說明MSTN與雙臀肌有明顯相關(guān)性［3］。Masabanda構(gòu)建了包含牛MSTN的2號染色體的細胞遺傳圖譜，將該基因定位于2q14-15，并將2個與肌肉生長抑制素基因相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記定位于牛2號染色體連鎖圖1.5cM處［4］。1983年，人們在陶賽特羊中也發(fā)現(xiàn)了雙肌現(xiàn)象，并能遺傳給后代，因其臀部肌肉顯著發(fā)達于普通羊，而被稱做Callipyge，國外通過DNA標(biāo)記將Callipyge突變基因定位于第18號常染色體上，以非孟德爾方式遺傳，被稱做極性超顯性。1997年，McPherron等［5］通過基因打靶技術(shù)敲除小鼠體內(nèi)的MSTN基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被敲除基因的小鼠體型遠遠大于野生型，每塊骨骼肌的質(zhì)量是野生型的2～3倍，骨骼肌纖維素比野生型高出86%，這表明肌肉質(zhì)量的增加可能是由于肌細胞的增生造成。2004年，Chuelke等［6］發(fā)現(xiàn)一個德國嬰兒MSTN基因的剪接位點突變，導(dǎo)致了其肌肉體積是正常嬰兒的2倍。除此之外，MSTN基因不僅可以調(diào)控細胞周期，而且還可以通過抑制MyoD基因的表達調(diào)控細胞的分化，從而抑制肌肉生長［7-10］。

巴什拜羊體形呈方圓形，具有遺傳性能穩(wěn)定、生長發(fā)育快、適應(yīng)性強、耐粗飼、羔羊早熟性強、增膘快和屠宰率高等優(yōu)點。自然放牧條件下羔羊有很高的產(chǎn)肉性能，4 ～5月齡羔羊在胴體重、屠宰率、凈肉率和骨肉比等4個方面居全國首位［11］。目前，國內(nèi)外已對MSTN基因研究非常深入，但并未見到巴什拜綿羊MSTN基因的相關(guān)研究。因此，本試驗率先采用熒光定量PCR技術(shù)定量研究了MSTN基因在新疆地方品種巴什拜羊不同生長期的表達量，通過2-ΔΔCT法分析巴什拜羊MSTN基因在0～5月齡不同時期的相對表達量的規(guī)律性，為研究其產(chǎn)肉性能的分子機制和肌肉增長規(guī)律奠定理論基礎(chǔ)，也對控制其肌肉增長，改善其肌肉品質(zhì)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 在新疆塔城裕民縣選取10只巴什拜羊0日齡（或初生）羔羊，當(dāng)即屠宰其中5只羔羊，以取得0日齡羔羊脂肪和肌肉組織，剩余5只羔羊按照每月采樣（共采6個月）的規(guī)律，對羔羊臀部進行活體采樣，取得的脂肪和肌肉樣品于凍存管中分裝完畢，先在液氮液面以上平衡1min，后放入液氮液面以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、10×dNTP Mixture、5×RT buffer、熒光定量試劑（Ribonuclease Inhibitor、SYBER Premix Ex TaqTM）均購自TaKaRa公司；Ribonuclease Inhibitor、瓊脂糖、氯仿、異丙醇、冰無水乙醇、焦磷酸二乙酯（DEPC）購自新疆阜瑞科生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺，Eppendorf移液器，TGL-16高速臺式冷凍低溫離心機，DYY-6C型電泳儀，普通Biometerya PCR儀，Gel Doc 2000型凝膠成像儀，NANODROP 2000型分光光度計，液氮罐，Lightcycler2.0 PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 按照Trizol試劑說明提取巴什拜羊各期肌肉、脂肪組織總RNA于-80℃保存；各期樣品總RNA分別吸取4μL，于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA品質(zhì)，利用分光光度計測定提取的各期總RNA濃度，選出OD260/OD280比值在1.8～2.0的總RNA樣品。

1.2.2 cDNA的獲取 20μL反轉(zhuǎn)錄體系見表1。反轉(zhuǎn)錄程序見表2。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系（總體積20μL）

表2 PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序

1.2.3 引物設(shè)計及合成 MSTN和β-action基因在Gen-Bank上查詢到的mRNA序列分別為：NM-001009428.1、U39357，用Primer premier5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計本試驗引物，所設(shè)計的引物由上海生物工程股份有限公司負(fù)責(zé)合成，將獲得的引物用滅菌超純水溶解，后稀釋為10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆?。MSTN、β-action基因的引物序列見表3。

表3 MSTN和β-action基因的引物序列參數(shù)

1.2.4 不同時期MSTN基因mRNA表達的定量 分別擴增MSTN和β-actin基因，檢測引物特異性。然后對組織中MSTN和β-actin基因mRNA相對定量分析。具體反應(yīng)體系見表4。

表4 PCR反應(yīng)體系（總體積20μL）

表5 PCR反應(yīng)程序

注：65～95℃升溫為0.50℃/s（Plate Read），本試驗使用Light Cycler實時定量PCR儀完成。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 每個樣品MSTN和β-actin基因定量PCR分析所獲得的CT值輸入到EXCEL表上，選擇特定的樣品作為參照（本試驗以1月齡表達量為對照），利用以下相對表達量公式計算出不同月齡中MSTN基因的相對表達量，后利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，采用獨立樣本檢驗進行差異顯著性檢驗。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

相對表達量計算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測

本試驗采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的總RNA進行檢測，由圖1可見清晰的RNA 3條帶，位置分別為：28S、18S和5.8S，RNA質(zhì)量好。使用分光光度計檢測樣品，OD260/OD280比值在1.7～2.0，表明RNA純度較好，可繼續(xù)進行后續(xù)試驗。

圖1 總RNA質(zhì)量檢測

2.2 巴什拜羊基因PCR擴增

根據(jù)表4條件進行PCR擴增，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測MSTN基因擴增產(chǎn)物的質(zhì)量，結(jié)果見圖2。從圖2可見一條清晰的MSTN基因擴增片段接近200 bp，可以做定量分析。

圖2 MSTN基因PCR擴增結(jié)果

2.3 巴什拜羊MSTN基因和β-actin基因定量PCR產(chǎn)物特異性分析

通過以下溶解曲線分析可知：MSTN基因和β-actin基因的PCR產(chǎn)物均呈單一峰，可以基本排除引物二聚體或其他因素對試驗的干擾，引物有很好的特異性。

圖3 MSTN和β-actin基因溶解曲線

2.4 巴什拜羊MSTN基因在肌肉中不同生長期的相對表達量

從表6可以看出，MSTN基因在所檢測的巴什拜羊樣本中均有表達，從表達量上可以看出以下趨勢：

巴什拜羊肌肉中MSTN基因的表達量在1月齡進入峰值，之后維持較低水平，其中0日齡、3月齡的表達量極顯著低于1、2、4、5月齡（P＜0.01），1月齡的表達量又極顯著高于其他月齡（P＜0.01），2月齡顯著低于5月齡（P＜0.05）。

巴什拜羊脂肪中MSTN基因的表達量在出生后4個月維持在較低水平，在5月齡快速達到峰值，其中1月齡極顯著高于2月齡和3月齡（P＜0.01），但極顯著低于4月齡和5月齡（P＜0.01），0日齡極顯著低于4月齡和5月齡（P＜0.01），5月齡極顯著高于4月齡（P＜0.01）。

表6 巴什拜羊MSTN基因mRNA在肌肉和脂肪中不同月齡相對表達量

3 討論

MSTN基因是通過負(fù)調(diào)控肌肉生長，在豬、牛、狗等動物中都有研究［12-14］。關(guān)于在新疆地方品種羊的研究中，祖玲玲［15］在新疆也木勒白羊不同月齡MSTN mRNA表達量研究中表明，MSTN在肌肉中的表達量3月齡顯著（P＜0.05）低于其他月齡，其余各月齡均差異不顯著（P＞0.05）。MSTN基因在脂肪中的表達量初生時最低，隨月齡增長，表達量升高，5月齡達到最高，后隨月齡增加表達量降低。吐來力江·哈木太［16］在新疆阿勒泰羊不同月齡MSTN mRNA表達量研究中表明，MSTN基因在肌肉的表達量初生時最低，4月齡最高，4～5月齡表達量顯著高于初生、3月齡及6月齡（P＜0.05）。MSTN基因在脂肪中的表達量初生時最低，6月齡最高，初生～2月齡表達量顯著低于3～6月齡表達量。安外爾·熱合曼［17］在吐魯番黑羊研究中也表明，MSTN基因在吐魯番黑羊4月齡肌肉中的表達量最高。

在本研究中，MSTN基因在肌肉中的表達量1月齡顯著高于其他各月齡，在脂肪中5月齡顯著高于其他各月齡，這與李達等［18］的研究結(jié)果一致。MSTN基因的表達量都有個峰值，且不會隨著月齡增加而增加。本研究結(jié)果表明，在肌肉中3月齡的表達量極顯著低于1、2、4、5月齡（P＜0.01），脂肪中5月齡表達量極顯著高于其他各月齡，這與祖玲玲［15］的研究結(jié)果一致。表明巴什拜羊MSTN基因在3月齡肌肉生長要快于1、2、4、5月齡，而5月齡脂肪生長則慢于其他各月齡。在肌肉中初生時MSTN基因表達量極顯著低于1、2、4、5月齡（P＜0.01），脂肪中5月齡的表達量高于其他各月齡，2～3月齡表達量低于4～5月齡，這與吐來力江·哈木太［16］的研究結(jié)果相同。表明巴什拜羊在初生時肌肉生長要快于1、2、4、5月齡，在5月齡脂肪生長則慢于其他各月齡。而造成其他各月齡的表達量與前人不同的原因可能是由于品種不同，且巴什拜羔羊是自由、開放式的放牧飼養(yǎng)條件，使得MSTN基因的表達量呈現(xiàn)不規(guī)律的波動，而影響MSTN表達量具體有哪些因素，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過對巴什拜羊MSTN mRNA不同月齡發(fā)育性變化的研究表明，巴什拜羊MSTN基因在肌肉中初生和3月齡的表達量極顯著低于1、2、4、5月齡（P＜0.01），表明在初生和3月齡肌肉生長發(fā)育較快于1、2、4、5月齡，1月齡肌肉生長發(fā)育慢于其他各月齡。在脂肪中5月齡表達量較高，表明巴什拜羊5月齡脂肪生長緩慢。巴什拜羊肌肉生長發(fā)育在初生時較快，隨后在1月齡、2月齡生長發(fā)育較慢，3月齡生長發(fā)育最快，隨后生長發(fā)育趨于穩(wěn)定；脂肪并不隨肌肉生長而生長，初生后略快于1月齡，2、3月齡生長發(fā)育較快，4月齡較慢，5月齡生長發(fā)育趨于平穩(wěn)。

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Developm entalChangesof MSTN m RNA in X injiang BashibaiSheep at Different Ages

Yao Lidan，Zu Lingling，Juekeno·Aniwashi，etal
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

In order to obtain the expression law of MSTN gene in themuscle and fat tissues of Bashibaisheep in differentgrowth stages，theexpression of MSTN geneofBashibaisheep attheagesof0 day，1month，2months，3months，4months，5monthswere measured and analyzed.The results showed that：the MSTN gene expression levels in themuscles at the ages of0 day，3months were very significantly lower than those at the ages of 1，2，4，5 months（P＜0.01），the level at the age of 1 month was very significantlyhigher than the levelsat theagesof theothermonths.（P＜0.01），the levelat theageof2monthswassignificantly lower than the level at the age of 5 months（P＜0.01）；the MSTN gene expression level in the fat tissues at the age of 0 day was very significantly lower than those at the agesof4，5months（P＜0.01），the levelat the age of1monthwas very significantly higher than the levelsat theagesof2，3months（P＜0.01），butvery significantly lower than thoseat the agesof4，5months（P＜0.01），the level at the age of 5 months was very significantly higher than that at the age of 4 months（P＜0.01）.It indicated that：themuscle developmentatbirth was faster，became slow at the ages of 1 and 2months，was the fastestat the ages of 3months，and became stable in the following period；the fatdevelopmentatbirth was slightly faster than thatat the age of 1month，became faster at the agesof2，3months，became slow at theageof4months，was the slowestat the ageof5months.

Bashibaisheep；MSTN gene；expression

S826.2

A

2095-3887（2015）04-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.002

2015-04-24

國家自然科學(xué)基金（31260530）

姚力丹（1990-），女，碩士研究生。

決肯·阿尼瓦什（1962-），男，哈薩克族，教授，博士，從事動物遺傳育種與繁殖研究。