陳曉園 陳福生

不同豆類對叢毛紅曲菌MS-1發(fā)酵產(chǎn)物的影響

陳曉園 陳福生

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

以黃豆、黑豆、豌豆、綠豆和紅豆5種常見食用豆類為基質(zhì)，以高產(chǎn)莫納可林K（monacolin K）且不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS-1為發(fā)酵菌株，進行紅曲菌固態(tài)發(fā)酵，并對紅曲菌MS-1在不同豆類中的發(fā)酵進程、淀粉酶與蛋白酶的酶活、發(fā)酵產(chǎn)物色價、莫納可林K的含量，以及色素組成進行了分析。結(jié)果顯示，豌豆、綠豆、紅豆比黃豆和黑豆更適合紅曲菌的生長，發(fā)酵過程中淀粉酶與蛋白酶的產(chǎn)生、莫納可林K和色素的積累，以及色素組分存在一定差異。其中，豌豆的色價和莫納可林K含量最高，分別達到246.12 U／g（干基）和5.05 mg／g（干基），適合作為高色價和高莫納可林K紅曲的生產(chǎn)基質(zhì)。

食用豆類 紅曲菌 紅曲色素 莫納可林K 桔霉素

紅曲通常是指以紅曲菌，又稱為紅曲霉（Monascus spp.）為菌種，以米飯為培養(yǎng)基質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。作為食品著色劑、防腐劑、發(fā)酵劑與中藥配伍等在中國及東南亞地區(qū)有一千多年的應(yīng)用歷史［1-2］。

現(xiàn)代研究表明，紅曲菌可以產(chǎn)生紅曲色素（Monascus pigment）、降血脂成分莫納可林K（monacolin K）和降血壓成分γ-氨基丁酸等多種有益成分［3］，同時，部分菌株也可能同時分泌腎毒素——桔霉素（citrinin），從而污染紅曲產(chǎn)品［4］。近年來，關(guān)于紅曲產(chǎn)品研發(fā)、桔霉素控制、功能性成分發(fā)掘以及紅曲菌分子生物學(xué)研究等已經(jīng)成為紅曲與紅曲菌的研究熱點［4-5］。

紅曲通常是以早秈稻為原料生產(chǎn)的，早秈稻米飯具有疏松、不粘連、便于操作、通氣性好等優(yōu)點［1］。但早秈稻的組成成分相對比較單一，常常不利于提高紅曲菌次生代謝產(chǎn)物，在米飯中補加一些營養(yǎng)成分，尤其是氮源可以明顯提高紅曲菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。例如，Jirasatid等［6］在米飯培養(yǎng)基中補加NaNO3后，莫納可林K產(chǎn)量較不添加NaNO3提高了3倍，黃色素產(chǎn)量也較對照組提高了1.5倍；前期工作表明，在米粉中添加黃豆粉可顯著提高莫納可林K的產(chǎn)量［4］。尋找除稻米以外的其他原料作為基質(zhì)生產(chǎn)紅曲是提高紅曲菌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的另一思路。例如，以山藥（Dioscorea batatas）替代稻米培養(yǎng)紅曲菌，可提高發(fā)酵產(chǎn)物莫納可林K、黃色素和薯蕷皂苷元的產(chǎn)量，其中莫納可林K和薯蕷皂苷元能有效防止由大鼠雌激素不足誘發(fā)的骨質(zhì)流失［7］。此外，以高粱、米糠、麥麩、玉米和小米等替代稻米作為基質(zhì)，也可以提高紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K的產(chǎn)量［8-9］，但這些基質(zhì)由于蛋白質(zhì)含量較低，常需要額外添加氮源。食用豆類含有豐富的蛋白質(zhì)和淀粉，適合作為紅曲菌發(fā)酵基質(zhì)，然而，目前以豆類為培養(yǎng)基生產(chǎn)紅曲的研究很少，僅有以黃豆和黑豆作為基質(zhì)生產(chǎn)紅曲的報道，其他食用豆類作為紅曲菌發(fā)酵基質(zhì)鮮見報道［10］。

本研究以我國常見的食用豆類，黃豆、黑豆、豌豆、綠豆、紅豆為原料，以實驗室前期獲得1株不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌（M.pilosus）MS-1 為菌種［4］，研究分析了這些豆類對紅曲菌生長、蛋白酶和淀粉酶分泌、莫納可林K產(chǎn)生以及紅曲色價與色素組成成分的影響，以期得到高色價和高莫納可林K紅曲的生產(chǎn)基質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：黃豆（Glycine max）、黑豆（G.max）、綠豆（Vigna radiata）、紅豆（V.umbellata）均產(chǎn)自湖北省襄陽市，豌豆（Pisum sativum）產(chǎn)自內(nèi)蒙古清水河縣，大米（Oryza sativa）產(chǎn)自湖北省武漢市，含水量分別為13.1%、11.5%、12.1%、14.1%、12.8%、12.5%，淀粉質(zhì)量分數(shù)分別為11.50%、8.0%、68.0%、56.3%、68.9%、78.5%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)分別為35.1% 、36.1% 、21.6% 、20.2% 、22.0% 、8.1% 。

菌株：叢毛紅曲菌（M.pilosus）MS-1，本實驗室保藏菌種，高產(chǎn)莫納可林K，不產(chǎn)桔霉素［4］。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，分裝試管，121℃滅菌20 min后，制斜面。用于菌種保藏與活化。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，NH4H2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，分裝至500 mL三角瓶，每瓶100 mL，121 ℃滅菌20 min。

豆類培養(yǎng)基：將豆類浸泡于蒸餾水中，25℃，24 h，去皮，分瓣，將豆瓣裝入250 mL三角瓶中，每瓶50 g，121℃蒸煮20 min，趁熱打散，備用。

1.2 儀器與試劑

Waterse2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；UV-1800型紫外分光光度計：日本Shimadzu公司；乙腈（色譜純）：Fisher公司；莫納可林K（洛伐他?。喊⒗≡噭┯邢薰荆黄溆嘣噭┚鶠榉治黾?。

1.3 方法

1.3.1 紅曲菌種子液制備

叢毛紅曲菌MS-1于PDA斜面活化后，用無菌水洗滌孢子，制成濃度為1.0×106個／mL的孢子懸液，取5 mL接種于種子液培養(yǎng)基中，30℃，120 r／min，培養(yǎng)48 h，備用。

1.3.2 不同豆類紅曲的發(fā)酵進程分析

按10%（V／V）的接種量，將1.3.1制備的種子液接入豆類培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)15 d，每48 h打散搖勻1 次。分別于0、1、2、4、6、8、12、15 d 稱重（WX），減去空三角瓶質(zhì)量（W0），得到不同培養(yǎng)時間下培養(yǎng)基質(zhì)量（W＝WX-W0），重復(fù)3次。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，培養(yǎng)基質(zhì)量W為縱坐標(biāo)，繪制豆類紅曲發(fā)酵進程曲線［11］。觀察發(fā)酵過程中豆瓣外觀和斷面變化，拍照記錄。

1.3.3 淀粉酶與蛋白酶活測定

1.3.3.1 酶液制備

按1.3.2 方法制備豆類紅曲，分別于0、3、6、9、12、15 d，取0.2 g樣品，加入5 mL pH 4.6的醋酸緩沖液研磨成勻漿后，40℃水浴2 h，濾液用于淀粉酶活力測定。同時，于上述培養(yǎng)時間，再分別取1.0 g樣品各2份，分別加入10 mL pH 3.0乳酸鈉緩沖液和pH 7.5的磷酸緩沖液研磨成勻漿后，40℃水浴2 h，濾液分別用于酸性和中性蛋白酶活力測定。

1.3.3.2 酶活的測定

淀粉酶活測定參照徐馳等［12］報道方法。酶活單位（U）：40 ℃，pH 4.6，l min分解可溶性淀粉產(chǎn)生1μg葡萄糖所需酶量。

蛋白酶活測定參照GB／T 23527—2009《蛋白酶制劑》福林法測定蛋白酶活［13］。酶活單位（U）：40℃，pH 3.0或7.5，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需酶量。

1.3.4 色價、色素成分與莫納可林K的測定

1.3.4.1 紅曲提取液的制備

按1.3.2方法，接種培養(yǎng)15 d后，于40℃干燥約48 h至恒重，粉碎，過60目篩，得到豆類紅曲粉。取0.1 g紅曲粉，加入10 mL 70%乙醇，搖勻，60℃水浴2 h，10 000 r／min，離心10 min，上清液用于色價測定；取0.3 g紅曲粉，加入2 mL甲醇，室溫超聲提?。?次，15 min／次），濾液用于色素成分分析；取0.3 g紅曲粉，加入10 mL 75%乙醇，搖勻，室溫下超聲提取1 h后，10 000 r／min離心10 min，上清經(jīng)0.45μm微孔濾膜后，濾液用于莫納可林K含量測定。

1.3.4.2 色價測定

參照GB／T 15961—2005《食品添加劑紅曲紅》［14］中的方法測定色價。

1.3.4.3 色素成分分析

參照文獻［15］報道方法進行色素成分分析。具體過程：將色素提取液點樣于硅膠板，放入層析缸內(nèi)，待展開劑前沿至15 cm處，取出，揮干溶劑，在自然光下觀察。紅色素和黃色素分別使用紅色素展開劑和黃色素展開劑展開；橙色素先用黃色素展開劑展開后，將橙色色素條帶的硅膠刮下，用乙酸乙酯溶解，適當(dāng)濃縮后，再用紅色素展開劑展開。紅色素展開劑：甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（7∶3∶1 V／V／V）；黃色素展開劑：正己烷∶乙酸乙酯∶石油醚（30∶17∶5 V／V／V）。

1.3.4.4 莫納可林K測定

參照GB／T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》［16］的測定方法。色譜條件：色譜柱：Phenomenex Luna 5u C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相∶乙腈∶水∶0.5% 磷酸（60∶37∶3 V／V／V）；檢測器：紫外檢測器，238 nm檢測波長；流速1.0 mL／min；進樣量20μL。以保留時間定性，外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，雙側(cè)t檢驗進行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆類紅曲發(fā)酵進程分析

以黃豆、黑豆、豌豆、綠豆、紅豆為原料，大米為對照，以高產(chǎn)莫納可林K，不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌MS-1［4］為菌種，依照1.3.2方法進行發(fā)酵試驗，分別測定不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)基質(zhì)量。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，培養(yǎng)基質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制得到不同豆類紅曲的發(fā)酵進程曲線（圖1）。

圖1 不同豆類的紅曲發(fā)酵進程曲線

由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基的質(zhì)量逐步減少。其中豌豆培養(yǎng)基質(zhì)量減少最快，黑豆最慢。豌豆、紅豆和綠豆在發(fā)酵前6 d質(zhì)量下降較快，7～15 d下降趨于平緩。黃豆和黑豆在整個發(fā)酵過程中培養(yǎng)基減少均較平緩。圖2是發(fā)酵前與發(fā)酵15 d后的豆瓣照片。

由圖2可知，與發(fā)酵前相比，黃豆和黑豆15 d發(fā)酵后，豆瓣依然較為飽滿，表面為暗紅色或亮紅色，豆瓣切面為紅黃色；豌豆和綠豆顆粒干癟，表面和切面均為深紅色；紅豆顆粒干癟，表面為深紅并略帶黃色，切面為深紅色。豆類干癟程度與培養(yǎng)基質(zhì)量減少的趨勢一致（圖1）。

圖2 發(fā)酵前與發(fā)酵15 d后不同豆類紅曲的照片

2.2 豆類紅曲發(fā)酵過程中的酶活分析

為了探究不同豆類對紅曲菌生長的影響，分析了發(fā)酵過程中紅曲菌的主要水解酶——淀粉酶與蛋白酶的變化，結(jié)果見圖3。

圖3 不同發(fā)酵豆類淀粉酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶隨時間變化曲線

圖3可知，紅曲菌MS-1在不同豆類上的產(chǎn)酶能力存在差異。

隨著培養(yǎng)時間的延長，淀粉酶活力不斷上升，15 d時達到最高。在發(fā)酵結(jié)束時（15 d），豌豆淀粉酶活力明顯高于紅豆、綠豆和黃豆，黑豆最低（P＜0.05）。

所有豆類紅曲的中性蛋白酶活力均隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。黃豆中性蛋白酶活在發(fā)酵6 d達到最大值，黑豆的酶活最大值出現(xiàn)在9 d，紅豆、豌豆和綠豆最大值出現(xiàn)在發(fā)酵12 d。

紅豆、豌豆和黑豆的酸性蛋白酶活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，綠豆和黃豆在發(fā)酵結(jié)束時酶活力最高。發(fā)酵結(jié)束時，豌豆、綠豆和紅豆的酸性蛋白酶活力高于黃豆和黑豆（P＜0.05）。

前期預(yù)備試驗表明，叢毛紅曲菌MS-1不產(chǎn)生堿性蛋白酶，所以沒有進行其酶活測定，這與前人的報道相同［17］。此外，中性和酸性蛋白酶活測定結(jié)果與前人報道的功能性紅曲生產(chǎn)菌一致［17］。

2.3 豆類紅曲色價、色素成分與莫納可林K分析

色價是衡量紅曲菌產(chǎn)色素能力的重要指標(biāo)［17］。紅曲色素通常包括紅、橙和黃三大類色素成分［14］。研究表明，不同的菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件等均可能影響紅曲色素的組成［5］，為此本研究在測定不同豆類紅曲色價的同時，還測定它們的色素成分差異。色價見表1，色素成分的薄層層析圖見圖4。

表1 豆類紅曲色價和莫納可林K的含量

由表1可知，豌豆、綠豆和紅豆紅曲的色價顯著高于黃豆和黑豆，其中最高的豌豆紅曲色價約為黑豆紅曲色價的15倍，黃豆紅曲色價的10倍。

圖4 不同豆類色素薄層層析圖

由圖4可知，5種豆類紅曲均有Rf值為0.19的紅色素組分，豌豆和綠豆紅曲紅色素組分最多，均分離出Rf分別為0.08、0.19、0.27、0.30的4種組分，而黑豆紅曲最少，僅1種紅色素組分。黃豆和黑豆紅曲中未分離出黃色素組分，豌豆、綠豆和紅豆紅曲中均存在Rf值為0.85和0.92的2種黃色素組分，其中紅豆Rf值為0.92的黃色條帶顏色較深。所有豆類紅曲均未分離出橙色色素條帶。

3 討論

3.1 豆類成分差異影響紅曲菌MS-1的生長發(fā)酵

研究結(jié)果表明：淀粉含量較高的豌豆、紅豆和綠豆更適合于紅曲菌生長、淀粉酶和蛋白酶分泌以及次生代謝產(chǎn)物（紅曲色素和莫納可林K）的合成。主要原因可能是：第一，紅曲菌，包括本實驗使用的叢毛紅曲菌（M.pilosus）MS-1，是以富含淀粉的米飯為培養(yǎng)基篩選得到的，所以淀粉含量高（50%～70%）的豌豆、綠豆和紅豆更適合其生長，而淀粉含量較低（＜20%）的黃豆與黑豆則相對不適宜；第二，不同豆類存在不同的碳氮比可能也是影響紅曲菌MS-1生長與發(fā)酵的原因［4］；第三，豌豆、紅豆和綠豆的凝膠能力高于黃豆和黑豆［18］，保水性較好，而高濕度有利于紅曲菌生長繁殖［2］。這提示我們，當(dāng)以不同的原料進行紅曲生產(chǎn)時，選擇合適的菌株，調(diào)整培養(yǎng)基的碳氮比，保持較高的濕度，消除培養(yǎng)基中抑制成分等對紅曲菌發(fā)酵都是非常重要的。

對于均為高淀粉含量的豌豆、綠豆和紅豆，豌豆的淀粉結(jié)晶度低且鏈長較長，經(jīng)高溫蒸煮冷卻后淀粉的回生能力低于綠豆和紅豆，淀粉分子更加分散，無定形區(qū)更多，而更多的無定形區(qū)更有利于淀粉酶水解［19］。所以豌豆淀粉有利于淀粉酶的水解，更容易被紅曲菌利用。

3.2 不同豆類影響紅曲色素成分

本研究的結(jié)果（圖1和圖4）還顯示，豌豆能產(chǎn)生的紅色素成分最多且色價最高，適合成為提高紅曲色素產(chǎn)量的發(fā)酵基質(zhì)。雖然紅豆的紅色素成分不及豌豆，但該基質(zhì)發(fā)酵后期（8 d后）表面出現(xiàn)黃色（結(jié)果未顯示）可能與薄層色譜中出現(xiàn)含量較高的黃色素成分有關(guān)（圖4），有關(guān)原因有待于進一步分析。

4 結(jié)論

從發(fā)酵進程看，紅曲菌在豌豆、紅豆和綠豆培養(yǎng)基上生長良好且迅速，而在黃豆和黑豆培養(yǎng)基的整個發(fā)酵過程較緩慢。不同豆類紅曲淀粉酶活力隨培養(yǎng)時間延長而增加，發(fā)酵結(jié)束時的淀粉酶活力：豌豆＞紅豆＞綠豆＞黃豆＞黑豆。蛋白酶活力方面，大部分豆類紅曲呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在次級代謝產(chǎn)物中，無論色價還是莫納可林K含量，豌豆、紅豆和綠豆均明顯高于黃豆和黑豆。

較高碳水化合物的豆類比含有較高蛋白豆類更適合紅曲菌的生長、酶的產(chǎn)生和次級代謝產(chǎn)物的積累，而豌豆具有作為高色價和高莫納可林K培養(yǎng)基質(zhì)的潛力。

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The Effects of Different Edible Bean Varieties on Fermented Products of Monascus pilosus MS-1

Chen Xiaoyuan Chen Fusheng
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）

In this paper，five commonly appeared edible beans，Glycine max （yellow soybean），G.max（black soybean），Pisum sativum，Vigna radiate，V.umbellate were used as substrates to prepare Hongqu in solidstate fermentation by Monascus.pilosus MS-1，which could not produce citrinin.Fermentation processes，enzymes activities，color values and functional secondary metabolites such as content of monacolin K and species of pigments were analyzed in different fermented beans.The results showed that P.sativum，V.radiate and V.umbellate were more beneficial to the growth of Monascus，enzyme activities，color values and concentration of monacolin K than G.max（yellow soybean and black soybean）as substrates.Besides，there were some differences among pigment constituents of these 5 fermented beans.Meanwhile Monascus-fermented P.sativum produced the highest amount of both color value and monacolin K among them，which were 246.12 U／g （dry-basis）and 5.05 mg／g （dry-basis），respectively.Using P.sativum as the media was recommended for the high yeild of monacolin K and color value.

edible bean，Monascus spp.，Monascus pigment，monacolin K，citrinin

TS214.9

A

1003-0174（2016）09-0026-06

2015-01-30

陳曉園，女，1991年出生，碩士，食品科學(xué)

陳福生，男，1965年出生，教授，食品安全與生物技術(shù)