微生物合成鼠李糖脂生物表面活性劑的研究進(jìn)展

杜瑾，郝建安，張曉青，王靜，張雨山

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192)

摘要：微生物合成的鼠李糖脂是一類重要的生物表面活性劑，具有易被生物降解、表面活性良好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。目前用于發(fā)酵合成鼠李糖脂的菌株主要為假單胞菌屬。綜述了產(chǎn)鼠李糖脂菌株的發(fā)現(xiàn)與篩選、鼠李糖脂的生物合成途徑與代謝調(diào)控關(guān)系、鼠李糖脂發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制、高產(chǎn)鼠李糖脂工程菌株的構(gòu)建等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)其研究趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：鼠李糖脂；生物表面活性劑；假單胞菌；微生物發(fā)酵；代謝工程

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21406042)，海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201105026，201305022-5)

收稿日期：2014-12-08

作者簡介：杜瑾(1985-)，女，天津人，博士，工程師，研究方向：海水利用技術(shù)及合成生物學(xué)，E-mail:dujin111@126.com；通訊作者：張雨山，教授級(jí)高級(jí)工程師，E-mail:yushanzhang@hotmail.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.04.002

中圖分類號(hào)：Q 81文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

生物表面活性劑是天然的兩親化合物，與化學(xué)合成的表面活性劑相比，具有無毒、易被生物降解、高效的起泡性、良好的破乳性、對(duì)特定界面的選擇性、化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性等優(yōu)點(diǎn)，在化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。其中，鼠李糖脂是研究和應(yīng)用最廣泛的生物表面活性劑[2]。如在石油開采中，添加微生物合成的鼠李糖脂來降低水-原油-巖石間的界面張力，是提高原油采收率的有效方法[3]。1989年發(fā)生在美國阿拉斯加的Exxon Valdez號(hào)油輪溢油事件，通過使用微生物表面活性劑鼠李糖脂，成功地在6周內(nèi)分解石油中幾乎全部的正烷烴[4]。微生物合成的鼠李糖脂還具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等生物活性[5]。因此，鼠李糖脂生物表面活性劑的生產(chǎn)受到了廣泛關(guān)注，如2004年美國Jeneil生物表面活性劑公司研制的生物基鼠李糖脂獲得了美國聯(lián)邦環(huán)保署頒發(fā)的“總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”(Presidential Green Chemistry Challenge)[6]。因此，開發(fā)高效的微生物合成鼠李糖脂的方法具有重要的社會(huì)和環(huán)境效益。

作者從產(chǎn)鼠李糖脂菌株的發(fā)現(xiàn)與篩選、鼠李糖脂的生物合成途徑與代謝調(diào)控關(guān)系、鼠李糖脂發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制、高產(chǎn)鼠李糖脂工程菌株的構(gòu)建等4個(gè)方面綜述了國內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展，并對(duì)其研究趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1產(chǎn)鼠李糖脂菌株的發(fā)現(xiàn)與篩選

鼠李糖脂最早于1949年由Jarvis和Johnson[7]在銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中發(fā)現(xiàn)。P.aeruginosa也是目前發(fā)現(xiàn)的合成鼠李糖脂的最主要種屬，在不同條件下能合成多種結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂，主要有雙糖雙脂結(jié)構(gòu)R1(Rha-Rha-C10-C10)、單糖雙脂結(jié)構(gòu)R2(Rha-C10-C10)、雙糖單脂結(jié)構(gòu)R3(Rha-Rha-C10)和單糖單脂結(jié)構(gòu)R4(Rha-C10)4種結(jié)構(gòu)類型。由于脂肪鏈的長度及飽和程度不同，且各亞種菌株合成不同結(jié)構(gòu)鼠李糖脂的比例不同，造成不同菌株合成的表面活性劑的性能各異。P.aeruginosa是條件致病菌，它合成表面活性劑的行為與其致病性相關(guān)，致使該菌的發(fā)酵生產(chǎn)受到限制。近年來，Pseudomonas屬其它具有鼠李糖脂合成能力的菌種也陸續(xù)被分離，如P.putida[8]、P.chlororaphis[9]、P.fluorescens[10]、P.nitroreducens[11]等。

Burkholderia屬是合成鼠李糖脂的另一重要菌種來源，能合成帶有C14-C14脂結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂。其中，B.plantarii[12]和B.pseudomallei[13]產(chǎn)鼠李糖脂的過程與其對(duì)人和動(dòng)物的致病性有關(guān)。而B.thailandensis[14]為非致病菌，與P.aeruginosa相比，它合成的鼠李糖脂脂鏈較長、雙鼠李糖脂比例較高，具有良好的表面活性，是理想的生產(chǎn)菌之一。

很多合成鼠李糖脂的微生物是從受烴類污染的環(huán)境中獲得的。如Nayak等[15]篩選到的產(chǎn)鼠李糖脂菌株P(guān)seudoxanthomonassp.PNK-04能夠激活其降解鄰氯苯甲酸、間氯苯甲酸和1-甲基萘等污染物，可用于生物修復(fù)。Rooney等[16]從生物柴油污染的土壤中篩選到Acinetobactercalcoaceticus、Enterobacterhormaechei、Pantoeastewartii和E.asburiae等多種細(xì)菌，能夠以甘油為唯一碳源生成含C10-C10脂結(jié)構(gòu)的單糖或雙糖鼠李糖脂，其中A.calcoaceticus和E.hormaechei合成鼠李糖脂的水平與Pseudomonas屬相近。

多種革蘭氏陽性菌也被發(fā)現(xiàn)具有合成鼠李糖脂的能力，如Tetragenococcuskoreensis[17]、Renibacteriumsalmoninarum[18]等。Christova等[19]首次報(bào)道了一株具有鼠李糖脂合成能力的Bacillussubtilis，并能夠降解烴類物質(zhì)。Cheng等[20]從勝利油田地下廢水中分離的B.subtilisTU2能夠同時(shí)生成脂肽和鼠李糖脂混合生物表面活性劑。此外還有真菌合成鼠李糖脂的報(bào)道，如Kiran等[21]從海綿中分離獲得的共生真菌Aspergillussp.MSF1。

2鼠李糖脂的生物合成途徑與代謝調(diào)控關(guān)系

2.1　生物合成途徑及關(guān)鍵酶

目前，針對(duì)P.aeruginosa的鼠李糖脂生物合成途徑研究比較深入。Burger等于1963年利用放射性標(biāo)記前體物質(zhì)追蹤酶提取物，首次提出了鼠李糖脂的從頭生物合成途徑，并認(rèn)為dTDP-L-鼠李糖和β-羥基脂肪酸是其主要前體。在該途徑的基礎(chǔ)上，逐步闡明其遺傳背景、分子機(jī)制和代謝調(diào)控關(guān)系，為構(gòu)建代謝工程菌株提供了可能。針對(duì)P.aeruginosa的鼠李糖脂生物合成途徑如圖1所示。

圖1　鼠李糖脂生物合成途徑 Fig.1　Biosynthetic pathway of rhamnolipid

由圖1可知，前體dTDP-L-鼠李糖為鼠李糖脂提供糖基部分。它可經(jīng)糖異生途徑或Entner-Doudoroff(ED)途徑起始合成，由6-磷酸-葡萄糖在磷酸葡萄糖變位酶(AlgC)的作用下轉(zhuǎn)化為1-磷酸-葡萄糖[22]，然后經(jīng)rmlBDAC基因簇編碼的1-磷酸葡萄糖胸腺嘧啶轉(zhuǎn)移酶(RmlA)、dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶(RmlB)、dTDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖-3,5-異構(gòu)酶(RmlC)和dTDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖還原酶(RmlD)4步反應(yīng)生成dTDP-L-鼠李糖[23]。

前體β-羥基脂肪酸提供鼠李糖脂的脂鏈部分。它的從頭合成經(jīng)過Ⅱ型脂肪酸合成酶系催化，在酮脂酰還原酶(FabG)作用下將β-酮脂酰-ACP還原為β-羥脂酰-ACP。2分子β-羥脂酰-ACP在肽轉(zhuǎn)移酶(RhlA)作用下生成β-羥基烷酰基-β-羥基烷酸(HAA)[24]。該途徑中酰基-ACP、β-酮脂酰-ACP等中間產(chǎn)物同時(shí)為某些群體感應(yīng)(QS)信號(hào)分子的合成提供前體，在?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶RhlI和LasI的作用下，合成C4-HSL和3-氧代-C12-HSL等信號(hào)分子，對(duì)鼠李糖脂合成途徑進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[25-26]。近期有研究表明脂肪酸的β-氧化也可為鼠李糖脂提供前體HAA，該途徑中β-烯酰-CoA在水合酶/異構(gòu)酶RhlYZ催化下生成β-羥脂酰-CoA，再通過RhlA作用生成HAA[27]。

RhlB與RhlA構(gòu)成一種復(fù)合酶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶1，可使前體dTDP-L-鼠李糖和HAA合成為單鼠李糖脂，再在鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶2(RhlC)作用下進(jìn)一步合成雙鼠李糖脂[28-29]。RhlB和RhlC均包含跨膜的疏水性區(qū)域，可錨定于細(xì)胞內(nèi)膜，因此鼠李糖脂可能是在內(nèi)膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)合成后再轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外的。

RhlAB和RhlC催化了鼠李糖脂生物合成的3個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)，其中RhlAB在基因組中以操縱子rhlABRI的形式編碼，在啟動(dòng)子Prhl操縱下受QS系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)。在產(chǎn)鼠李糖脂菌株B.thailandensis和B.pseudomaller的研究中也發(fā)現(xiàn)了rhlA、rhlB和rhlC基因[14]，但與P.aeruginosa不同的是，3個(gè)基因以rhlABC基因簇的形式編碼在一起，并在基因組中有2個(gè)相同的拷貝。

2.2　鼠李糖脂生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制

受QS信號(hào)分子在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，微生物合成鼠李糖脂的過程與細(xì)胞密度緊密相關(guān)。如P.aeruginosa中相關(guān)的QS信號(hào)分子主要有N-?；z氨酸內(nèi)酯(AHL)和2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)兩類，相應(yīng)的QS系統(tǒng)有AHL-依賴的RhlR/I系統(tǒng)、LasR/I系統(tǒng)和PqsR/A/H系統(tǒng)[30]。其中RhlR/I系統(tǒng)的編碼基因以操縱子rhlABRI的形式存在，直接調(diào)控rhlAB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞生長至一定密度時(shí)，RhlI合成的信號(hào)分子C4-HSL的濃度達(dá)到閾值，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控子RhlR結(jié)合形成RhlR/C4-HSL，解除RhlR對(duì)轉(zhuǎn)錄的阻遏，激活rhlAB上游啟動(dòng)子Prhl開始轉(zhuǎn)錄[31]。鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的編碼基因rhlC與rhlAB位于基因組中不同位置，但也同樣受RhlR/I系統(tǒng)調(diào)控[28]。LasR/I系統(tǒng)通過調(diào)控RhlR/I系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄來間接控制鼠李糖脂的合成途徑[32]。

P.aeruginosa中QS系統(tǒng)在直接調(diào)控鼠李糖脂合成途徑的同時(shí)，也受到其它多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控。其中對(duì)QS系統(tǒng)起負(fù)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，如RsaL可與lasI基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制lasR和lasI基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，間接影響鼠李糖脂的合成[33]；AlgR在生物被膜形成過程中可與rhlI基因和rhlAB基因啟動(dòng)子部分結(jié)合，抑制鼠李糖脂合成基因的轉(zhuǎn)錄；PtxR通過下調(diào)PQS系統(tǒng)調(diào)控的基因表達(dá)來抑制鼠李糖脂的合成途徑[34]。對(duì)QS系統(tǒng)起正調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子Vfr能夠直接激活lasR基因和rhlR基因的轉(zhuǎn)錄過程，并可構(gòu)成正反饋調(diào)控環(huán)[35]；LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MvfR能夠激活PQS系統(tǒng)編碼基因pqsABCDE操縱子的轉(zhuǎn)錄[36]；再如全局調(diào)控因子VqsR[37]和VqsM[38]能夠促進(jìn)QS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄以間接調(diào)控鼠李糖脂的合成途徑。感受環(huán)境壓力的sigma因子(σ)，如氮代謝的調(diào)控因子RpoN(σN)和菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期的調(diào)控因子RpoS(σS)均可在特定環(huán)境條件下調(diào)控QS系統(tǒng)的表達(dá)[39]。

另一些調(diào)控因子則在轉(zhuǎn)錄后對(duì)QS系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響P.aeruginosa中鼠李糖脂的合成。如QscR作為LasR和RhlR的同源蛋白，可以與信號(hào)分子AHL結(jié)合形成QscR/AHL復(fù)合物，阻礙AHL與阻遏蛋白R(shí)hlR或LasR的結(jié)合，抑制鼠李糖脂合成基因rhlAB的轉(zhuǎn)錄[40]。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白R(shí)smA通過與rhlI或lasI基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA相結(jié)合，阻礙mRNA翻譯過程的起始，抑制QS信號(hào)分子合成[41]，但同時(shí)RsmA還可能促進(jìn)rhlAB基因的翻譯，增強(qiáng)鼠李糖脂的合成[42]；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白DksA的調(diào)控機(jī)制與RsmA相似[43]。

上述調(diào)控元件之間的相互作用可用圖2表示。

圖2　鼠李糖脂生物合成途徑的基因調(diào)控 Fig.2　Genetic regulation of rhamnolipid biosynthetic pathway

圖2是鼠李糖脂生物合成途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，生物合成鼠李糖脂的產(chǎn)量和產(chǎn)率受細(xì)胞密度等多種因素的復(fù)合控制。同時(shí)，鼠李糖脂前體(如鼠李糖、脂肪酸)合成途徑中涉及的rmlBDAC、rhlYZ等基因也受不同QS系統(tǒng)調(diào)控轉(zhuǎn)錄[27,44]。因此，不同生長狀態(tài)下，生物表面活性劑合成的完整途徑中，各反應(yīng)步驟受調(diào)控表達(dá)的水平不同，造成產(chǎn)物中單、雙鼠李糖脂及代謝中間產(chǎn)物的比例不同，產(chǎn)物的表面活性、乳化性等亦有區(qū)別，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品性能的穩(wěn)定性。

3鼠李糖脂發(fā)酵過程的優(yōu)化與調(diào)控

3.1　培養(yǎng)基成分的優(yōu)化及低值原料的利用

微生物合成鼠李糖脂的成分和活性均受到培養(yǎng)基組成的影響，特別是其中的碳源底物。這是由于大部分具備表面活性劑合成能力的微生物是與其攝取生長環(huán)境中疏水性底物相適應(yīng)的(如降解烷烴等)，其細(xì)胞代謝與環(huán)境條件相適應(yīng)[45]。研究表明，P.aeruginosa可利用多種碳源合成鼠李糖脂，如甘露醇或苯蒽烯等作為唯一碳源[46]。碳源底物的親、疏水性可改變產(chǎn)物鼠李糖脂與副產(chǎn)物PHA和HAA的組成比例，從而改變發(fā)酵產(chǎn)物的表面活性和乳化性[47]。但疏水性底物往往抑制細(xì)胞生長，降低了鼠李糖脂的產(chǎn)量。通過添加適量葡萄糖碳源，控制油類與葡萄糖在培養(yǎng)基中的比例，可提高鼠李糖脂的表面活性及產(chǎn)量[48]，但會(huì)增加原料成本。

培養(yǎng)基中氮源對(duì)鼠李糖脂的合成也有顯著影響。如硝酸鹽、谷氨酸鹽等氮源能促進(jìn)鼠李糖脂的合成，而銨鹽、谷氨酰胺、精氨酸等氮源則抑制其合成[49]。Lee等[50]發(fā)現(xiàn)，以魚油為碳源時(shí)，P.aeruginosaBYK-2合成鼠李糖脂的最佳氮源為尿素。不僅碳源和氮源的種類影響鼠李糖脂的生物合成，C/N值也有重要的影響。Guerra-Santos等[51]報(bào)道，P.aeruginosaDSM2569在以葡萄糖為碳源、硝酸鹽為氮源的培養(yǎng)基中，C/N值在16~18之間時(shí)，鼠李糖脂產(chǎn)量最高，而C/N值低于11時(shí)不能合成鼠李糖脂。

此外，限制某些金屬離子的濃度也有利于提高鼠李糖脂產(chǎn)量。Abalos等[52]報(bào)道，當(dāng)培養(yǎng)基中FeSO4·7H2O的濃度由13.7 g·L-1降至7.4 g·L-1時(shí)，鼠李糖脂的產(chǎn)量明顯提高。

可見，權(quán)衡原料底物的特異性、產(chǎn)物的表面活性及組成成分、產(chǎn)量的穩(wěn)定性，是利用微生物發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的研究重點(diǎn)。越來越多的研究者致力于尋求廉價(jià)原料作為碳、氮源發(fā)酵合成鼠李糖脂。如Haba等[53]利用葵油和橄欖油的烹飪廢油作原料時(shí)，P.aeruginosa發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂達(dá)6.75~9.25 g·L-1；但以油類精煉廢棄物等作原料時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物成分增多，甚至可能由多達(dá)六七種具有表面活性的同系物組成[54-55]，反而增加了產(chǎn)物分離純化的成本。

3.2　不同發(fā)酵工藝的選擇

目前報(bào)道的鼠李糖脂發(fā)酵工藝主要包括分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、休止細(xì)胞培養(yǎng)、固態(tài)發(fā)酵等。補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝可以保持較低的底物水平并控制細(xì)胞的比生長速率，產(chǎn)量較高。但由于微生物合成鼠李糖脂的代謝途徑和基因調(diào)控復(fù)雜，補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的效果并不理想，產(chǎn)量在6~95 g·L-1之間，與分批發(fā)酵(5~112 g·L-1)沒有顯著差別[56]。如Giani等[57]將P.aeruginosaDSM7107或7108菌株在250 g·L-1豆油和15 g·L-1NaNO3培養(yǎng)基中進(jìn)行分批發(fā)酵，鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)112 g·L-1，是目前文獻(xiàn)報(bào)道中最高的。在補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，控制pH值可以提高發(fā)酵效率。如Chen等[58]研究發(fā)現(xiàn)，過多補(bǔ)加葡萄糖會(huì)增加酸性代謝物的積累，而葡萄糖不足則會(huì)降低鼠李糖脂產(chǎn)量，故以6%葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料，可將P.aeruginosaS2菌株發(fā)酵體系的pH值維持在6.8，產(chǎn)量達(dá)6.06 g·L-1。Zhu等[59]對(duì)P.aeruginosaO-2-2菌株5 L發(fā)酵體系的pH值進(jìn)行分段控制，并補(bǔ)加大豆油，鼠李糖脂發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)70.56 g·L-1。

由于鼠李糖脂具有表面活性，其液態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量泡沫降低了生產(chǎn)效率。Sarachat等[60]在發(fā)酵的同時(shí)耦合了分離方法，通過簡單處理后對(duì)鼠李糖脂進(jìn)行分離濃縮，在收集溢出泡沫的同時(shí)對(duì)罐內(nèi)補(bǔ)料，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的連續(xù)性；但其操作和控制均較復(fù)雜，產(chǎn)物純度較低，染菌幾率高，使該發(fā)酵工藝的應(yīng)用受到限制。固態(tài)發(fā)酵法以固體底物為發(fā)酵原料，避免了液態(tài)發(fā)酵中的泡沫問題，但目前僅限于搖瓶實(shí)驗(yàn)。如Camilios-Neto等[61]以質(zhì)量比50∶50的蔗渣和玉米糠為固體底物、以6%(體積分?jǐn)?shù))甘油和大豆油為浸漬液，對(duì)P.aeruginosaUFPEDA 614菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂。

4高產(chǎn)鼠李糖脂工程菌株的構(gòu)建

鼠李糖脂的微生物合成途徑由多步酶催化反應(yīng)構(gòu)成，并受到群體感應(yīng)、底物種類等多種因素在轉(zhuǎn)錄、代謝等水平的復(fù)雜調(diào)控，對(duì)發(fā)酵過程的穩(wěn)定高效造成影響。運(yùn)用代謝工程手段和合成生物技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)鼠李糖脂的工程菌株，有望實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控微生物產(chǎn)鼠李糖脂代謝途徑，降低生產(chǎn)成本，提高合成效率。

目前，構(gòu)建鼠李糖脂工程菌的研究工作主要集中于關(guān)鍵基因rhlAB在非致病菌株的異源表達(dá)。Ochsner等[62]最早異源表達(dá)了rhlAB基因，在P.fluorescens和P.putida中合成鼠李糖脂。Wang等[63]將rhlAB基因簇導(dǎo)入不產(chǎn)表面活性劑的菌株E.coliBL21和P.aeruginosa-rhlA中，可賦予其產(chǎn)鼠李糖脂的活性并用于提高原油采收率。

某些宿主細(xì)胞合成鼠李糖脂前體的能力存在缺陷，限制了異源表達(dá)rhlAB時(shí)合成鼠李糖脂的水平。Cabrera-Valladares等[64]在E.coli中表達(dá)P.aeruginosa的rhlAB的同時(shí)，表達(dá)dTDP-L-鼠李糖合成基因rmlBDAC，保證了前體供應(yīng)，使重組E.coli以葡萄糖為唯一碳源，合成單鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)120 mg·L-1。

Cao等[65]克隆了P.aeruginosaBSFD5基因組中rhlABRI整個(gè)基因簇，并整合入非致病菌P.putidaKT2440基因組中，實(shí)現(xiàn)rhlABRI基因簇穩(wěn)定表達(dá)，鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)1.68 g·L-1，并對(duì)芘污染土壤具有良好的修復(fù)作用。Wittgens等[66]以非致病菌P.putidaKT2440作為底盤細(xì)胞異源表達(dá)rhlAB，同時(shí)基于對(duì)底盤細(xì)胞代謝通量平衡分析，敲除副產(chǎn)物PHA合成途徑中的關(guān)鍵基因phaC，實(shí)現(xiàn)非生長依賴、以葡萄糖為底物的鼠李糖脂合成，產(chǎn)量達(dá)0.15 g·g-1。研究者還試圖尋找更多適合表達(dá)鼠李糖脂合成基因的宿主細(xì)胞，如Tavares等[67]在Burkholderia菌株中異源表達(dá)P.aeruginosaPAO1的rhlAB基因，可提高產(chǎn)量并使產(chǎn)物結(jié)構(gòu)由以雙鼠李糖脂為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐詥问罄钐侵瑸橹鳌?/p>

5展望

圍繞發(fā)酵法生產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑這一研究課題，國內(nèi)外研究人員已在菌株篩選、代謝合成機(jī)制和調(diào)控機(jī)理、發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化、高產(chǎn)工程菌株構(gòu)建等方面取得了可喜進(jìn)展，但是還存在著原料成本高、產(chǎn)量低、產(chǎn)物成分不穩(wěn)定、分離純化成本高等問題，制約了鼠李糖脂生物表面活性劑的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此，綜合運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物技術(shù)將成為未來鼠李糖脂生物合成研究的重點(diǎn)，主要集中于以下幾個(gè)方面：(1)通過分析和比較產(chǎn)鼠李糖脂菌株的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝物組、通量組的規(guī)律和變化，從代謝網(wǎng)絡(luò)全局深入解析鼠李糖脂合成途徑及其調(diào)控關(guān)系；(2)基于組學(xué)分析，解析鼠李糖脂合成關(guān)鍵反應(yīng)步驟，設(shè)計(jì)、合成和優(yōu)化可調(diào)控的功能模塊，并選擇相適配的底盤細(xì)胞，構(gòu)建高效合成鼠李糖脂人工細(xì)胞；(3)通過基因改造和進(jìn)化篩選，提高菌株對(duì)廉價(jià)底物的利用效率，降低原料成本，提高微生物合成鼠李糖脂的經(jīng)濟(jì)性。

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Research Progress in Biosynthesis of Rhamnolipid Biosurfactant

DU Jin,HAO Jian-an,ZHANG Xiao-qing,WANG Jing,ZHANG Yu-shan

(TheInstituteofSeawaterDesalinationandMultipurposeUtilization，

StateOceanicAdministration,Tianjin300192,China)

Abstract：Rhamnolipid is an important biosurfactant with the advantages of biodegradability and high surface activities,and it has broad application potentials.Rhamnolipid is produced mainly by Pseudomonassp..The recent progress in screening and isolation of rhamnolipid-producing strains,relationship between synthetic pathway and metabolic regulation,optimization and control of fermentation process,construction of metabolic engineering strains with high-yield rhamnolipid-producing were reviewed.And the research trends were prospected.

Keywords：rhamnolipid;biosurfactant;Pseudomonassp.;microbial fermentation;metabolic engineering