通補(bǔ)消積飲對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

李義君1，全麗娜2，劉建秋3

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，哈爾濱 150040；

3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

摘要：目的研究通補(bǔ)消積飲對(duì)A549細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響。方法應(yīng)用Western-blot法觀察通補(bǔ)消積飲對(duì)A549細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果通補(bǔ)消積飲低、中、高劑量組含藥血清作用A549細(xì)胞48 h后,Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.739±0.051),(0.520±0.047)，(0.395±0.035)，通補(bǔ)消積飲各劑量組與空白血清組(0.881±0.062)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，在一定的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出明顯的量-效關(guān)系。結(jié)論通補(bǔ)消積飲能明顯抑制A549細(xì)胞Cyclin D1蛋白的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：通補(bǔ)消積飲；A549；Cyclin D1

DOI::10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.06.027

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)06-0617-02

基金項(xiàng)目:黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12521509)。

作者簡(jiǎn)介:李義君(1979-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-09-24)

Tongbu Xiaoji decoction on expression of Cyclin D1 in human lung adenocarcinoma cell line A549

LI Yijun1,QUAN Lina2,LIU Jianqiu3

(1.Heilongjiang University Second Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150001,China;

2.The Third Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150040,China;

3.Heilongjiang University First Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of the Tongbu-Xiaoji decoction to the expression of Cyclin D1 of A549 cells.MethodsThe protein expression of Cyclin D1 in A549 cells were evaluated by Western blot.ResultsTongbu-Xiaoji decoction with low、median and high dose medicated serum were used to affected A549 cell.After 48 h,the protein expression of Cyclin D1 of A549 cells significantly decreased and the values were (0.739±0.051),(0.520±0.047) and (0.395±0.035).Compared with that of blank group,Tongbu-Xiaoji decoction with low,median and high dose medicated serum (0.881±0.062) had a significant difference (P<0.05,P<0.01),and the affection shows a dose-dependent manner.ConclusionTongbu Xiaoji decoction inhibited the protein expression of Cyclin D1 in A549 cells significantly.

Keywords:Tongbu Xiaoji decoction;A549;Cyclin D1

中醫(yī)藥在中晚期肺腺癌的治療上有其獨(dú)特理念和實(shí)際優(yōu)勢(shì)[1]。通補(bǔ)消積飲是多年臨證中總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，筆者研究通補(bǔ)消積飲對(duì)A549細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響，總結(jié)報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)材料

人肺腺癌A549細(xì)胞，Wistar雄性大鼠。二氧化碳孵育箱；醫(yī)用超凈工作臺(tái)；高速臺(tái)式離心機(jī)；低速離心機(jī)；電熱恒溫水槽；電泳儀；垂直電泳槽及制膠裝置；酶標(biāo)儀。通補(bǔ)消積飲中藥復(fù)方由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院飲片藥局提供。RIPA裂解液；Bradford法蛋白定量試劑盒；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)；ECL試劑盒；Beta Actin antibody；Cyclin D1 antibody。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1含藥血清制備Wistar雄性大鼠16只隨機(jī)分為4組，每組4只。通補(bǔ)消積飲低、中、高劑量組給藥劑量分別為28，56，112 g/(kg·d)，分2次灌胃;空白血清組：灌生理鹽水，分2次灌胃；連續(xù)給藥5 d，第5天灌服1 d劑量2 h后將大鼠麻醉，心臟穿刺采血取含藥血清，過(guò)濾除菌，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2Western-blot法檢測(cè)通補(bǔ)消積飲對(duì)A549細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

2.2.1蛋白的提取將A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入各組血清作用48 h后收集細(xì)胞,加入適量細(xì)胞裂解液充分混勻，充分裂解后離心5 min，取上清。

2.2.2Bradford法進(jìn)行蛋白定量用Bradford 染色液測(cè)定樣品吸收值A(chǔ)595，根據(jù)測(cè)得的吸收值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得樣品的蛋白含量。

2.2.3Western-blot分析1)SDS-PAGE電泳；2)轉(zhuǎn)膜；3)封閉；4)孵育抗體；5)顯色；6)應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件對(duì)Western-blot圖片進(jìn)行灰度分析。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從結(jié)果分析以及Western-blot圖片(圖1)中可以看出，通補(bǔ)消積飲含藥血清作用A549細(xì)胞48 h后，Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯降低，且隨著劑量的增加，Cyclin D1蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)。各組Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為空白血清組(0.881±0.062)，通補(bǔ)消積飲低劑量組(0.739±0.051)，中劑量組(0.520±0.047)，高劑量組(0.395±0.035)。通補(bǔ)消積飲各劑量組與空白血清組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，并表現(xiàn)出明顯劑量依賴性。

A：空白血清組　B：通補(bǔ)消積飲低劑量組　C：通補(bǔ)消積飲中劑量組　D：通補(bǔ)消積飲高劑量組 圖1　通補(bǔ)消積飲含藥血清作用A549細(xì)胞48 h后Cyclin D1蛋白表達(dá)結(jié)果

4討論

細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,在細(xì)胞周期的正常調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Cyclin D1是G1期細(xì)胞周期素，其與細(xì)胞周期依賴性激酶4(CDK4)或細(xì)胞周期依賴性激酶6(CDK6)結(jié)合呈復(fù)合物,激活CDK4的蛋白激酶活性，促使Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，導(dǎo)致DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期[2]。因此，如果Cyclin D1發(fā)生過(guò)度表達(dá)，引起細(xì)胞增殖的周期失調(diào)，細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Cyclin D1基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)異常常見(jiàn)于肺腺癌和鱗癌[3]。研究證實(shí)[4-8]，Cyclin D1在非小細(xì)胞肺癌組織中存在過(guò)度表達(dá)。

中晚期非小細(xì)胞肺癌的主要證型是氣陰兩虛型[9-10]。氣陰兩虛貫穿于肺癌的始終，與肺臟的生理特性有密切相關(guān)[11]。通補(bǔ)消積飲由生曬參、麥冬、黃芪、北沙參、全瓜蔞、貝母、薏苡仁、白術(shù)、半夏、陳皮、半枝蓮、白花蛇舌草、山慈菇、蚤休、大黃、莪術(shù)、甘草，共17味藥物組成。通補(bǔ)消積飲是針對(duì)中晚期肺腺癌病人以氣陰兩虛為主兼痰、瘀、毒結(jié)的病因病機(jī)而擬定的經(jīng)驗(yàn)方。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通補(bǔ)消積飲能明顯下調(diào)A549細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)。通補(bǔ)消積飲對(duì)A549細(xì)胞抑制增殖的可能機(jī)制是：通補(bǔ)消積飲能明顯降低Cyclin D1蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)，減少Cyclin D1蛋白與CDK4或CDK6的結(jié)合，從而抑制CDK4的蛋白激酶活性和Rb蛋白的磷酸化，使DNA的合成受阻，最終表現(xiàn)為對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制，實(shí)現(xiàn)其治療肺癌的目的。

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