金子鑫 楊瑞金，2 朱生博 劉新娟 張文斌，2

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.杭州九陽(yáng)小家電有限公司，浙江 杭州 310000）

豆?jié){作為傳統(tǒng)食品，在亞洲多數(shù)地區(qū)消費(fèi)廣泛，因其含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物元素、維生素以及卵磷脂、異黃酮等功能性成分［1］，成為 “乳糖不耐癥”人群的良好牛奶替代品。長(zhǎng)期以來(lái)，豆?jié){一直在中國(guó)人的早餐中占有重要的一席之地。從1994年九陽(yáng)公司發(fā)明第一臺(tái)家用豆?jié){機(jī)以來(lái)，豆?jié){機(jī)逐漸走進(jìn)千家萬(wàn)戶，經(jīng)過(guò)20年的發(fā)展，家用豆?jié){機(jī)的功能和程序得到了不斷的改進(jìn)和提升，為人們帶來(lái)了自制豐富多彩、方便健康的豆?jié){食品的樂(lè)趣。

大豆發(fā)芽不僅可使脂肪氧合酶、胰蛋白酶抑制劑、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的水平降低，同時(shí)還可使水溶性維生素、氨基酸、大豆異黃酮、γ－氨基丁酸（GABA）等物質(zhì)富集［2］而大大提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)，具有降血壓、降血糖、抗抑郁、安定精神、改善更年期綜合癥等多種生理功能［3］。近些年，隨著GABA的生理功能不斷被證實(shí)，GABA的富集、生產(chǎn)和應(yīng)用成為新的熱點(diǎn)。2009年，衛(wèi)生部批準(zhǔn)GABA為新資源食品，可用于食品的生產(chǎn)加工。大豆在發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源谷氨酸脫羧酶（GAD）被激活利用生物體的內(nèi)源谷氨酸脫羧酶的脫羧作用將谷氨酸（L－Glu）轉(zhuǎn)化為 GABA［4］，使 GABA 得到富集。氨基酸不僅是蛋白質(zhì)的基本組成單位，而且其本身具有促進(jìn)胰島素分泌、作用于消化和神經(jīng)系統(tǒng)、提高機(jī)體免疫功能及解毒功能等特殊的生理功能［5］。蛋白質(zhì)或多肽經(jīng)水解成小分子的氨基酸和寡肽后，才被人體小腸黏膜所吸收，更易為機(jī)體所利用［6，7］。大豆中胰蛋白酶抑制劑有 Kunitz型（KSTI）和Bowman－Birk型（BBI）兩種。大豆在發(fā)芽過(guò)程中，由于蛋白酶水解作用，KSTI和BBI兩種胰蛋白酶抑制劑含量均有所下降［8］。其中，KSTI型較容易失活，pH 7的體系中，100 ℃加熱1min即可將其滅活到10%以下，而較難滅活的BBI型，100℃加熱360min仍可存活80%左右［9］。

目前中國(guó)對(duì)胚芽豆?jié){的煮漿工藝研究較少，且市面上尚無(wú)針對(duì)發(fā)芽大豆為原料制作胚芽豆?jié){的豆?jié){機(jī)程序。本試驗(yàn)利用九陽(yáng)工裝機(jī)平臺(tái)（經(jīng)改裝后可調(diào)整豆?jié){機(jī)制漿工藝的豆?jié){機(jī)），擬研究不同制漿工藝條件下游離氨基酸、γ－氨基丁酸、胰蛋白酶抑制劑的變化，從而優(yōu)化出最佳胚芽豆?jié){程序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)胚芽豆?jié){和干豆豆?jié){上述考察指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，以期為豆?jié){機(jī)新程序開(kāi)發(fā)和胚芽豆?jié){加工工藝提供一定參考，也為普通家庭用戶提供更為豐富的食譜選擇。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆：品種中黃57，收獲于2012年秋；

N－苯甲酰－DL－精氨酸－對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA）：純度98%，美國(guó)Sigma－Aldrich公司；

胰蛋白酶：酶活≥10 000BAEE U/mg，美國(guó) Sigma－Aldrich公司；

氯化鈣、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、乙酸、二甲基亞砜、三氯乙酸等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

豆?jié){機(jī)：D58SG型，杭州九陽(yáng)小家電有限公司；

豆?jié){機(jī)工裝平臺(tái)：D58SG型，杭州九陽(yáng)小家電有限公司；

豆芽機(jī)：DYJ－S6365型，廣東小熊電器有限公司；

數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：HH－2型，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；

分析天平：MA110型，上海第二天平儀器廠；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：722型，尤尼柯上海儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Ag1100型，美國(guó)安捷倫公司；

冷凍離心機(jī)：Allegra25R型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 不同豆?jié){的制作工藝

（1）胚芽豆?jié){：稱取85g無(wú)蟲(chóng)害、健康、顆粒飽滿的大豆，清水沖洗去除表面雜質(zhì)和灰塵，然后用去離子水沖洗。于3倍體積水中浸泡6h，后于豆芽機(jī)（24±3℃）中發(fā)芽16h后取出。加水至1 100g，于D58SG豆?jié){機(jī)或工裝機(jī)平臺(tái)中制作豆?jié){，過(guò)30目濾網(wǎng)后取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

（2）干豆豆?jié){：將85g大豆清洗后，加水至1 100g，用D58SG程序直接制作豆?jié){，完成后過(guò)30目濾網(wǎng)并取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 胚芽豆?jié){制作的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）粉碎溫度：在豆?jié){機(jī)程序基礎(chǔ)上，調(diào)整粉碎溫度分別為50，60，70，80，90℃，其他參數(shù)保持不變，在工裝平臺(tái)上運(yùn)行新程序，豆?jié){制作完成后過(guò)濾取樣，測(cè)定γ－氨基丁酸、胰蛋白酶抑制劑、游離氨基酸。

（2）煮漿時(shí)間：在豆?jié){機(jī)程序基礎(chǔ)上，調(diào)整煮漿時(shí)間分別為2，3，4，6，8min，其他參數(shù)保持不變，在工裝平臺(tái)上運(yùn)行新程序，豆?jié){制作完成后過(guò)濾取樣，測(cè)定γ－氨基丁酸、胰蛋白酶抑制劑、游離氨基酸。

1.5 γ－氨基丁酸及游離氨基酸含量的測(cè)定

（1）γ－氨基丁酸（GABA）及游離氨基酸的提?。悍Q取10 g左右豆?jié){加入10mL的10%三氯乙酸，用5%三氯乙酸定容至25mL；超聲提取30min；后用雙層濾紙過(guò)濾，將濾液以10 000r/min離心10min，取上清液用于測(cè)定。

（2）測(cè)定方法：鄰苯二甲醛—氯甲酸芴甲酯（OPA—FMOC）柱前衍生化。色譜柱：ODS HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相A相：稱取8.0g結(jié)晶乙酸鈉于燒杯中，加1 000mL水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶水溶解，再加入225mL三乙胺，攪拌并滴加5%的醋酸，將pH調(diào)到7.20±0.05，加入5mL四氫呋喃，混合后備用；流動(dòng)相B相：稱取8.0g結(jié)晶乙酸鈉于燒杯中，加入400mL水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解，滴加5% 醋酸將pH調(diào)到7.20±0.05，將此溶液加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合后備用；紫外檢測(cè)器：發(fā)射波長(zhǎng)338nm，激發(fā)波長(zhǎng)262nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 高效液相分析γ－氨基丁酸所用梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for HPLC analysis ofγ－aminobutyric acid

1.6 胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定

參考王韌［10］報(bào)道的方法并作微調(diào)，具體如下：

（1）試劑配制：① 酶液的配制：0.02mg/mL胰蛋白酶液，稱取4mg胰蛋白酶，溶解于0.001mol/L鹽酸中，定容至200mL，4℃保存?zhèn)溆?；?底物溶液的配制：40mg BAPNA溶于1mL二甲基亞砜中，用37℃的Tris—HCl緩沖液（pH 8.2）稀釋至100mL；③30%乙酸溶液：量取30mL乙酸加水至100mL。

（2）胰蛋白酶抑制劑的提?。捍?jié){冷卻后于6 000r/min冷凍離心25min，取5mL上清液，加45mL 0.01mol/L NaOH，磁力攪拌2h，稀釋后用于測(cè)定。

（3）酶活測(cè)定：① 標(biāo)準(zhǔn)管（Ar）：5mL底物與2mL水混合后于37℃保溫10min，之后加2mL胰蛋白酶溶液繼續(xù)于37℃保溫10min，最終用1mL 30%乙酸中止反應(yīng)；② 標(biāo)準(zhǔn)空白管（Abr）：5mL底物與2mL水及1mL 30%乙酸混勻后，于37℃保溫10min，之后加2mL胰蛋白酶溶液，繼續(xù)于37℃保溫10min；③ 樣品管（As）：5mL底物與2mL豆?jié){稀釋液混勻，于37℃保溫10min，之后加入2mL胰蛋白酶溶液37℃保溫10min，用1mL 30%乙酸中止反應(yīng)；④ 樣品空白管（Abs）：5mL底物與2mL豆?jié){稀釋液及1mL 30%乙酸混勻，于37℃保溫10min，之后加入2mL胰蛋白酶溶液，繼續(xù)于37℃保溫10min；⑤ 反應(yīng)后將標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、樣品管、樣品空白管中溶液過(guò)濾后，在410nm下比色。調(diào)整胰蛋白酶濃度使標(biāo)準(zhǔn)管與標(biāo)準(zhǔn)空白管之間的吸光值之差在0.38～0.42。調(diào)整豆?jié){稀釋倍數(shù)，使樣品管和樣品空白管吸光值之差在0.19～0.21。

活性的表示：定義每10mL反應(yīng)體系在波長(zhǎng)410nm處所減少的0.01吸光度值為1個(gè)胰蛋白酶抑制劑活性單位（TIU）。則胰蛋白酶抑制劑的活性計(jì)算如下：

式中：

TIU——胰蛋白酶抑制劑活性單位；

c——豆?jié){稀釋倍數(shù)；

Ar——標(biāo)準(zhǔn)管吸光值；

Abr——標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光值；

As——樣品管吸光值；

Abs——樣品空白管吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析（ANOVO）程序進(jìn)行分析。用LSD檢驗(yàn)判別數(shù)據(jù)之間的差異性，顯著差異水平P＜0.05。重復(fù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 粉碎溫度和煮漿時(shí)間對(duì)豆?jié){中γ－氨基丁酸的影響

不同粉碎溫度對(duì)豆?jié){中γ－氨基丁酸含量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，在50℃粉碎時(shí)，由于低溫煮漿糊底，可能損失了部分GABA；而90℃粉碎時(shí)，由于豆?jié){體系在90℃以上高溫維持了較長(zhǎng)時(shí)間，可能由于美拉德反應(yīng)造成了GABA損失［11］；因此，在60～80℃對(duì)大豆進(jìn)行粉碎得到了較高含量的GABA胚芽豆?jié){。很多研究［12－14］表明，豆谷類在浸泡和發(fā)芽過(guò)程中，GABA含量有所提升，這主要是由于大豆在發(fā)芽過(guò)程中內(nèi)源酶被激活，L－谷氨酸在谷氨酸脫羧（GAD）的作用下產(chǎn)生GABA［15］。GABA在酸性條件下對(duì)熱敏感，中性條件下耐熱性較好，pH 7條件下，100℃加熱15min仍有較好的穩(wěn)定性［16］。

圖1 粉碎溫度對(duì)胚芽豆?jié){中GABA含量的影響Figure 1 Effect of pulverizing time on GABA content of germinated soybean milk

煮漿時(shí)間對(duì)豆?jié){中γ－氨基丁酸的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，煮漿時(shí)間2～6min對(duì)GABA含量影響不大，煮漿4min時(shí) GABA含量最高，達(dá)1.37mg/100mL；4min之后 GABA含量呈下降趨勢(shì)，加熱8min時(shí)含量?jī)H為1.26mg/100mL。

圖2 煮漿時(shí)間對(duì)胚芽豆?jié){中GABA含量的影響Figure 2 Effect of cooking time on GABA content of germinated soybean milk

2.2 粉碎溫度和煮漿時(shí)間對(duì)豆?jié){中游離氨基酸含量的影響

粉碎溫度對(duì)豆?jié){中游離氨基酸的影響見(jiàn)表2。由表2可知，在胚芽豆?jié){游離氨基酸中，半胱氨酸和蘇氨酸為主要氨基酸，分別占氨基酸總量的25.70%和26.55%。在70℃粉碎時(shí)總游離氨基酸含量最高，高于80℃后總氨基酸含量明顯下降。除色氨酸外，其余7種必需氨基酸在低溫粉碎（50，60，70℃）時(shí)含量較高，80，90℃之后下降較為明顯，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的粉碎溫度會(huì)造成氨基酸的破壞，使其更易于與豆?jié){中的還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。

煮漿時(shí)間對(duì)豆?jié){中游離氨基酸的影響見(jiàn)表3。由表3可知，隨煮漿時(shí)間延長(zhǎng)，氨基酸含量略有增加，煮漿8min，總氨基酸含量最高，達(dá)0.505 5mg/mL；煮漿6min時(shí)，必需氨基酸含量最高，為0.248 5mg/mL。

2.3 粉碎溫度和煮漿時(shí)間對(duì)豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

胰蛋白酶抑制劑為豆?jié){中較難去除的抗?fàn)I養(yǎng)因子，對(duì)豆?jié){的蛋白質(zhì)利用率有較大影響。豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑殘留率降至10%～15%以下時(shí)可使豆?jié){中的蛋白得到最大利用［17］。

粉碎溫度對(duì)豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑含量的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，粉碎溫度越高，豆?jié){中胰蛋白抑制劑含量越低。70℃及以上溫度粉碎，豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑含量明顯減少，這主要由于高溫粉碎使豆?jié){處于高溫狀態(tài)的時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)胰蛋白酶抑制劑的滅活程度較高。高溫粉碎類似于對(duì)豆種的熱燙，使胰蛋白抑制劑在豆種細(xì)粉碎前得到了一定滅活［18］，也減少了胰蛋白抑制劑后續(xù)煮漿階段向漿液中的溶解。因此，高粉碎溫度有利于減少豆?jié){中胰蛋白抑制劑的含量。

表2 粉碎溫度對(duì)胚芽豆?jié){中游離氨基酸含量的影響Table 2 Effect of pulverizing temperature on free amino acid content of germinated soybean milk

煮漿時(shí)間對(duì)豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，煮漿時(shí)間越長(zhǎng)，胰蛋白酶抑制劑含量越低。煮漿2～4min條件下，隨煮漿時(shí)間延長(zhǎng)，胰蛋白酶抑制劑活性降低較明顯，煮漿4～8min條件下變化較為平穩(wěn)，主要由于較易滅活的KSTI部分已滅活，而繼續(xù)的短時(shí)加熱對(duì)BBI部分影響不大。

在粉碎溫度方面，60～80℃時(shí)粉碎可得到GABA含量較高的胚芽豆?jié){，但70～90℃時(shí)粉碎對(duì)胰蛋白抑制劑有較好的滅活作用，且70℃時(shí)胚芽豆?jié){有較高的氨基酸含量，在風(fēng)味和豆?jié){機(jī)適用上均有一定優(yōu)勢(shì)，因此選擇70℃作為最佳粉碎溫度。在煮漿時(shí)間上，煮漿4min時(shí)GABA含量最高，且4min后胰蛋白抑制劑無(wú)明顯下降，故選擇4min為最佳煮漿時(shí)間。

2.4 胚芽豆?jié){與干豆豆?jié){相關(guān)指標(biāo)的對(duì)比

采用上述程序所制得的胚芽豆?jié){中GABA含量為（1.37±0.20）mg/100mL，為干豆豆?jié){（0.37mg/100g±0.09 mg/100mL）的3.68倍。大豆在浸泡發(fā)芽過(guò)程中，種子吸脹，酶活性增加，L－谷氨酸在谷氨酸脫酸酶的作用下生成GABA。尤其在浸泡和發(fā)芽初期，GABA急劇增加［19］。此外，豆種在浸泡發(fā)芽過(guò)程中的質(zhì)構(gòu)變化，使其更容易破碎，更有利于各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向漿液中的溶出。

表3 煮漿時(shí)間對(duì)胚芽豆?jié){中游離氨基酸含量的影響Table 3 Effect of cooking time on free amino acid content of germinated soybean milk

圖3 粉碎溫度對(duì)胚芽豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑含量的影響Figure 3 Effect of pulverizing time on TIA content of germinated soybean milk

胚芽豆?jié){和干豆豆?jié){中游離氨基酸含量見(jiàn)表4。由表4可知，胚芽豆?jié){在總游離氨基酸和必需氨基酸方面均有明顯提高，分別為干豆豆?jié){的1.34倍和8.87倍。必需氨基酸中，蘇氨酸和蛋氨酸含量明顯提高，分別為干豆豆?jié){的31倍和21倍，纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸也有不同程度的提升。

圖4 煮漿時(shí)間對(duì)胚芽豆?jié){中胰蛋白酶抑制劑含量的影響Figure 4 Effect of cooking time on TIA content of germinated soybean milk

表4 胚芽豆?jié){和干豆豆?jié){中游離氨基酸含量對(duì)比Table 4 Free amino acid content of germinated soy milk and unsoaked soy milk

胚芽豆?jié){胰蛋白酶抑制劑活力為（938.00±28.28）TIU，相比于干豆豆?jié){的酶活（737.75±95.80）TIU略高。盡管在發(fā)芽過(guò)程中使胰蛋白酶抑制劑含量有所下降，但其質(zhì)構(gòu)在發(fā)芽過(guò)程中變軟，更有利于蛋白質(zhì)的溶出，因此也更易于胰蛋白酶抑制劑向豆?jié){中溶出。

3 結(jié)論

大豆在浸水發(fā)芽過(guò)程中，質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化，理化性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子均有一定改變。以氨基酸、GABA、胰蛋白酶抑制劑為優(yōu)化目標(biāo)，得到的胚芽豆?jié){最佳制漿工藝為：粉碎溫度70℃，煮漿時(shí)間4min。與干豆豆?jié){相比，胚芽豆?jié){在胰蛋白酶抑制劑含量上略高，這可能是由于發(fā)芽導(dǎo)致豆種質(zhì)構(gòu)變得松軟，易于粉碎，利于胰蛋白酶抑制劑溶出。但是，胚芽豆?jié){的氨基酸含量和GABA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于干豆豆?jié){。此外，胚芽豆?jié){在異黃酮、植酸、總酚方面也有較大優(yōu)勢(shì)［20］。因此，胚芽豆?jié){仍有較大的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用空間。

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