章建輝 李 莎 黃 輝 夏立新

(長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南長沙 410013)

香蘭素(3-甲氧基-4羥基苯甲醛，又稱芳草醛)有濃烈的奶香氣息，是重要的香料之一，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥、有機合成及藥用輔料等領(lǐng)域。食用大劑量的香蘭素可導(dǎo)致頭痛、惡心、呼吸困難、損肝傷腎等，危害人體健康。GB 2760—2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，0至6個月嬰幼兒配方食品中不得添加香蘭素，較大嬰兒和幼兒配方食品中可以使用香蘭素，最大使用量為5 mg/100 mL，但標(biāo)準(zhǔn)中并未提供相應(yīng)的檢測方法。目前常用的香蘭素檢測方法有電化學(xué)法［1］、分光光度法［2］、高效液相色譜法［3，4］、高效液相色譜/質(zhì)譜法［5，6］、氣相色譜法［7］和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法［8，9］。電化學(xué)法和分光光度法分析成本低，但操作繁瑣，靈敏度差;高效液相色譜法和氣相色譜法因簡單、快速等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用，但易出現(xiàn)假陽性;高效液相色譜/質(zhì)譜法因需要使用固相萃取柱對樣品進行凈化，樣品處理成本高;氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法有機溶劑消耗量大，易污染環(huán)境。

液液微萃取—懸浮溶劑固化法(solidification of floating organic drop liquid phase microextraction，LPME—SFO)是Zanjani等［10］于2007年提出來的一種新型萃取技術(shù)。該法選用凝固點較低且密度小于水的溶劑為萃取劑，萃取后低溫冷卻，萃取劑凝結(jié)成固體懸浮于水相表面，取出固化的萃取劑與水相分離，待萃取劑溶化后進樣分析。該方法選擇的萃取劑毒性小，萃取劑固化后易取出，在簡單基質(zhì)中對目標(biāo)物進行分離富集方面具有很好的優(yōu)勢，并得到應(yīng)用［11－14］。LPME—SFO需要的微量有機溶劑在冷凍或低溫條件下能夠凝固，有機溶劑選擇性小，限制了該法的應(yīng)用。石慧等［15］對LPME—SFO進行改進，選擇酸性水溶液為固化劑來分離減肥茶中的西布曲明，并取得很好的試驗效果。目前涉及香蘭素檢測的方法中接受相固化—反萃取技術(shù)尚未見報道，本研究擬在前人研究基礎(chǔ)上提出一種液液萃取—接受相固化—反萃取新方法，該方法利用萃取劑對目標(biāo)物萃取后，選擇堿性水溶液為接受相，低溫下將水相固化后去除有機相，室溫溶解后用有機相再進行反萃取。本研究旨在為奶粉中香蘭素的測定提供新方法，為食品安全的監(jiān)測、預(yù)警及控制提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚:色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸鈉:分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

無水硫酸鈉:優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，瑞士Fluka公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀:Agilent 7890A/5975C型，美國Agilent公司;

氮吹儀:OA-SYS型，美國Organomation公司;

漩渦混合器:SK-1型，金壇市醫(yī)療儀器廠;

高速離心機:CT 14D型，上海天美科學(xué)儀器有限公司;

電子天平:AL204型，梅特勒—托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲備液 稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容至刻度線，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃保存?zhèn)溆?/p>

1.3.2 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)工作液 準(zhǔn)確吸取1.0 mg/mL的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用二氯甲烷逐級稀釋配成0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 樣品處理 取0.5 g(精確至0.000 1 g)樣品于離心管中，加1.0 mL蒸餾水(鹽酸調(diào)節(jié)蒸餾水pH為4.0～6.0)溶解奶粉后，加乙醚渦旋提取2 min，加適量無水硫酸鈉后，9 000 r/min離心5 min。乙醚7 mL(3，2，2 mL)提取 3 次，合并提取上清液至10 mL尖底離心管中。取0.01 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL加入到提取液中，渦旋2 min，5 000 r/min離心3 min。－20℃下冰凍10 min。待水相固化后，低溫下迅速移除上層有機相，室溫下將水相溶解。水相中加入0.5 mol/L鹽酸20 μL，混勻后加入二氯甲烷1.00 mL，渦旋提取2 min后，5 000 r/min離心3 min，取下層溶液進樣分析。

1.3.4 香蘭素提取與凈化單因素條件

(1)萃取方法和萃取劑的選擇:選取相同濃度加標(biāo)樣品，使用4種不同萃取劑(乙醚、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷)對奶粉中香蘭素進行提取。試驗選用樣品加萃取劑直接渦旋提取(干提取)和溶解后再加萃取劑渦旋提取(濕提取)兩種方式，計算萃取率。

(2)接受相pH值對萃取率的影響:取5份相同濃度加標(biāo)奶粉樣品，分別使用 pH 為 8.0，9.0，10.0，10.7，11.0，11.7，12.0的氫氧化鈉溶液200 μL對加標(biāo)樣品進行萃取，計算萃取率。

(3)接受相體積對萃取率的影響:取5份相同濃度加標(biāo)奶粉樣品，乙醚提取后，考察了0.01 mol/L氫氧化鈉溶液不同體積下的萃取效果，體積分別選擇為50，80，100，120，150 μL，計算萃取率。

(4)反萃取劑的選擇:試驗選取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，考察了不同反萃取溶劑(乙醚，乙醇，二氯甲烷，三氯甲烷)對香蘭素響應(yīng)的影響。

1.3.5 色譜和質(zhì)譜條件

(1)氣相色譜條件:VF-wax MS毛細管柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);載氣:He(＞ 99.999%);柱溫流量:1 mL/min;進樣口溫度:250℃;分流比1∶10;進樣量1 μL;柱升溫程序:初始溫度80℃，保持1 min，以20℃/min速率升溫至180℃，保持4 min，再以10℃/min升溫至260℃，保持1 min。

(2)質(zhì)譜條件:EI離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃;碰撞能量70 eV;傳輸線溫度280℃;質(zhì)譜接口溫度230℃;溶劑延遲5 min;選擇離子檢測(SIM)模式的主要離子的m/z 151，152，81，109。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取方法和萃取劑的選擇

由圖1可知:樣品直接提取時，4種萃取劑回收率偏低;樣品溶解后再提取時，4種萃取劑回收率高。因此選用樣品溶解后再提取的方法對樣品進行提取。

圖1 萃取劑及方法對奶粉中香蘭素提取率的影響Figure 1 Effect on the extraction rate of vanillin from powdered milk by different extraction solvents and methods

采用樣品溶解方法提取香蘭素時，乙醇與水互溶，萃取后難以除水，氮吹濃縮時需加入堿防止目標(biāo)物揮發(fā)，操作繁瑣;二氯甲烷和三氯甲烷密度比水大，離心后樣品上浮，也不易操作。乙醚提取效果好，且操作方便。因此選擇乙醚為萃取劑。

2.2 凈化條件的選擇

2.2.1 接受相pH值對萃取率的影響 香蘭素結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，在堿性條件下以離子形式存在，酸性條件下以分子形式存在。在堿性條件下，易將香蘭素從有機相中提取出來。試驗以氫氧化鈉溶液為接受相，比較不同pH值對萃取率的影響。由圖2可知:隨著pH值的增大，萃取率升高;當(dāng)pH值大于11.0后，萃取率大于96%。為滿足對高濃度目標(biāo)物萃取，最終選擇pH=12.0的氫氧化鈉溶液為接受相。

圖2 接受相pH值對提取率的影響Figure 2 Effect on the extraction rate of vanillinin different pH value

2.2.2 接受相體積對萃取率的影響 由圖3可知:反萃取率先隨反萃取劑體積增加而增加;當(dāng)氫氧化鈉溶液用量為100 μL時，萃取率為98.1%;當(dāng)氫氧化鈉溶液體積大于100 μL時，反萃取率變化不大。氫氧化鈉溶液用量增大，固化時間將延長。因此選定氫氧化鈉的用量為100 μL。

2.2.3 反萃取劑的選擇 氫氧化鈉溶液為接受相進行反萃取時，香蘭素以鹽的形式被提取出來，大部分干擾物存在于有機相中，樣品得以凈化。接受相體積很小，液態(tài)下難以將兩相完全分離。本試驗采用接受相固化的方式去除有機相。在－20℃下冰凍10 min，水相成為固化態(tài)，然后低溫下迅速去除有機相。室溫溶解后，用20 μL 0.5 mol/L鹽酸將溶液酸化，香蘭素以分子形式存在接受相中。

圖3 接受相體積對萃取率的影響Figure 3 Effect on the extraction rate of vanillin in different volume

試驗分析了乙醚、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等溶劑對香蘭素響應(yīng)的影響。乙醚對香蘭素響應(yīng)不穩(wěn)定，并且會造成香蘭素?zé)o響應(yīng)，原因可能是在氣相進樣口高溫條件下，乙醚與香蘭素反應(yīng)產(chǎn)生了聚合物。乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷對香蘭素響應(yīng)值大并且穩(wěn)定，但乙醇與水互溶，萃取后難以分離，三氯甲烷毒性比二氯甲烷大。本試驗最終選擇二氯甲烷為反萃取溶劑。

2.3 分析條件的確定

2.3.1 色譜條件確定 在1.3.5氣相色譜分離條件下，首先通過GC—MS的全掃描方式(m/z 50～200)得到總離子流色譜圖(TIC)(見圖4)，然后根據(jù)TIC譜圖來選擇相對豐度較高和質(zhì)荷比(m/z)較大離子進行分析。

圖4 香蘭素的質(zhì)譜圖Figure 4 Mass spectrum of vanillin by GC/MS

2.3.2 儀器定性定量方式 利用質(zhì)譜對目標(biāo)物進行準(zhǔn)確定性，需要了解EI—MS譜圖中碎片離子的歸屬，故對其特征碎片離子的可能碎裂機理進行初步解析(見圖5)。選擇 m/z 151為定性離子，m/z 152，81，109為定量離子。

2.4 工作曲線，檢出限，方法回收率、精密度

圖5 香蘭素的EI—MS碎片離子結(jié)構(gòu)Figure 5 The structure of vanillin EI－MS fragments

將香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成 0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL，在本試驗確定的試驗條件下進行測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(A)，得到線性方程 A=32 509.0C －7 716.4，相關(guān)系數(shù)0.999 5。結(jié)果表明在 0.20 ～10.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法檢出限(S/N=3)為 0.004 mg/kg。

選取陰性樣品，香蘭素的加標(biāo)水平為:0.50，1.0，4.0 μg/mL 3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，相關(guān)色譜圖見圖6;每個樣品連續(xù)測定6次，測定精密度和加標(biāo)回收率(見表1)。結(jié)果表明:回收率為82.0% ～98.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.83%。

圖6 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液離子流色譜圖和樣品加標(biāo)離子流譜圖Figure 6 The ion chromatograms of standard of vanillin and spiked sample

表1 精密度和回收率的測定Table 1 Determination of RSD and recovery rate(n=6)

2.5 與其它方法的比較

運用本試驗建立的方法與文獻方法比較可知(見表2):本試驗有機萃取溶劑消耗少，檢出限低，說明本方法具有很強的適用性。

表2 不同測定方法結(jié)果比較Table 2 Comparison results of different methods

3 結(jié)論

目前關(guān)于香蘭素檢測的方法較多，但對其分離凈化的研究報道相對較少。本試驗建立液液萃取—接受相固化—反萃取的新方法與傳統(tǒng)的檢測方法相比，簡化了分離凈化過程、操作簡單、無需濃縮、試劑消耗少、靈敏度高、檢出限低，還減少了檢測的假陽性現(xiàn)象，有望在將來為制定奶粉樣品中香蘭素的國標(biāo)檢測方法提供依據(jù)。

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