王 霞 程 娟 易偉民 趙忠杉 鹿保鑫

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319;2.天津龍威糧油工業(yè)有限公司，天津 300461)

甘二酯(diacylglycerol，DAG)是脂肪代謝過程中的中間產(chǎn)物，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入高含量的甘二酯不僅可以抑制動脈硬化，而且還可以抑制高血壓及肝臟的脂肪堆積［1］，且作為油脂中的天然組分，因其在控制體重的增長與緩解糖尿病人腎臟衰竭等方面的完美生理功能而越發(fā)被人們所關(guān)注［2］。

甘二酯是一種二酯的產(chǎn)物，是經(jīng)甘油的兩個羥基與脂肪酸進(jìn)行酯化而合成的，經(jīng)過動物與人體試驗認(rèn)證后［3］，被認(rèn)定為安全可食用的油脂。另外甘二酯作為一種多功能的食品添加劑［4］在食品行業(yè)中，與其他普通油脂相比，口感風(fēng)味好，同時也便于人體吸收，抑制肥胖［5］;此外，在醫(yī)藥行業(yè)中，甘二酯可以促進(jìn)人體對藥物的吸收［6］;在化工業(yè)中，具有良好的乳化作用及穩(wěn)定作用［7］。

甘二酯雖然可以從食物中獲得，但天然油脂中甘二酯含量相對較低［4］，即使食用了，也達(dá)不到預(yù)防與控制的目的。目前，市售甘二酯類產(chǎn)品較少，且價格高，具有較大的市場潛力，因此規(guī)?；a(chǎn)甘二酯，應(yīng)用前景相當(dāng)可觀。在甘二酯工業(yè)化進(jìn)程中，酶工程已成為研究重點(diǎn)［8］，固定化脂肪酶催化反應(yīng)后還能回收，重復(fù)利用。米糠是大米加工的副產(chǎn)品，每年中國米糠產(chǎn)量超過1 000萬 t，但米糠有效利用率尚不足20%，近年來米糠已成為重要的油料資源之一［9］。米糠油是一種營養(yǎng)豐富的植物油，食后吸收率達(dá)90%以上，就脂肪酸組成而言，飽和脂肪酸占15% ～20%，不飽和脂肪酸占80% ～85%［10］。所以，以米糠油為原料研究酶法制備米糠油甘二酯的制備方法，制取高純度的富含甘二酯產(chǎn)品具有一定的經(jīng)濟(jì)利益與社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硅藻土固定化脂肪酶:酶活為2 206.67 U/g，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實驗室自制;

米糠油:市售食用油;

油酸甘油一酯:上海千為油脂有限公司;

正己烷、異丙醇、三氯甲烷、冰乙酸:分析純，南京化學(xué)試劑有限公司;

異辛烷、丁酮、丙酮:分析純，北京康倍斯科技有限公司;

甘油:分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司;

高效液相色譜儀:Waters FS525型，美國Waters公司;

酸度計:DELTA 320型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

電熱恒溫水浴鍋:DK-S24型，上海森信實驗儀器有限公司;

電子天平:AR2140型，梅特勒—托利多儀器有限公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE52-98型，上海亞榮生化儀器廠;

恒溫水浴振蕩器:SHY-2型，江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠;

精密定時電動攪拌器:JJ-1型，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;

低速大容量離心機(jī):LD4-40型，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘二酯的制備 準(zhǔn)確稱取105 g米糠油于150 mL錐形瓶中，按試驗設(shè)定的反應(yīng)物質(zhì)量比(米糠油與油酸甘油一酯質(zhì)量比)、酶添加量(以米糠油質(zhì)量計算，%)加入油酸甘油一酯和固定化脂肪酶，充分混勻后置于預(yù)先設(shè)定溫度的恒溫水浴振蕩器，在160 r/min條件下反應(yīng)一定時間后取出，取2 mL樣品，10 mL正己烷和異丙醇混合液(9∶1，V∶V)溶解，將溶解后的樣品置于離心機(jī)中，4 000 r/min離心20 min，取上清液于－4℃冰箱中保存待測。

1.2.2 甘油二酯含量測定 采用高效液相色譜分析甘油酯的組成和含量［11］。取溶解后的待測樣10 μL作為進(jìn)樣量，硅膠色譜柱(Waters Spherisorb Silica，5.0 μm，50.00 mm ×4.60 mm)，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，N2壓力為 3.0 × 106Pa，漂移管溫度為75℃的色譜條件。檢測過程中的流動相為:A:正己烷和異丙醇(99∶1，V∶V)，B:正己烷、異丙醇和冰乙酸(1∶1∶0.01，V∶V∶V)的混合液;流速為 1.0 mL/min。洗脫梯度為:0 min，100%A;10 min，80%A;14 min，70%A;15 min，100%A;20 min，100%A。出峰順序依次為甘油三酯(TGA)、游離脂肪酸(FFA)、1，3-甘油二酯(1，3-DAG)、1，2-甘油二酯(1，2-DAG)、1(3)-甘油一酯(1(3)-MG)、2-甘油一酯。采用面積歸一化法對DAG定量，通過DAG的含量按式(1)得出DAG產(chǎn)率［12］。

式中:

R——DAG產(chǎn)率，%;

m1，2-DAG——混合待測樣中 1，2-DAG 質(zhì)量，g;

m1，3-DAG——混合待測樣中 1，3-DAG 質(zhì)量，g;

m米糠油——反應(yīng)物中米糠油的質(zhì)量，g;

m油酸甘油一酯——反應(yīng)物中油酸甘油一酯的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 選擇對DAG產(chǎn)率影響的4個主要因素:反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固定化脂肪酶添加量、反應(yīng)物質(zhì)量比，以產(chǎn)率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗，以此確定各因素最佳范圍值。

(1)反應(yīng)溫度對DAG產(chǎn)率的影響:試驗反應(yīng)溫度分別為 15，18，21，24，27，30，33 ℃，反應(yīng)時間為 12 h，固定化脂肪酶添加量為10%，反應(yīng)物質(zhì)量比值為15，每組試驗重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

(2)反應(yīng)時間對DAG產(chǎn)率的影響:在反應(yīng)溫度設(shè)定為30 ℃，反應(yīng)時間分別為 4，6，8，10，12，14，16，18 h，固定化脂肪酶添加量為10%，反應(yīng)物質(zhì)量比值為15時，每組試驗重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

(3)固定化脂肪酶添加量對DAG產(chǎn)率的影響:反應(yīng)溫度設(shè)定為30℃，反應(yīng)時間為12 h，固定化脂肪酶添加量分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，反應(yīng)物質(zhì)量比值為15，每組試驗重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

(4)反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率的影響:在反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時間為12 h，固定化脂肪酶添加量為10%，反應(yīng)物質(zhì)量比值分別為 5，10，15，20，25，30，35 的條件下，每組試驗重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

1.2.4 米糠油甘二酯制備反應(yīng)條件優(yōu)化試驗 通過單因素試驗確定各因素范圍，以DAG產(chǎn)率為響應(yīng)值，進(jìn)行四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計。采用Design-Expert.V8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并優(yōu)化出最佳的固定化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)溫度對DAG產(chǎn)率的影響 由圖1可知，溫度在18～27℃時DAG產(chǎn)率隨著溫度的上升而明顯增加，但超過27℃后DAG產(chǎn)率有所下降;溫度對甘二酯的產(chǎn)率的影響主要是通過影響酶的活力來實現(xiàn)的，溫度高酶活力高，在單位時間內(nèi)生成的甘油二酯相對較多，溫度過高使酶活力下降，因此在27℃以后DAG產(chǎn)率下降。由此選擇18～30℃的反應(yīng)溫度值為優(yōu)化組合范圍值。

2.1.2 反應(yīng)時間對DAG產(chǎn)率的影響 由圖2可知，在10～14 h內(nèi)DAG產(chǎn)率增加相對較快，在14～18 h內(nèi)DAG產(chǎn)率相對平穩(wěn)，即隨著時間的延長，單位時間內(nèi)生成的DAG增多，反應(yīng)進(jìn)行14 h后，DAG產(chǎn)率達(dá)到了一個相對較穩(wěn)定的水平。隨著反應(yīng)時間的延長，底物的量減少，DAG產(chǎn)率不會繼續(xù)增加，維持在一定的范圍內(nèi)。因此選擇4～16 h為優(yōu)化組合范圍值。

圖1 溫度對DAG產(chǎn)率的影響Figure 1 The influence of temperature on the yield of DAG

圖2 反應(yīng)時間對DAG產(chǎn)率的影響Figure 2 The influence of time on the yield of DAG

2.1.3 固定化脂肪酶添加量對DAG產(chǎn)率的影響 由圖3可知，在底物米糠油質(zhì)量不變的情況下，當(dāng)固定化脂肪酶添加量在2% ～8%范圍內(nèi)增長時DAG產(chǎn)率不斷增多，超過8%后DAG產(chǎn)率有下降趨勢，由于固定化脂肪酶的添加量過多，在脂肪酶的作用下，生產(chǎn)大量的脂肪酸，使整個體系中的酸價升高，影響固定化脂肪酶的活性，所以固定化脂肪酶添加過多會降低DAG產(chǎn)率，選擇4% ～12%固定化脂肪酶添加量為優(yōu)化組合范圍值。

圖3 固定化脂肪酶添加量對DAG產(chǎn)率的影響Figure 3 The influence of the amount of immobilized lipase on the yield of DAG

2.1.4 反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率的影響 由于反應(yīng)過程中固定化脂肪酶首先對米糠油中的甘油三酯酶解，生成甘油二酯和游離脂肪酸，然后游離脂肪酸在和油酸甘油酯結(jié)合生成甘油二酯，米糠油的含量升高時酶解后生成的游離脂肪酸相對較多，所以在5～10(m/m)內(nèi)DAG產(chǎn)率呈上升趨勢較大，當(dāng)米糠油和油酸甘油一酯比例達(dá)到10～15(m/m)時DAG產(chǎn)率上升較緩慢(見圖4)，超過15(m/m)后，過多的米糠油中甘油三酯和固定化的脂肪酶結(jié)合，使DAG產(chǎn)率有減慢的趨勢，為了保證DAG的產(chǎn)率，反應(yīng)物的質(zhì)量比應(yīng)該控制在一定的范圍內(nèi)，由此選擇反應(yīng)物質(zhì)量比5～25為優(yōu)化組合范圍值。

圖4 反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率的影響Figure 4 The influence of ratio of reactant weight on the yield of DAG

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗 試驗因素水平編碼見表1，具體實施方案見表2。

表1 因素水平與編碼Table 1 Codes and levels of factors

對表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行四元二次回歸擬合，得到DAG產(chǎn)率(R)與反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固定化脂肪酶添加量和反應(yīng)物質(zhì)量比值編碼值的二次回歸方程:

該模型的決定系數(shù) R2=0.949 7，校正 R2=0.916 2，說明該模型能解釋91.62%響應(yīng)值的變化，與實際試驗擬合良好，試驗誤差小，說明應(yīng)用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗優(yōu)化反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固定化脂肪酶添加量和反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率影響是可行的［13］。

表2 響應(yīng)面結(jié)構(gòu)矩陣及試驗結(jié)果Table 2 Response surface structure matrix and results of tests

由表3 可知，模型的 F=28.33，對應(yīng)的 P ＜0.000 1，遠(yuǎn)小于0.01，說明所建立的回歸模型極顯著;X1和X2因素一次項、交互項 X1X4和 X1、X2、X3及 X4因素二次項對應(yīng) P＜0.01，對試驗的結(jié)果影響是極顯著的;X4因素的一次項和交互項X2X4、X3X4達(dá)到了顯著水平。失擬項的F=0.092，對應(yīng)的 P=0.999 6，遠(yuǎn)大于0.05，這說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，所建立模型是可行的，可以用此模型對生產(chǎn)DAG的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

2.2.2 響應(yīng)面分析 由表3可知，交互項 X2X4、X3X4對DAG產(chǎn)率交互作用顯著;交互項X1X4對DAG產(chǎn)率交互作用極顯著，采用降維分析法，找出在其它因素條件固定不變情況下，某兩個因素對DAG產(chǎn)率的影響，即反應(yīng)時間與反應(yīng)物質(zhì)量比交互作用、固定化脂肪酶添加量與反應(yīng)物質(zhì)量比交互作用、反應(yīng)溫度與反應(yīng)物質(zhì)量比交互作用對DAG產(chǎn)率的影響。圖5～7是Design-Expert 8.0.6軟件作出的等高線圖及響應(yīng)曲面圖，對這些上述交互項之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析。

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度固定為24℃，固定化脂肪酶添加量為8%，要提高DAG產(chǎn)率米糠油和油酸甘油的質(zhì)量比值應(yīng)控制在9～21，比值過高或過低，DAG產(chǎn)率都降低;米糠油和油酸甘油酯質(zhì)量比一定，增加反應(yīng)時間可以增加DAG產(chǎn)率，僅就DAG產(chǎn)率而言，反應(yīng)時間在7～13 h，米糠油和油酸甘油酯質(zhì)量比在9～21范圍內(nèi)存在顯著增效作用，DAG產(chǎn)率隨著兩因素水平的增加而升高。反應(yīng)時間在交互作用中起了更為重要的作用。

圖5 時間和反應(yīng)物質(zhì)量比值對DAG產(chǎn)率影響的三維曲面和等高線圖Figure 5 Surface and contour plots mutual-influence of time and ratio of reactant weight on the yield of DAG

圖6 酶添加量和反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Figure 6 Surface and contour plots mutual-influence of the amount of immobilized lipase and ratio of reactant weight on the yield of DAG

圖7 溫度和反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Figure 7 Surface and contour plots mutual-influence of temperature and ratio of reactant weight on the yield of DAG

由圖6可知，反應(yīng)溫度固定為24℃，反應(yīng)時間固定為10 h，固定化脂肪酶添加量在6% ～10%，米糠油油酸甘油酯質(zhì)量比在13～25范圍內(nèi)存在顯著增效作用，當(dāng)酶添加量一定時，反應(yīng)物質(zhì)量比在5～13范圍內(nèi)增加可以增加DAG產(chǎn)率;酶添加量在交互作用中起了更為重要的作用。

由圖7可知，反應(yīng)時間固定為10 h，固定化脂肪酶添加量固定為8%時，反應(yīng)溫度在24～30℃，米糠油與油酸甘油酯質(zhì)量比在9.0～18.5范圍內(nèi)DAG產(chǎn)率較高，當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)量比為定值時，升高溫度可以增加DAG產(chǎn)率;反應(yīng)溫度在交互作用中起了更為重要的作用。

為了得到最佳的制備條件值，對二次回歸方程各變量求偏導(dǎo)數(shù)，令其為零后解聯(lián)立方程，解得制備DAG最佳的反應(yīng)條件:反應(yīng)溫度為25.74℃、反應(yīng)時間為10.19 h、固定化脂肪酶添加量為8.67%、米糠油與油酸甘油酯質(zhì)量比為14.36，模型的理論值為60.383 1%。

2.3 驗證實驗

按上述優(yōu)化的試驗條件進(jìn)行驗證性實驗(n=3)，同時也考慮到實際情況，采用反應(yīng)溫度為26℃、反應(yīng)時間為10 h、固定化脂肪酶添加量為8.5%、米糠油與油酸甘油酯質(zhì)量比為14，此時DAG產(chǎn)率為58.31%，驗證實際條件預(yù)測的理論值為60.36%與實際值的相對誤差為3.4%，因此響應(yīng)分析的模型是可靠的［14］。

3 結(jié)論

反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和反應(yīng)物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率影響顯著，因素的主次順序依次為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和米糠油與油酸甘油酯質(zhì)量比、固定化脂肪酶添加量。試驗通過優(yōu)化制備富含甘二酯的米糠油的工藝提高米糠油中的甘二酯，反應(yīng)結(jié)束后，使用固體催化劑易于分離且可以重新利用，比較適合制備中低含量的甘油二酯產(chǎn)品，反應(yīng)原料容易獲得，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。在今后的研究中應(yīng)考慮固定化后的脂肪酶重復(fù)利用次數(shù)對DAG產(chǎn)率影響及pH對固定酶活性的影響。

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