路佩瑤，曹寧賢，王福傳，宋獻(xiàn)藝，閆益波，高 莉，趙英虎，張 凱，張玉換（.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，太原 000；.山西省畜禽繁育工作站；.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 000；.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院）

成年綿羊不同組織中GPR 30mRNA表達(dá)特性研究

路佩瑤1，曹寧賢2，王福傳1，宋獻(xiàn)藝1，閆益波3，高 莉4，趙英虎4，張 凱1，張玉換3
（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，太原 030031；2.山西省畜禽繁育工作站；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032；4.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院）

文章旨在研究成年綿羊不同組織中GPR 30mRNA的表達(dá)特性。采用qRT-PCR法對成年雜交綿羊不同組織中GPR 30mRNA的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。結(jié)果表明：GPR 30mRNA在心臟等其他組織中有少量的表達(dá)，在卵巢、附睪尾及下丘腦中顯著表達(dá)（P＜0.05）。說明GPR 30mRNA在成年綿羊的不同組織中均有不同程度的表達(dá)，并在繁殖器官的生長、發(fā)育過程中起著重要的作用。

綿羊；GPR 30；卵巢；睪丸；下丘腦

G蛋白偶聯(lián)受體30（G protein-coupled receptor30）是跨膜的雌激素受體，主要與雌激素結(jié)合，發(fā)揮重要作用［1-3］。研究表明，GPR 30對于睪丸細(xì)胞的增殖及發(fā)育具有重要作用［4］。GPR 30作為一種膜受體參與對生殖功能的調(diào)節(jié)已得到驗(yàn)證［5-9］。2011年，F(xiàn)ranco等［10］和Rago等［11］通過免疫組化技術(shù)，將GPR 30定位在人類睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中。2012年，Chevalier等利用過表達(dá)技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GPR 30在正常人類睪丸支持細(xì)胞、精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中表達(dá)［12］。體外培養(yǎng)人類精母細(xì)胞，Alves等在mRNA水平已經(jīng)證實(shí)GPR 30的存在［13-15］。GPR 30廣泛存在于生殖系統(tǒng)的多種組織中，參與了雌激素對倉鼠卵泡發(fā)育［16］，斑馬魚卵母細(xì)胞成熟［17］，以及小鼠子宮生長的作用［18］。目前，已有對嚙齒動(dòng)物腦內(nèi)GPR 30分布的研究報(bào)道，證實(shí)GPR 30在下丘腦中表達(dá)［19］。然而目前國內(nèi)外對于GPR 30的研究主要集中在小鼠、大鼠及人的卵巢、下丘腦和睪丸細(xì)胞上，對于綿羊等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的研究未有報(bào)道。尤其雜交綿羊不同組織中GPR 30 mRNA的表達(dá)特性研究也未見研究。因此，本研究以成年無角陶賽特羊（）×蒙古羊（♀）雜交羊?yàn)檠芯繉ο?，在mRNA水平上研究GPR 30基因的表達(dá)特性，為以后的科研工作者和動(dòng)物生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)為進(jìn)一步了解GPR 30的重要作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及組織

1.2 主要試劑

TrizolReagent（寶生物工程大連有限公司），SYBR誖Premix Ex TaqTMⅡ（寶生物工程大連有限公司），Prime-ScriptTMRTReagent Kit（寶生物工程大連有限公司），pEASY誖-T3 cloning Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司），GC-rich PCRMasterMix（北京康為世紀(jì)生物有限公司）。其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成 取出-80℃保存的成年雜交羊不同組織，按照Trlzol操作說明提取總RNA，核酸蛋白測定儀ND-1000（美國Nano-Drop Technologies）測定總RNA濃度和純度，RNA濃度調(diào)至1μg/L左右，-80℃保存。根據(jù)PrimeScript誖RTReagentkit試劑盒操作說明，反轉(zhuǎn)錄。10μL反轉(zhuǎn)錄體系為：5×Prime Script誖Buffer（for Real Time）2μL，Total RNA 1μL，RNase Free ddH2O 7.0μL；37℃15min，85℃5s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存。1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上的人GPR 30 mRNA序列（登錄號：CR541741.1）和綿羊18S rRNA（登錄號：AY753190.1），利用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物各1對，由北京華大中生基因有限公司合成，引物序列如表1。

表1 GPR 30及18S引物序列

1.3.3 RT-PCR 15μLPCR反應(yīng)體系：正反向引物（10 μmol/L）各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2× EsTaqMasterMix（含染料）7.5μL。反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min，產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 測序測定 按照pEASY誖-T3 cloning Kit說明，將回收出的 DNA片段連接至 T3-Cloing-Vector，PCR儀25℃恒溫10min，使回收產(chǎn)物與T3載體充分連接。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，涂布到LB固體培養(yǎng)基（含AMP），37℃過夜（12～16 h）培養(yǎng)。藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落，LB液體培養(yǎng)基（含AMP）培養(yǎng)12～16 h，菌液交由北京華大中生基因有限公司測序。

1.3.5 相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 將含GPR 30 cDNA片段的模板按照2×稀釋8個(gè)梯度，制備標(biāo)準(zhǔn)品，分別為：1.0×29、1.0×28、1.0×27、1.0×26、1.0×25、1.0×24、1.0×23、1.0×22。使用ddH2O代替模板，作為陰性對照，熒光定量體系為：SYBR Primix Ex TaqTM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference DyeⅡ0.4μL，ddH2O 6.0μL，總體積20μL，反應(yīng)程序：95℃變性10 s，95℃5 s，60℃25 s，共40個(gè)循環(huán)。軟件自動(dòng)得出擴(kuò)增曲線、熔解曲線和循環(huán)閾值，分析結(jié)果。

1.3.6 qRT-PCR 根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒建議反應(yīng)條件構(gòu)建反應(yīng)體系同上，每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)Ct值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SASV8（The SASSystem for Windows V8）中ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及RT-PCR

經(jīng)檢測，不同組織樣品的總RNA OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之間，且3.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測28S、18S清晰，符合反轉(zhuǎn)錄要求。以成年雜交羊的心、肝等組織的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，3.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，無拖尾和引物二聚體，在附睪體和附睪尾中顯著表達(dá)（如圖1）。測序結(jié)果BLAST分析顯示，GPR 30 cDNA與NCBI公布的人GPR 30 cDNA同源性為：98.48%，說明雜交羊GPR 30 cDNA序列具有較高的保守性，該序列可用于熒光定量檢測。

圖1 成年綿羊不同組織RT-PCR結(jié)果

2.2 相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖2-A為標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系，GPR 30和18S的擴(kuò)增效率分別為99.7%和99.8%，R2分別為0.995和1.013。雜交綿羊不同組織的GPR 30mRNA熒光定量的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線平行性良好，起峰點(diǎn)清晰，基線比較平穩(wěn)，拐點(diǎn)相對清楚，曲線為S型（圖2-B）；熔解曲線顯示，峰單一，無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)（圖2-C）。表明本試驗(yàn)建立的GPR 30 mRNA定量檢測方法滿足試驗(yàn)要求。

2.3 雜交羊不同組織中GPR 30mRNA表達(dá)量

成年雜交羊不同組織中GPR 30mRNA熒光定量檢測結(jié)果顯示，GPR 30mRNA在心、肝、脾、腎、大腦、小腦、下丘腦中均有不同程度的表達(dá)，下丘腦中GPR 30mRNA的表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05）；GPR 30mRNA在附睪體、附睪尾中的表達(dá)量顯著高于睪丸和附睪頭（P＜0.05）；GPR 30mRNA在卵巢中的表達(dá)量顯著高于子宮（P＜0.05），子宮體、子宮頸、子宮角中GPR 30mRNA的表達(dá)量均差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 GPR 30和18S的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線和熔解曲線

圖3 綿羊不同組織中GPR 30mRNA相對表達(dá)量

3 討論

GPR 30在人類多種組織中廣泛表達(dá)，包括睪丸、卵巢和前列腺［20］。GPR 30介導(dǎo)多種細(xì)胞類型，調(diào)節(jié)機(jī)體生理作用，在小鼠的睪丸細(xì)胞細(xì)胞漿中已證實(shí)有GPR 30的表達(dá)［21-23］。Otto等發(fā)現(xiàn)在小鼠睪丸組織中GPR 30顯著表達(dá)［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，在成年雜交羊的心臟等組織中具有不同程度的表達(dá)，且在附睪尾、下丘腦及卵巢中顯著表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果相符。筆者認(rèn)為，在附睪尾中大量表達(dá)，GPR 30可能與精子的成熟具有重要的關(guān)系。

Hazell等［25］證明GPR 30在大鼠卵巢中主要位于卵泡顆粒和膜細(xì)胞中；同時(shí)GPR 30免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物也主要定位于細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中，表明其作為一種膜受體并進(jìn)入胞內(nèi)相應(yīng)部位如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周區(qū)等，進(jìn)而觸發(fā)下游的信號途徑［26］，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究中在卵巢中大量表達(dá)。推測GPR 30對于卵子的生成及卵巢的生長具有重要作用，其具體機(jī)制如何，有待于進(jìn)一步研究。

Brailoiu等［27］首次全面報(bào)道GPR 30免疫反應(yīng)產(chǎn)物在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)GPR 30主要位于下丘腦-垂體軸、海馬、腦干等部位；GPR 30在下丘腦的室旁核、視上核、視交叉上核、室周核、弓狀核以及乳頭體外側(cè)核都有明顯的表達(dá)，而在腹外側(cè)核、乳頭體內(nèi)側(cè)核等處表達(dá)明顯減少，這與本研究結(jié)果基本一致。進(jìn)一步推測，GPR 30對性激素的分泌具有調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

GPR 30mRNA在成年綿羊的不同組織中均有不同程度的表達(dá)，推測其在繁殖器官的生長、發(fā)育過程中起著重要的作用。

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GPR 30m RNA Expression in D ifferent Tissuesof Adult Sheep

Lu Peiyao1,Cao Ningxian2,Zhang Yuhuan3，etal
（1.Feed and Veterinary DrugResearch Institute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan 030031,China; 2.Livestock Breeding Station ofShanxiProvince；3.InstituteofAnimalHusbandryand Veterinary Sciences,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan 030032,China）

Theobjectiveof thisstudywas toevaluate GPR 30mRNA expression in different tissuesofadultsheep.GPR 30mRNA expressions in different tissues of adult sheep were detected by real-time fluorescentquantitative PCR.The results showed that GPR 30 mRNA was not significantly expressed in the heart and other organizations.However，GPR 30 mRNA was significantly expressed in the ovary,epididymidis body and hypothalamus（P＜0.05）.GPR 30mRNA appeared to be ubiquitously expressed almostin different tissuesofadultsheep.Itplaysan important role in the sheep reproductiveorgan growth and development.

sheep；GPR 30；ovary；testis；hypothalamus

S826.2

A

2095-3887（2015）04-0013-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.004

2015-06-20

山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311025-1）;山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140311008-7）;山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311025-4）;山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金項(xiàng)目（YBSJJ1403）;山西省青年科技研究基金（2012021027-3）

路佩瑤（1984-），女，助理研究員，博士。

張玉換（1957-），女，研究員，主要從事肉羊健康養(yǎng)殖及疫病防控技術(shù)工作。