陳定超 ，楊 嵩 ，沈峻宇 ，冉 強

（1.四川省閬中市畜牧食品局，四川 閬中 637400；2.四川省畜牧總站，四川 成都 610041；3.四川省南充市順慶區(qū)畜牧局，四川 南充 637000；4.四川省汶川縣農業(yè)畜牧和水產局，四川 汶川 623000）

1 材料和方法

1.1 實驗材料采集 選擇四川農業(yè)大學科研兔場飼養(yǎng)的新西蘭兔為實驗動物，采集0.5cm2大小的耳組織為實驗材料，將采集的耳組織投入盛有75%酒精的EP管內，放入冰盒中帶回實驗室，于-20℃保存?zhèn)溆谩ｋS機采集了416個樣本，公母各半。

1.2 各種試劑盒及主要試劑 提取組織中的全基因組用美國Axyen公司的Genomic DNA Miniprep試劑盒，PCR產物凝膠回收試劑盒為OMEGA公司的E.Z.N.A.TM膠回收試劑盒。Taq DNA聚合酶購至北京 艾 德 萊 公 司 ，6×Loading Buffer、Golden View 和DNA Marker 2000購至北京天根公司，瓊脂糖和DECP購至大連寶生物公司。常規(guī)的氫氧化鈉、氯化鈉、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA的抽提及檢測

1.3.1.1 基因組DNA的抽提 采用Genomic DNA Miniprep Kit基因組提取試劑盒提取家兔全基因組DNA，抽提前對實驗所需器材進行高溫滅菌處理。抽提過程詳見試劑盒說明書。將抽提好的DNA進行分裝，轉移50μL至新的EP管中用于檢測及近期使用。

1.3.1.2 DNA濃度和純度的檢測 使用Nano Vue超微量核酸蛋白儀對DNA濃度和純度進行快速檢測。選擇用于檢測DNA濃度和純度的相應程序后，取2.5μL Eluent緩沖液，直接在儀器的點樣表面點樣檢測，檢測后，用擦鏡紙擦拭干凈，重復3次，進行系統(tǒng)調零校正。每次取待測DNA樣品2.5μL進行檢測，每個樣品重復3次，記錄DNA的濃度值和OD260/OD280比值。OD260/OD280比值是反映DNA純度的指標，越純DNA樣品的OD260/OD280比值越接近1.8。質量較好的DNA樣品，其OD260/OD280比值在1.6～1.8范圍之內。如果比值大于1.8，說明還有RNA的存在，可用RNA酶進行處理；若比值小于1.6則說明樣品中有蛋白質或酚的殘存，可再用苯酚/氯仿或乙醚處理；可能還會出現(xiàn)比值為1.8，但實質DNA中既有蛋白質又含RNA的情況。因此，結合瓊脂糖凝膠電泳檢測結果可以準確地確定DNA的濃度和純度。

1.3.2 引物設計和合成 根據NCBI上提供的家兔Cep55基因的DNA序列（ Genbank ID：XM_002718513.2），先針對該基因的部分功能區(qū)域用Primer 5設計引物進行多態(tài)性檢測（表1），所有引物的合成都由華大基因公司完成。并且針對每對引物，根據公司預測的最適退火溫度設計恰當的溫度梯度進行梯度PCR。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，先根據擴增條帶和Maker的相對位置確定PCR產物是否為目的條帶，再觀察條帶的清晰度和亮度，選擇最佳的退火溫度。

1.3.3 PCR擴增體系和程序 選擇好最佳退火溫度后，對DNA進行PCR反應，送測序，以期通過DNA水平檢測到SNP位點。PCR反應體系10μL，包括2×Taq PCR Mix 酶 5 μL，上、下游引物（ 10 pmol/μL） 各0.4μL，DNA 模板 1μL，加去離子水（ ddH2O）至 10μL。PCR反應程序：95℃預變性 3 min；95℃變性35 s，55℃退火 30s，72℃延伸 60s（ 共 38個循環(huán)）；72℃延伸10min；4℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

表1 PCR引物序列

1.3.4 PCR產物的檢測 取2 μL PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時加入DL2000 Marker共泳作分子量的對照，180V電泳7min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結果，并拍照保存。

在抽提的DNA樣品中隨機選取16個樣進行常規(guī)PCR反應后，將PCR產物每4個樣混合在一起，進行PCR產物混合測序，并檢測遺傳多態(tài)性。全部分裝好后，將4管樣送至華大基因公司測序。

1.3.5 產物基因型判定 凝膠電泳判定基因型是根據單鏈DNA片段的空間構象不同來實現(xiàn)分離的，與DNA的分子量大小和帶電無關。PCR產物在被限制酶內切后，野生型個體應該產生被切斷的兩條電泳條帶，突變雜合子有3條帶，而突變純合子只有PCR產物一條帶。

1.3.6 序列測定 將分辨出來的不同基因型各選一個個體，進行 30 μL體系的 PCR反應，反應體系為10 μL體系各試劑添加量的3倍，然后將得到的PCR產物送相關基因公司純化測序。

1.4 數據處理

1.4.1 主要分子生物學軟件 用Oligo7軟件設計PCR擴增引物，運用DNAman軟件進行序列保存和查看，用Chromas軟件來看測序的峰圖，用Multiple sequence alignment軟件進行多序列的相似性比對，用Statistics Analysis System 9.3軟件包和SPSS 12.0對實驗數據做統(tǒng)計分析。

1.4.2 結果分析指標 基因型頻率和等位基因頻率的計算；遺傳多態(tài)性分析：遺傳純合度、雜合度、有效等位基因數、多態(tài)信息含量的計算。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的抽提與檢測 結果見圖1。只有當紫外燈下觀察到單一且明亮的條帶時，才可順利進行后續(xù)實驗。

圖1 基因組DNA電泳檢測結果

2.2 外顯子 3、6、9的PCR擴增及電泳 利用表 1的引物，以基因組DNA為模板分別擴增得到外顯子3、6、9的 PCR產物。 外顯子3、6、9的 PCR產物的電泳圖結果如圖2所示。

2.3 DNA水平上的遺傳多態(tài)性研究

2.3.1 DNA上突變位點的發(fā)現(xiàn) 在DNA水平上設計3對引物，檢測Cep55基因所有外顯子區(qū)域的多態(tài)性位點。經序列比較分析，總共發(fā)現(xiàn)Cep55基因編碼區(qū)存在5個變異位點，均位于外顯子9的3′UTR區(qū)上， 分別為 c.1759G>A、c.1796C>T、c.2012C>G、c.2163G>A和c.2227A>G。

圖2 外顯子3、6、9的PCR產物電泳圖

2.3.2 家兔Cep55基因各突變位點基因型的確定 序列用Seqman軟件比對，在測序圖中找到相應的突變位點，根據峰圖中突變位點的峰值以及單雙峰情況來確定基因型。純合子突變位點的測序峰為單一峰型，而雜合子突變位點的測序峰為套峰，雜合子的兩個峰比兩種純合子的峰都要低。其中c.2012C>G位點的峰圖如圖3所示。從圖中可以看出，該位點上存在一個C/G的突變，其中CC為野生型，CG為雜合突變型，GG為突變純合子。

圖3 外顯子9 c.2012C>G測序峰圖

對外顯子9重新隨機選取24個樣品進行常規(guī)PCR反應，反應體系為30 μL，之后將產物送往華大基因公司進行單管測序。圖4為單管測序樣品的PCR電泳圖。

圖4 外顯子9 PCR產物電泳圖

2.3.3 c.2012C>G位點與家兔不同生長階段日齡重及35～84日齡平均日增重的關聯(lián)性分析 根據SNP位點周邊序列特點，在c.2012C>G位點采用PCRFRLP技術對416個個體進行基因分型，得到三種基因型的個體數分別為 CC（ 114）、CG（ 269）、GG（ 33），其等位基因頻率、基因型頻率及多態(tài)信息含量見表2。由表2可知，C等位基因頻率為0.60，G等位基因頻率為0.40。三種基因型CC、CG、GG的基因型頻率分別為0.27、0.65和0.08。遺傳雜合度（He）、多態(tài)信息含量（ PIC）以及有效等位基因數（ Ne）分別為 0.4815、0.3025（中度多態(tài)）和1.9285。

表2 c.2012 C>G位點的等位基因、基因型頻率及多態(tài)信息含量

采用最小二乘法分析Cep55基因c.2012 C>G位點與家兔不同生長階段生長性狀的相關性，結果見表3。

表3 基因型與不同日齡體重的最小二乘均方計算結果

注:ADG為35～84日齡的平均日增重，數據用平均值±方差表示；同行肩標不同字母表示不同的差異顯著性水平。

3 討論

3.1 候選基因的篩選 生長性狀受多基因控制，目前已發(fā)現(xiàn)一些基因如GHR、FTO、MSTN等與家兔生長性狀相關，但這只是影響生長性狀的部分基因[1]。本實驗首先通過檢測Cep55基因不同基因型與不同生長階段的家兔生長發(fā)育情況的關系，確認Cep55可以作為家兔生長發(fā)育性狀的候選基因。Cep55基因調控細胞周期進程，對細胞的分裂速度和生長因子反應等多個方面都起著十分重要的作用。

3.2 基因型和生長性狀的關聯(lián)分析 從實驗數據我們可以發(fā)現(xiàn)，56日齡以前，各基因型之間個體重的數值相差不多，但是到了生長后期，不同基因型之間的差距就明顯表現(xiàn)出來了，但是同一基因型個體在不同階段的生長速度比較均衡。

CG基因型的個體在40日齡前的個體重大于CC基因型的個體，但是40日齡之后，CC基因型的個體重就逐漸開始大于CG基因型的個體重，而且隨著日齡的增大差距越來越大。說明CG基因型個體的早期生長速度較快，但是CC基因型個體的后期生長速度明顯大于CG基因型的個體。而GG基因型的個體在出欄前的整個生長周期內，其生長速度都很緩慢?？梢姷任换駽具有促進家兔生長發(fā)育的作用。

3.3 UTR區(qū)的相關研究 隨著后基因組時代的到來，非編碼區(qū)的研究已經成為科學家面臨的挑戰(zhàn)，對基因非編碼區(qū)的一個主要研究方向就是對調控元件的研究。識別轉錄調控元件是理解基因轉錄機制和表達模式的關鍵。雖然人們已經了解了基因的結構，掌握了遺傳密碼，但對于非編碼區(qū)還了解很少，普遍認為它們與基因在四維時空的表達調控有關[2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，3′UTR區(qū)對基因有調控表達作用[3-5]。

4 結論

通過本實驗研究及統(tǒng)計分析，我們初步得出以下結論：

4.1 在新西蘭兔Cep55基因的外顯子9中共發(fā)現(xiàn)了5個多態(tài)性位點，均位于外顯子9的3′UTR區(qū)，分別為 c.1759G>A、c.1796C>T、c.2012C>G、c.2163G>A 和c.2227A>G。

4.2 Cep55基因外顯子9上的5個多態(tài)性位點完全連鎖。

4.3 Cep55基因外顯子9的5個位點均屬于中度多態(tài)。

4.4 關聯(lián)性分析表明，CC基因型在家兔的生長后期有顯著的增重效應，而GG基因型的幾乎所有生長階段的個體重均顯著低于其他兩個基因型，說明Cep55基因外顯子9序列的突變位點可作為家兔生長性狀的遺傳標記。

4.5 3′UTR區(qū)可能作為調控元件影響家兔生長的相關性狀。

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