根皮苷對(duì)LO2正常人肝細(xì)胞體外細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)研究

陳署賢1,郭建茹2,朱冬梅3,劉華楨3,林繼宗1,侯少貞3*

(1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝病外科，廣州 510630；2.澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078；

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006)

摘要：目的探究根皮苷對(duì)正常人肝細(xì)胞LO2的體外細(xì)胞毒性。方法實(shí)驗(yàn)分為正常組和根皮苷組。將從甜茶中提取根皮苷配以不同濃度根皮苷的培養(yǎng)液，濃度分別為4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L。分別在24、48和72 h，使用MTT比色法測(cè)定并計(jì)算出細(xì)胞活力率。結(jié)果給藥24、48和72 h后，根皮苷在4.0～1 000 μmol/L濃度的范圍內(nèi)對(duì)正常人肝細(xì)胞LO2無毒性作用，細(xì)胞的存活率在90%以上。結(jié)論在4.0～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)，根皮苷對(duì)正常人肝細(xì)胞的正常增殖無明顯抑制，未顯示有肝細(xì)胞毒性作用。

關(guān)鍵詞：根皮苷；肝細(xì)胞；MTT

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.024

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81303281)；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B091100184)；廣州中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年學(xué)者科研基金項(xiàng)目(2012)。

作者簡(jiǎn)介:陳署賢(1981-)，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事脂肪肝的發(fā)展機(jī)制及治療研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-11-07)

*通信作者:侯少貞,電子信箱-hsz0214@gzucm.edu.cn

Cytocoxicity of Phloridzin on LO2 human liver cells

CHEN Shuxian1,GUO Jianru2,ZHU Dongmei3,LIU Huazhen3,LIN Jizong1,HOU Shaozhen3*

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,The Third Affiliated Hospital of SUN YAT-SEN University,Guangzhou 510630,China;

2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine,Macau University of Science

and Technology,Macau 999078,China;

3.College of traditional Chinese Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the cytotoxicity of Phloridzin on LO2 human liver cells.MethodsThe normal group and Phlorizin groups with the concentrations of 4.0,8.0,16.0,32.0,64.0,128,256,512,800,1 000 μmol/L were established.Then the rate of cell viability was calculated by the MTT assay,respectively at 24 h,48 h and 72 h after administration.ResultsAfter administration for 24,48 and 72 hours,the absorbance of all Phlorizin groups were similar to that of normal group,and there were no statistical significance.The cell viability was all above 90%.ConclusionPhlorizin has no toxicity to normal human liver cells with the concentration range of 4.0-1 000 μmol/L.

Keywords:Phloridzin;LO2 human liver cells;MTT assay

根皮苷最早是從蘋果、蘋果樹皮及葉中提取而得，屬于二氫查耳酮化合物[1]。同時(shí)，根皮苷還廣泛存在于多穗柯植物的葉中[2]。多穗柯，俗稱“甜茶”，是南方地區(qū)一種作為保健茶的中藥，其功效主要有清熱解毒、滋肝補(bǔ)腎、生津潤(rùn)肺等，主要用于降低血糖、降血脂、降血壓等[3-4]?？紤]作為保健茶飲用，藥材主要活性成分的安全性研究是一項(xiàng)必要的工作。經(jīng)口化合物進(jìn)入腸道被人體吸收后，一般主要在肝臟代謝，由此最容易也最早產(chǎn)生肝毒性作用[5]。根皮苷是甜茶的主要化學(xué)成分，目前尚未有關(guān)于其對(duì)肝細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬初步考察根皮苷對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，為甜茶及根皮苷的食用和治療的安全性提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞LO2細(xì)胞，為人肝細(xì)胞株，購(gòu)于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2藥物根皮苷(Phloridzin)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供，經(jīng)HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，根皮苷純度超過為96%。

1.3試劑及儀器改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，Hyclone公司;青霉素-鏈霉素雙抗液，上海慧穎生物科技有限公司;0.25%胰酶-EDTA，美國(guó)GIBCO公司；胎牛血清，美國(guó)GIBCO公司；MTT，Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；CO-150型一氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)NBS公司；SW-CJ-2F型醫(yī)用凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；CKX-41-32型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；CU600型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RT-2100C型酶標(biāo)分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1試劑配制

2.1.1MTT的配制用精密天平稱取0.25 g MTT，置于50 mL容量瓶中，加PBS適量，50～60 ℃水浴，搖勻使溶解充分，加PBS至刻度，配制成5 mg/kg的溶液，用0.22 μm的唯孔濾膜過濾除菌，分裝后避光4 ℃冰箱保存。

2.1.2細(xì)胞凍存液的配制細(xì)胞凍存液按照20%血清、10%DMSO、70%1640培養(yǎng)基混合均勻，-20℃保存。

2.1.3根皮苷的配制用DMSO配成藥物的母液，然后用培養(yǎng)液稀釋到所用藥物的濃度，DMSO的終濃度控制在≤0.1%。

2.2LO2細(xì)胞培養(yǎng)將人正常的LO2細(xì)胞放入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液約4～5 mL，置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞80%融合后進(jìn)行傳代或凍存。取5～7代細(xì)胞用于正式試驗(yàn)。

2.3分組與給藥實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞對(duì)照組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置不同濃度根皮苷給藥組，濃度分別為4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L。

2.4肝細(xì)胞MTT比色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LO2細(xì)胞，配成5.0×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板，設(shè)置正常對(duì)照組，不同濃度4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128、256、512、800、1 000 μmol/L的根皮苷給藥組。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗2～3次,分別加入上述不同濃度的根皮苷，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48、72 h后，在各個(gè)時(shí)間段分別加入MTT溶液，避光培養(yǎng)4 h。4 h后，吸棄上層培養(yǎng)基，再每孔加入150 LDMSO溶劑溶解噻唑藍(lán)結(jié)晶，輕搖培養(yǎng)板使溶解均勻。酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔吸光度值。每孔吸光值大小反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的多少，兩者呈正比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

計(jì)算出細(xì)胞活力率:細(xì)胞活力率(%)=各組吸光度(OD490)×100/對(duì)照組吸光度(OD490)

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度根皮苷在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響結(jié)果見表1～3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，給藥24 h后，不同濃度的根皮苷給藥組與正常組的OD值相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞的存活率跟正常組細(xì)胞接近；給藥48 h后，各組細(xì)胞OD值比24 h后的變大，提示細(xì)胞正常生長(zhǎng)，不同濃度的根皮苷給藥組的細(xì)胞正常生長(zhǎng)，存活率大于90%，與正常組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;給藥72 h后，各組細(xì)胞的OD值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增長(zhǎng)率減小，提示細(xì)胞仍處于生長(zhǎng)階段，生長(zhǎng)速度有所抑制。不同濃度的根皮苷給藥組對(duì)細(xì)胞無抑制作用，OD值跟正常組比較，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞的存活率大于90%，可以認(rèn)為根皮苷在4.0～1 000 μmol/L的范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制不大，對(duì)細(xì)胞無毒性。

4討論

根皮苷是一種在蘋果樹、多穗柯及植物甜茶葉中普遍存在的天然產(chǎn)物和膳食成分[6-8]，它具有降低血糖、抗氧化、抗癌等多種生物活性[9-11]。由于根皮苷廣泛存在于藥品、保健品中，并且根皮苷已經(jīng)批準(zhǔn)成為食品添加劑，可以作為甜食愛好者和糖尿病人的糖類替代食品[7],因此考察根皮苷對(duì)肝細(xì)胞毒性具有實(shí)際意義。

表1　根皮苷作用24 h對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

表2　根皮苷作用48 h對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

表3　根皮苷作用72 h對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[13-14]是化學(xué)成分毒性研究的最常用方法之一，具有快捷、簡(jiǎn)便、直觀的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)MTT比色法[15]的原理，測(cè)定根皮苷不同濃度對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響，觀察到根皮苷作用不同時(shí)間(24、48、72 h)對(duì)LO2細(xì)胞增殖是否有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)根皮苷在4.0～1 000 μmol/L的范圍內(nèi)。正常對(duì)照組的細(xì)胞在48、72 h的時(shí)間段內(nèi)增長(zhǎng)率相近,細(xì)胞在72 h內(nèi)呈正常生長(zhǎng)狀態(tài)。根皮苷給藥組在用藥干預(yù)48 h后各組細(xì)胞增長(zhǎng)率比給藥72 h后大；給藥干預(yù)72 h后各組細(xì)胞的OD值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增長(zhǎng)率減小，提示細(xì)胞仍處于生長(zhǎng)階段，而藥物在給藥72 h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度有所抑制，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此可以說根皮苷對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制不大，對(duì)肝細(xì)胞未顯示明顯毒性。

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