重組槲寄生凝集素抗肝癌作用

楊學(xué)良任強(qiáng)王廣義1

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的探討重組槲寄生凝集素-Ⅰ(rVAA-Ⅰ)對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法通過四氮唑比色法(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡及Caspase檢測rVAA-Ⅰ對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)，通過基因芯片分析找到差異基因。結(jié)果rVAA-Ⅰ誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，在rVAA-Ⅰ濃度8 ng/ml時(shí)，有30%的細(xì)胞發(fā)生凋亡；在16 ng/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡增加到44%；在32 ng/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡達(dá)到51%。表明，rVAA-Ⅰ可以誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴性。在16 ng/ml時(shí)，隨著給藥時(shí)間的延長，對細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，48 h細(xì)胞的存活率最低，達(dá)30%，存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)證實(shí)rVAA-Ⅰ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Caspase有關(guān)。結(jié)論rVAA-Ⅰ具有直接抗SMMC-7721細(xì)胞作用,在腫瘤免疫學(xué)的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究中具有前景。

關(guān)鍵詞〔〕SMMC-7721；重組槲寄生凝集素-Ⅰ；畢赤酵母

中圖分類號〔〕R57〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：任強(qiáng)(1960-)，男，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰外科

第一作者：楊學(xué)良(1974-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事肝膽及胃腸道腫瘤研究。

槲寄生(Viscum album)是一類依賴落葉樹木生長的半寄生植物的總稱。早在1920年，奧地利學(xué)者就發(fā)現(xiàn)槲寄生的提取物是一種天然的抗癌藥物，近來的研究發(fā)現(xiàn)其中的植物凝集素(Agglutinin)在抗癌活性中發(fā)揮最為重要的作用〔1〕。從槲寄生提取物中可分離獲得種凝集素亞單位，均屬核糖體滅活蛋白家族，分別為槲寄生凝集素(VAA)-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ。而VAA-Ⅰ的生物活性最強(qiáng)〔2〕。本實(shí)驗(yàn)擬證實(shí)rVAA-Ⅰ體外抗肝癌作用。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株、主要試劑人肝癌細(xì)胞株SMMC7721購自吉林省腫瘤醫(yī)院。培養(yǎng)基：IMDM干粉(購于美國GIBCO公司)，溶解于800 ml蒸餾水中，加入100 μg/ml鏈霉素，100 IU/ml青霉素，NaHCO33.7 g， pH值調(diào)至7.2～7.4，過濾除菌，4℃保存。胎牛血清購于美國GIBCO公司，rVAA-Ⅰ為自制，流式細(xì)胞儀購于美國BD公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Forma Scientific 公司，凝膠分析系統(tǒng)購于瑞典Pharmacia公司。Human Genome Array、 SmartArray購于北京博奧生物。

1.2SMMC7721細(xì)胞的培養(yǎng)將SMMC7721細(xì)胞凍存管放入37℃的水浴鍋中溶解，復(fù)蘇的SMMC7721細(xì)胞加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液， 37℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁大于底的75%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，無菌凍存管中分裝，液氮中長期保存供使用〔3〕。

1.3MTT比色法測定rVAA-Ⅰ對SMMC7721細(xì)胞存活率的影響取對數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液， 37℃、5%CO2中培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后換液，分別用終濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 ng/mL的rVAA-Ⅰ處理細(xì)胞，對照組加入等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)平行孔，37℃、5%CO2中分別培養(yǎng)12、24、48 h。取出96孔板，每孔加入MTT溶液5 mg/ml 10 μl，37℃、5%CO2中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μl，于振蕩器上振搖，待藍(lán)紫色結(jié)晶物完全溶解后，在酶標(biāo)儀上檢測A570處的吸光度值。分別計(jì)算不同濃度的rVAA-Ⅰ對SMMC7721細(xì)胞存活率的影響。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡采用FITC-AnnexinV/PI雙熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化情況。取對數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/ml，每孔 3.0×105接種于6孔板中。培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后棄掉培養(yǎng)液，換成含不同濃度rVAA-Ⅰ的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度4個(gè)平行樣。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h，收集細(xì)胞并用冷的PBS溶液沖洗兩次，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml。取1 ml，離心(1 000 r/min，5 min)棄上清，加入195 μl 結(jié)合緩沖液和5 μl FITC標(biāo)記的AnnexinV抗體，常溫避光放置20 min。預(yù)冷的PBS洗2次，再加依次入190 μl 結(jié)合緩沖液和PI 10 μl，4℃、15 min避光保存。流式細(xì)胞儀收集1×104個(gè)細(xì)胞，用Cellquest軟件分析凋亡結(jié)果，以凋亡細(xì)胞的百分率表示。

1.5透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況取對數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后棄掉培養(yǎng)液，加入含終濃度為16 ng/ml的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，對照組加等體積的培養(yǎng)液。換成含不同濃度rVAA-Ⅰ(0.2、1.0、5.0 μg/ml)的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度4個(gè)平行樣。培養(yǎng) 24 h后移入50 ml離心管中進(jìn)行離心，棄去培養(yǎng)液固定2 h。按透射電鏡實(shí)驗(yàn)要求制作樣品，經(jīng)枸櫞酸鉛染色后在10 000倍視野下觀察細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)照相記錄觀察結(jié)果。

1.6Caspase抑制劑z-VAD-fmk對rVAA-Ⅰ抑制細(xì)胞增殖的影響處于對數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞以1.5×105個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜；然后加入50 mmol/L的Caspase家族抑制劑z-VAD-fmk，繼續(xù)培養(yǎng)30 min；而后分別加入濃度為8、16、32 ng/ml rVAA-Ⅰ處理24 h后，MTT法計(jì)算抑制率〔4〕。

1.7芯片雜交采用22K Human Genome Array，共有21 522條Oligo DNA。Oligo庫用SmartArray點(diǎn)制在一張經(jīng)過化學(xué)修飾、大小為7.5 cm×2.5 cm的載玻片上。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，提取總RNA，探針標(biāo)記、雜交、洗片，用LuxScan10KA雙通道激光掃描儀進(jìn)行基因芯片掃描， LuxScan 3.0圖像分析軟件對芯片圖像進(jìn)行分析。差異基因篩選，運(yùn)用One timecourse分析方法，選擇FalseDiscovery Rate<0.1時(shí)差異顯著的基因，并對這些差異顯著基因的表達(dá)模式進(jìn)行聚類分析。

1.8實(shí)時(shí)定量PCR根據(jù)芯片分析的結(jié)果，查找需要驗(yàn)證的目的序列，設(shè)計(jì)引物，并交由北京英茂盛業(yè)公司合成，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201)說明書，加入各種反應(yīng)物，常規(guī)反應(yīng)條件，在美國Bio-Rad伯樂Chromo4多色實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1rVAA-Ⅰ對SMMC7721細(xì)胞存活率的影響8 ng/ml的劑量下，可以顯示出對SMMC7721細(xì)胞的增殖具有較弱的抑制效果，當(dāng)濃度增加到16 ng/ml時(shí)，抑制效果變得更為明顯。rVAA-Ⅰ可劑量依賴性地對SMMC7721細(xì)胞的增殖起到抑制作用，24 h的IC50為16 ng/ml。隨著給藥時(shí)間的延長，對細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，細(xì)胞的存活率明顯下降，存在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。見表1。

對照組VAA-Ⅰ濃度(ng/ml)124816326412812h100±1.4095.68±3.5692.34±5.5289.03±7.861)67.12±8.021)48.45±8.011)29.33±9.521)20.05±9.031)18.22±10.331)24h100±1.5090.12±6.8189.08±7.561)87.68±7.851)56.11±8.221)38.12±8.411)18.54±9.611)16.58±9.521)13.02±12.361)48h100±1.5089.12±7.911)88.68±7.911)85.65±7.961)54.68±8.351)30.78±8.561)19.25±9.881)14.37±9.931)11.38±12.931)

與對照組比較:1)P<0.05

2.2rVAA-Ⅰ可以誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡不同濃度的rVAA-Ⅰ處理SMMC7721細(xì)胞24 h，分別用Annexin V-FITC與PI分別檢測細(xì)胞早期凋亡與末期細(xì)胞凋亡情況，在各個(gè)劑量組中凋亡細(xì)胞的數(shù)量同對照組相比均有所增加。結(jié)果表明，rVAA-I可以誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴性。

2.3rVAA-Ⅰ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Caspase有關(guān)50 mmol/L的Caspase抑制劑z-VAD-fmk可以顯著抑制rVAA-Ⅰ誘導(dǎo)的SMMC7721細(xì)胞凋亡。8、16、32 ng/ml VAA-Ⅰ時(shí)caspase水平分別為(54.68±8.35)%、(30.78±8.56)%、(19.25±9.88)%，與對照組差異顯著(P<0.05)。

2.4透射電鏡觀察rVAA-Ⅰ對肝癌細(xì)胞的影響透射電鏡下可見經(jīng)rVAA-Ⅰ(16 ng/ml)處理的SMMC7721細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核膜破裂、消失，染色質(zhì)凝集、細(xì)胞質(zhì)中空泡增多，核間隙明顯變寬、核膜消失，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清，核斷裂等現(xiàn)象(白色箭頭)。而對照組細(xì)胞體積較大，核質(zhì)比例較高，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少，沿細(xì)胞核膜分布，核仁居中或邊移，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富。見圖1。

圖1　透射電鏡觀測rVAA-Ⅰ(16 ng/ml) 處理的SMMC7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(×8 000)

2.5基因芯片分析結(jié)果對照組和給藥組之間的差異基因使用了Limma算法進(jìn)行顯著性水平的計(jì)算，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：LogFC>1或者LogFC<-1，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01,B值>1.5的基因?yàn)椴町惢?，整體芯片找到3 200個(gè)差異基因用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析，綠色為下調(diào)基因，紅色為上調(diào)基因，見圖2。

圖2　差異基因分析結(jié)果

2.6定量RT-PCR結(jié)果MAPK信號通路中的3個(gè)差異表達(dá)基因MAPK14，IMPA1和SMNDC1與基因芯片的分析結(jié)果完全一致，證實(shí)基因芯片的分析結(jié)果是可信的。

3討論

手術(shù)切除為肝癌獲得根治的最佳手段，但肝癌發(fā)現(xiàn)多屬于晚期，手術(shù)難以切除，且術(shù)后容易復(fù)發(fā)〔5〕。研究報(bào)道，根治性手術(shù)切除后，仍有60%～70%的患者在5年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。而目前市場上的化療藥物也不盡如人意，存在著骨髓抑制、消化道反應(yīng)、嘔吐等嚴(yán)重的毒副作用。

槲寄生在歐美被稱為“生命中的金枝”〔2〕。專家預(yù)測槲寄生有望成為繼紫杉醇之后又一種天然抗癌藥物〔2,6〕。VAA-Ⅰ的獲得主要是采用傳統(tǒng)的分離、提取方法從槲寄生中獲得，由于其含量低，提取分離方法復(fù)雜，限制了其應(yīng)用〔7〕。畢赤酵母是低等真核生物，于20世紀(jì)80年代初開發(fā)獲得，非常有利于真核基因的表達(dá)，具有對外源表達(dá)蛋白進(jìn)行正確加工，修飾及合理的空間折疊等功能，能有效克服大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足；同時(shí)，酵母細(xì)胞具有生長快，操作簡單，易于培養(yǎng)等原核生物的優(yōu)點(diǎn)。因此，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視，已廣泛用于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，被美國食品和藥品管理局(FDA)證實(shí)為是安全、可靠的，其表達(dá)的藥用蛋白不需進(jìn)行大量的宿主安全性實(shí)驗(yàn)。

SMMC7721細(xì)胞的全基因組轉(zhuǎn)錄譜表明，大量的基因表達(dá)發(fā)生在rVAA-Ⅰ殺傷細(xì)胞的過程中。一些與核相關(guān)的GO分類，包括MAPK信號通路(RAP1B，MAPK14，F(xiàn)LNA)的細(xì)胞凋亡(SMNDC1)，蛋白酶(PSMA2，PSMA4)，核黃素代謝(RFK，MTMR6)，色氨酸代謝( FANCL，BRAP)，TGF-β的信號通路(AMH)，磷脂酰肌醇信號的系統(tǒng)(IMPA1)和氧化磷酸化(PPA2)〔8〕。本研究中，當(dāng)細(xì)胞暴露于rVAA-Ⅰ FLNA，MAPK14，RAP1B的基因表達(dá)改變。FLNA已經(jīng)牽連的各種胞外刺激誘導(dǎo)的MAPK信號，并且它可以與MAPK激酶MEK1和MKK4〔9〕進(jìn)行交互。它也可以是核糖體蛋白S6激酶ERK的目標(biāo)〔4〕。此外，還涉及了幾個(gè)基本的細(xì)胞功能，如黏附，遷移，極性，分化和增長。綜上，體外證實(shí)了VAA-Ⅰ抗肝癌作用，為體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

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〔2013-11-25修回〕

(編輯苑云杰)