黃花草木犀總皂苷體外抗腫瘤作用研究

嚴(yán)銘銘，吳程彥，尉忠賢，付美麗，劉暢，田雙，邵帥*

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

摘要：目的以MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620幾種腫瘤細(xì)胞株為研究對(duì)象，體外加入黃花草木犀總皂苷，研究黃花草木犀總皂苷對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用。方法CCK-8法檢測(cè)黃花草木犀總皂苷對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用。結(jié)果黃花草木犀總皂苷對(duì)MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620腫瘤細(xì)胞株均有細(xì)胞毒作用，但對(duì)正常細(xì)胞株的毒性作用則明顯較低，對(duì)MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620作用72 h時(shí)的IC50分別為0.45、0.73、1.05、1.17、1.19 mg/mL。結(jié)論黃花草木犀總皂苷能有效抑制5種腫瘤細(xì)胞株增殖，且對(duì)正常細(xì)胞株毒性較小，篩選出對(duì)黃花草木犀總皂苷最敏感的腫瘤細(xì)胞株為MCF-7、PC3M腫瘤細(xì)胞，值得進(jìn)一步開展基礎(chǔ)及臨床研究。

關(guān)鍵詞：CCK-8;黃花草木犀總皂苷;細(xì)胞增殖

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.029

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)02-0191-02

基金項(xiàng)目:吉林省自然科學(xué)

作者簡(jiǎn)介:嚴(yán)銘銘(1968-),女,教授,主要從事中藥創(chuàng)新藥物研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-12-20)

*通信作者:邵帥,電話-(0431)86172337,電子信箱-yanmm595@126.com

Anti-cancer effect of external saponins frommelilotusofficinalisL.

YAN Mingming,WU Chengyan,WEI Zhongxian,FU Meili,LIU Chang,TIAN Shuang,SHAO Shuai*

(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of the saponins from melilotus officinalis L.on MCF-7,PC3M,ACC,A549 and SW620 cell lines proliferation in external.MethodsThe inhibitory effects of 5 cell proliferation were evaluated by CCK-8.ResultsThe results showed that the saponins from melilotus officinalis L.inhibited the growth in MCF-7,PC3M,ACC,A549 and SW620 cells.After 72 hours,The IC50 was 0.45,0.73,1.05,1.17 and 1.19 mg/mL,and displayed the no toxicity to normal cell.ConclusionThe saponins from melilotus officinalis L.can inhibit cell proliferation of five cell lines and it has low toxicity effect to normal cell line.we screened out the most sensitive cell lines which were MCF-7 and PC3M cancer cell lines.It is worth for further basic and clinical research.

Keywords:CCK-8;saponins of melilotus officinalis L.;cell proliferation

黃花草木犀(Melilotusofficinalis(L.))為長(zhǎng)白山民間藥材，具有散瘀消腫、抗菌消炎、清熱解毒、解痙止痛等確切療效，黃花草木犀在國(guó)外應(yīng)用較多，并為《歐洲藥典》(第5版)收錄,在英國(guó)作為抗水腫及調(diào)節(jié)腎靜脈循環(huán)的藥物，在荷蘭、德國(guó)、波蘭及奧地利作為抗聚集、抗氧化劑和保肝的正式植物藥[1-3]。為深入發(fā)掘開發(fā)黃花草木犀這一長(zhǎng)白山民間藥用資源，我們對(duì)黃花草木犀進(jìn)行了化學(xué)及藥理學(xué)研究，從中分離出含量為50%以上黃花草木犀總皂[4]。本研究應(yīng)用Cell Counting Kit-8簡(jiǎn)稱CCK-8[5]法測(cè)定黃花草木犀總皂苷對(duì)6種腫瘤細(xì)胞株的增殖作用即藥物半數(shù)抑制濃度(50% concentration of inhibition IC50)，從中篩選出高效低毒的腫瘤細(xì)胞株，為黃花草木犀總皂苷對(duì)腫瘤的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料

1.1細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞株(人乳腺癌細(xì)胞)，PC3M細(xì)胞株(人前列腺癌細(xì)胞)，ACC細(xì)胞株(人腮腺癌細(xì)胞)，A549細(xì)胞株(人肺癌細(xì)胞)，SW620細(xì)胞株(人腸癌細(xì)胞),293T細(xì)胞株(人正常腎上皮細(xì)胞)均來(lái)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理實(shí)驗(yàn)室，于液氮中保存復(fù)蘇后使用。

1.2藥物黃花草木犀總皂苷由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心研制，純度為90%以上，批號(hào)20130507。

2方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。即時(shí)換液，待細(xì)胞接近匯流80%時(shí)，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。細(xì)胞凍存采用緩慢冷凍。凍存液中各成分比例為FCS∶H-DMEM∶DMSO=2∶7∶1，細(xì)胞濃度為5×105～1×106/mL,細(xì)胞經(jīng)過(guò)4 ℃30 min，-20 ℃1 h,-80 ℃過(guò)夜，置于液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇采用速融法。將細(xì)胞在37 ℃水浴中迅速融化，離心1 000 r/min，5 min，接種細(xì)胞于含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基中。

2.2采用CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，終止消化后，離心1 000 r/min，5 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/mL，接種于96孔板，100 μL/孔。待細(xì)胞貼壁后，輕輕吸掉培養(yǎng)基開始加藥。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及不同濃度藥物組，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2孵育72 h后，輕輕吸掉培養(yǎng)基,每實(shí)驗(yàn)孔加10 μLCCK-8試劑和100 μL含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2孵育2.5 h后，在Bio-red 550酶標(biāo)儀上，在490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度值(A值)。按公式計(jì)算黃花草木犀總皂苷對(duì)各腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(inhibitory rate,IR)=1—[(加藥組A值—空白對(duì)照A值)/(陰性對(duì)照A值)—空白對(duì)照A值)]×100%，計(jì)算出藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，得出IC50值。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

3結(jié)果

黃花草木犀總皂苷對(duì)MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620幾種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，其IC50分別為0.45、0.73、1.05、1.17、1.19 mg/mL，但對(duì)正常細(xì)胞株293T沒(méi)有毒性作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　黃花草木犀總皂苷對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞增殖的影響

4結(jié)論

黃花草木犀總皂苷對(duì)MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620幾種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用，其中對(duì)MCF-7、PC3M腫瘤細(xì)胞株抑制作用較強(qiáng)，并對(duì)正常細(xì)胞株無(wú)細(xì)胞毒作用，表現(xiàn)出較好選擇性，這預(yù)示黃花草木犀總皂苷在治療人乳腺癌及人前列腺癌方面具有較好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖，原理為：該試劑中含有WST-8，它在電子載體1-Methoxy PMS作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲硂染料(Formazan)。生成的甲硂物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。在應(yīng)用過(guò)程中無(wú)需有機(jī)溶劑和放射性同位素參與，與傳統(tǒng)的MTT法[6]相比較具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)損失、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

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