吳 帥 雷 聲楊錫洪 高 倩程東偉 張 玲 趙 蔚 張?zhí)鞐澖馊f翠
(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東 湛江 524088;2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,云南 昆明 650231)
指紋技術(shù),起源于生物識別技術(shù)(20世紀(jì)90年代初出現(xiàn),如指紋識別、面部識別、聲紋識別及虹膜識別等方式[1]),并逐漸發(fā)展成為“指紋圖譜的化學(xué)模式識別分析技術(shù)”,其核心方法是先通過物質(zhì)分解(酶解)或者反應(yīng)擴(kuò)增(如PCR擴(kuò)增),然后采取一些分離手段(電泳、層析等)實現(xiàn)特征性物質(zhì)的分離,最終獲得特征性(指紋)圖譜的一個過程。近些年,隨著各種先進(jìn)生物技術(shù)的不斷發(fā)掘,使得指紋技術(shù)在食品領(lǐng)域(如微生物分離鑒定[2]、貨架期預(yù)測[3]等)的應(yīng)用也越來越全面,為解決和預(yù)防食品造假、摻雜、食物中毒等食品安全問題提供了新的途徑。因此,能夠?qū)⒅讣y分析技術(shù)(圖1)合理的應(yīng)用于食品領(lǐng)域?qū)龠M(jìn)食品行業(yè)的完善[4]。
圖1 常見指紋圖譜技術(shù)Figure 1 Common fingerprint technologies
在食品領(lǐng)域,指紋圖譜分析技術(shù)還處于初期階段,如果能進(jìn)一步探索并更好地應(yīng)用于食品生產(chǎn)和流通中,將大大促進(jìn)食品產(chǎn)業(yè)的規(guī)范化和安全性,并加快傳統(tǒng)及新型食品的開發(fā)。
DNA指紋分析技術(shù)簡稱DNA指紋或遺傳指紋技術(shù),通過分子標(biāo)記,對生物個體間DNA序列差異的檢測。包括物種特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragmentlength polymorphism,AFLP)、微衛(wèi)星 DNA(simple sequence repeat,SSR)、簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat,ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly-morphism,SNP)等 DNA指紋技術(shù)[5]。
徐朝輝等[6]利用RAPD技術(shù)得到了中藥生品牛蒡子(四大商品區(qū))以及制品牛蒡子(其中兩個商品區(qū))的DNA指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)生品牛蒡子圖譜具有一致性,而制品牛蒡子的圖譜與生品之間存在明顯區(qū)別,表明了DNA指紋圖譜在生品藥材方面應(yīng)用的可靠性;陳穎等[7]建立了還原橙汁、摻假橙汁和鮮榨橙汁的PCR快速鑒別方法,有效識別摻假產(chǎn)品;阮泓越等[8]采用微衛(wèi)星DNA對豬的個體識別和溯源進(jìn)行探索,指出來自同一頭豬的豬肉和血液DNA是一一對應(yīng)的,這就表明可以實現(xiàn)從豬血到豬肉的溯源。DNA指紋技術(shù)具有諸多優(yōu)點,如不受環(huán)境影響,可以在樣品發(fā)育的任何階段進(jìn)行檢測,可進(jìn)行大量標(biāo)記,對于表現(xiàn)出共性的基因型可以鑒別出其是純合型還是雜合型,技術(shù)操作簡單、迅速、便于實現(xiàn)自動化,還有就是提取的DNA樣品可以實現(xiàn)長期保存(條件適宜),有利于追溯性或仲裁性的實施[5]。
代謝指紋分析技術(shù)是對代謝組學(xué)的研究,是將某個細(xì)胞、組織或器官的代謝物作為集合,然后進(jìn)行整體分析,對比圖譜信息異同,進(jìn)而實現(xiàn)樣品的鑒別或者分類。
按照分析流程,將代謝指紋分析過程分為生物分析和數(shù)據(jù)分析。生物分析就是從樣品中獲得大量原始數(shù)據(jù)(圖譜)的過程,該過程可能用到的分析技術(shù)有核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance,NMR)、LC—MS以及 GC—MS等;數(shù)據(jù)分析就是通過對原始數(shù)據(jù)(圖譜)的篩選后,比對圖譜差異,采用PCR或者偏最小二乘法—判別分析(PLS—DA)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)的變化規(guī)律,進(jìn)而體現(xiàn)代謝的整體過程(圖2)[9]。
圖2 代謝指紋分析流程圖Figure 2 The flow chart of metabolic fingerprinting
吳海強(qiáng)等[10]通過對比鯽魚(Carassius aumtus)和鰱魚(Hypophthalmichehys molitrix)兩種魚的雙向蛋白質(zhì)電泳圖(two-dimensional electrophoresis,2-DE)發(fā)現(xiàn),2-DE譜圖完全可以鑒定和區(qū)別不同物種的蛋白組分,可作為進(jìn)一步鑒定過敏原的基礎(chǔ);周劍忠等[11]通過PCR—DGGE指紋圖譜技術(shù)結(jié)合16SrDNA序列分析了藏靈菇中微生物的多樣性,發(fā)現(xiàn)藏靈菇中乳酸菌(Lactobacillus)和酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)居多,此外還存在不可培養(yǎng)微生物。
Gall等[12]利用NMR指紋圖譜和多元分析法來辨別橘汁的摻假,針對其中6個主成分的分析構(gòu)建了有效的分類模型,可識別人工和天然橘子汁。Chen等[13]通過常壓解吸抽樣偶聯(lián)電離子噴霧技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù),檢測了不同樣品中的代謝物(來自微生物生長或樣品自身代謝),發(fā)現(xiàn)不同保藏方式的肉類和菠菜的指紋圖譜存在明顯的差異,指出肉類制品在-20℃下也可被大腸桿菌污染,同時指出了這種基于代謝物的新型檢測策略代表了一種“綠色”食品質(zhì)量快速評價的方法。
代謝指紋分析可廣泛應(yīng)用于食品的保藏、加工方式以及微生物利弊的鑒定,在食品工藝優(yōu)化、降低生成成本、保證產(chǎn)品的一致性等方面具有潛在的應(yīng)用前景。
研究[14]發(fā)現(xiàn)同位素的組成變化是極復(fù)雜的,特別受氣候及地形、生物代謝類型等影響顯著。目前用于食品溯源追蹤的可標(biāo)記同位素主要有H、C、N、O等。劉衛(wèi)霞等[15]介紹了有機(jī)同位素稀釋質(zhì)譜法在于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、抗生素、天然毒素等方面的應(yīng)用,明確了同位素稀釋色譜—質(zhì)譜技術(shù)于食品安全的重要性。劉澤鑫等[16]采用同位素比率質(zhì)譜儀(IRMS)檢測了牛尾毛樣品(陜西關(guān)中不同區(qū)縣)的δ13C和δ15N值,發(fā)現(xiàn)利用同位素之間的差異可實現(xiàn)牛肉產(chǎn)地小范圍的溯源。Schmidt等[17]通過穩(wěn)定性同位素C、N、S,分析了美國的23個牛肉樣品和歐洲的35個牛肉樣品,表明2個地區(qū)的牛肉的δ13C特征明顯不同,可以對牛肉進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。生物體中某些同位素信息與生物的生存環(huán)境息息相關(guān),通過這一獨特的特征就可以對生物的身份信息進(jìn)行獨立、科學(xué)的鑒定[18]。
氣味指紋分析技術(shù)是以揮發(fā)性成分為監(jiān)測對象,檢測技術(shù)是最關(guān)鍵的,如GC—MS、氣相色譜—嗅覺測定法(gas chromatograph-olfactometry,GC—O)、電子鼻(electronic nose)等技術(shù)。氣味指紋圖譜分析技術(shù)廣泛用于風(fēng)味物質(zhì)類別和結(jié)構(gòu)的分析,通過建立氣味和品質(zhì)間的對應(yīng)關(guān)系,從而實現(xiàn)對食品品質(zhì)的預(yù)測。
Olfa Baccouri等[19]采用 HS—SPME—GC—MS和 GC,對不同產(chǎn)地、不同生長期和農(nóng)藝條件處理下的橄欖油進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)成熟過程能夠顯著改變揮發(fā)性成分的種類,反映橄欖油的品質(zhì)。Limbo等[20]通過化學(xué)法和電子鼻氣味識別技術(shù)對不同儲藏溫度(-0.5,4.8,16.5℃)下的鱸魚(Lateolabrax japonicus)貨架期進(jìn)行了評價,表明氣味感官技術(shù)對鱸魚貨架期預(yù)測具有可行性。Sarnoski等[21]利用SPME—GC—MS對作為青蟹(Scylla serrata)腐敗標(biāo)志的揮發(fā)性成分三甲胺和吲哚進(jìn)行了分析,用于水產(chǎn)品的品質(zhì)預(yù)測。電子鼻技術(shù)就是憑借電化學(xué)傳感器陣列及合適的識別裝置,實現(xiàn)通過儀器“嗅覺”客觀分析樣品的一種技術(shù),目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于果蔬無損檢測、肉禽水產(chǎn)類新鮮度及微生物檢測等方面[22-24]。
光譜指紋分析技術(shù)的運行原理就是通過那些對光具有吸收、散射、反射等特性的物質(zhì)對食品進(jìn)行監(jiān)控,包括品質(zhì)監(jiān)控和安全監(jiān)控,是一種間接測量的技術(shù)(也稱為軟測量技術(shù))。光譜指紋技術(shù)以速度快、可實現(xiàn)多組分同時測量以及樣品不需要復(fù)雜的前處理過程等優(yōu)點,非常適合于實時在線分析和非侵入、非破壞性檢測。
林巖等[25]采用近紅外光譜(near infrared,NIR)和聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘方法(SiPLS)的方法,通過對比光譜數(shù)據(jù),指出該結(jié)合技術(shù)可對豬肉蛋白質(zhì)及脂肪進(jìn)行定量分析。楊永存等[26]通過采集137份油樣和17份精煉“地溝油”,對比傅立葉變換中紅外吸收光譜,指出根據(jù)吸收峰及其形狀還不能有效鑒別“地溝油”與食用植物油,因而還有待進(jìn)一步的探索。Quansheng Chen等[27]在食醋總酸含量測定研究中指出近紅外光譜技術(shù)協(xié)同Si-PLS和曲線回歸工具可作為食醋總酸含量測定的潛在方法;Del Bove等[28]采用FI—IR結(jié)合軟件分析將意大利的10個地域奶酪中22種酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)進(jìn)行快速鑒別和表型分類。
馬冬紅等[29]采用同位素比率質(zhì)譜儀對廣東、海南、福建、廣西4地羅非魚(Oreochromis spp)中的 δ2H 值進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)不同地域的羅非魚δ2H值存在明顯差異,表明穩(wěn)定性氫同位素可以很好地反應(yīng)羅非魚來源地信息。Zhao等[30]利用近紅外光譜發(fā)現(xiàn)可以有效地對小麥的來源、基因型和生長期進(jìn)行解析。孟一等[31]基于近紅外光譜技術(shù)快速識別不同動物源肉品,建立了豬肉、牛肉和羊肉的定性識別模型。Yan Zhao等[32]指出了穩(wěn)定性同位素是一種強(qiáng)有力的工具,可以很好地鑒別來自動植物的農(nóng)產(chǎn)品及產(chǎn)地,同時也指出了使用該技術(shù)時存在的局限性。Enache等[33]提出了遺傳指紋圖譜技術(shù)可作為動物產(chǎn)品溯源的新方法??梢姡殡S現(xiàn)代指紋技術(shù)的發(fā)展,通過建立食品危害物來源追蹤體系,對食品安全危害源頭實現(xiàn)溯源,逐漸會成為今后研究的熱點。
食品摻假、食品貨架期、食品有毒有害物質(zhì)檢測等,是食品品質(zhì)方面的重要問題。吳衛(wèi)國等[34]建立了5類食用植物油標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)這些圖譜不僅能夠反映同類油脂共同特性,同時也能反映不同類油脂之間的差異,這就為食用植物油脂的產(chǎn)品質(zhì)量控制和摻假檢測提供了理論依據(jù)。解萬翠等[35]利用電子鼻技術(shù)(electronic nose)檢測蝦風(fēng)味料中香氣成分,發(fā)現(xiàn)電子鼻對兩種蝦風(fēng)味料的風(fēng)味輪廓有較強(qiáng)的識別能力。王琴等[36]采用反相高效液相色譜(RP—HPLC)結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD),分別檢測摻入代可可脂和棕櫚油的可可粉摻假樣品,通過脂質(zhì)指紋分析發(fā)現(xiàn)該方法可以鑒別摻入1.2%及以上的摻假樣品。Lin等[37]通過將近紅外光譜、電腦成像和電子鼻技術(shù)連用的方式,對90多種不同新鮮度的豬肉進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)連用技術(shù)可實現(xiàn)對揮發(fā)性鹽基氮的無損檢測。田曉靜[38]應(yīng)用電子鼻電子舌技術(shù)實現(xiàn)了對凍融不同次數(shù)的羊肉的檢測,同時建立了能夠識別豬肉、雞肉等摻入到羊肉中的預(yù)測辨假模型。王秋艷等[39]對比了ERIS—PCR、PFGE和Sau—PCR 3種方法對5株福氏志賀菌進(jìn)行溯源性分析,分別指出了3種方法在這方面應(yīng)用的優(yōu)缺點,且3種方法均能達(dá)到檢測5株菌的目的。Covadonga等[40]采用傳統(tǒng)法和微波加熱對橄欖油進(jìn)行熱降解,通過利用31P的NMR光譜技術(shù),發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)加熱法對油的損傷大于微波加熱。
食品的腐敗劣化,其原因來自很多方面,如酶的分解、營養(yǎng)物質(zhì)的氧化以及微生物的生長活動等,特別是微生物的活動是食品劣變的主要因素。食品指紋分析技術(shù)在微生物的鑒別、菌落動態(tài)監(jiān)控等方面可以發(fā)揮作用。石磊等[41]利用組織平板培養(yǎng)法及ERIC—PCR法定量分析了48株P(guān)A生物被膜的形成,通過指紋圖譜分析指出菌株生物被膜形成能力和基因型二者之間具有一定的相關(guān)性。Zheng等[42]通過結(jié)合DGGE和磷脂脂肪酸來鑒定不同發(fā)酵階段濃香型酒的微生物菌落形態(tài)特征,指出了窖泥中的主要菌體。Nol等[43]指出了PCR—DGGE技術(shù)可以快速監(jiān)測咖啡加工中的微生物,特別是對赭曲霉素(ochratoxin)的形成的研究。Sahar等[44]發(fā)現(xiàn)利用傅立葉變換紅外光譜儀可以預(yù)測貯藏雞胸肉魚片的腐敗菌數(shù)量。
指紋技術(shù)在貨架期預(yù)測方面應(yīng)用仍處試驗階段。氣味作為食品品質(zhì)優(yōu)劣判斷的一項重要指標(biāo),常規(guī)方法就是進(jìn)行感官評價及經(jīng)驗評估,因而會引入極大的不確定性。因此可針對各技術(shù)的優(yōu)劣勢,通過多技術(shù)的相互組合,將指紋技術(shù)作為一個多元的、不設(shè)基點的技術(shù)來篩選關(guān)鍵質(zhì)量的差異,從而進(jìn)行分析判定。未來可將生物技術(shù)與現(xiàn)代檢測手段的食品指紋圖譜分析技術(shù)相結(jié)合,使其在食品從農(nóng)田(養(yǎng)殖場)到餐桌的體系中發(fā)揮作用,實施監(jiān)控,促進(jìn)食品產(chǎn)業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化,推動行業(yè)的快速發(fā)展。
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