■龐 潔 方 旭 王超群 宋子域 黃 巖 趙建國

（海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南?？?570228）

1893年，德國萊比錫醫(yī)生研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞免疫后卵黃中存在特異性抗體。然而，直到1996年，卵黃抗體技術(shù)才逐漸獲得國際認(rèn)可，研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，在病原體診斷、飼料與食品添加劑、新藥與獸藥開發(fā)、食品工程及抗體技術(shù)等領(lǐng)域獲得了廣泛研究。當(dāng)前，有關(guān)卵黃抗體的蛋雞飼養(yǎng)、產(chǎn)蛋管理、免疫程序、提取程序、抗體特性鑒定等都獲得了突破性進(jìn)展。然而，制備卵黃抗體的蛋雞免疫程序較為復(fù)雜，包括基礎(chǔ)免疫、加強(qiáng)免疫和強(qiáng)化免疫三個(gè)階段。高頻注射免疫對蛋雞造成的免疫應(yīng)激往往造成生產(chǎn)性能下降[1]。免疫應(yīng)激是指由于免疫操作而使蛋雞受到強(qiáng)烈刺激或處于緊張狀態(tài)下的非特異性全身反應(yīng)，它是機(jī)體防御外界環(huán)境不良影響的一種生理生化表現(xiàn)。維生素E不僅是機(jī)體重要的脂溶性維生素，而且具有抗氧化、維持生育和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等諸多生物學(xué)功能[2]。本研究以開產(chǎn)至產(chǎn)蛋高峰期間蛋雞為試驗(yàn)動物，研究免疫應(yīng)激對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)以及免疫機(jī)能的影響，同時(shí)探討日糧中添加不同水平維生素E對免疫應(yīng)激的緩解作用，為卵黃抗體高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與管理

選取同批次、同條件飼養(yǎng)的19周齡，體重相近非免疫褐羽蛋雞180只，飼養(yǎng)于海南大學(xué)秀英農(nóng)場。雞舍封閉，配有控溫調(diào)濕設(shè)備，按常規(guī)程序衛(wèi)生消毒，每日采光良好，人工定期清糞。飼養(yǎng)方式采用3層立體籠養(yǎng)，每籠1只雞，全天不間斷自由飲水，統(tǒng)一飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，自由采食，分別在上午8:30和下午4:30飼喂，正式試驗(yàn)時(shí)間60 d，其中預(yù)飼期7 d，雞群健康狀況良好，產(chǎn)蛋狀況均正常?；A(chǔ)日糧組成及其營養(yǎng)水平含量見表1，由海南正大公司按試驗(yàn)要求生產(chǎn)。維生素E由海南正大公司提供，生產(chǎn)批號：VX1403122410。

表1 蛋雞基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 免疫疫苗與程序

豬乙型腦炎弱毒苗：毒株為SA14-14-2，湖南中岸生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：獸藥生字（2015）180021080，-15 ℃保存，有效期18個(gè)月。規(guī)格：每瓶10頭份，每頭份病毒含量≥105-7TCID50。疫苗稀釋液為磷酸鹽緩沖稀釋液，隨疫苗購買。

免疫方法：選取蛋雞左、右胸部為注射部位，注射器應(yīng)與胸骨成平行方向，針頭與一側(cè)胸肌成30度角插入肌肉，避免刺入內(nèi)臟，根據(jù)注射劑量合理分點(diǎn)分配注射。免疫時(shí)間為下午4：00，操作時(shí)動作輕微，每只雞一個(gè)針頭。

免疫程序：首免10 d后，每隔10 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，最后一次為強(qiáng)化免疫，具體見表2。

表2 豬乙腦卵黃抗體蛋雞免疫程序

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將180只蛋雞隨機(jī)分成6組，每組30只。19周齡分組并配制日糧，同時(shí)記錄生產(chǎn)性能，20周齡開始飼喂不同水平維生素E試驗(yàn)日糧。對照組整個(gè)試驗(yàn)期間，正常飼養(yǎng)，無免疫應(yīng)激，日糧中添加維生素E 30 mg/kg。試驗(yàn)組1～5按照免疫程序注射乙腦疫苗，維生素E添加水平依次為30、60、90、120 mg/kg和150 mg/kg。

1.4 測定指標(biāo)

蛋雞不良反應(yīng)發(fā)生率(%)=(每組注射部位表現(xiàn)輕微腫脹蛋雞數(shù)/每組蛋雞總數(shù)×免疫次數(shù))×100；

死淘率(%)=每組死亡蛋雞數(shù)量/每組蛋雞總數(shù)×100；

日產(chǎn)蛋率(%)=日產(chǎn)蛋總數(shù)/蛋雞總數(shù)×100；

平均耗料量(g/只)=(投料量-剩余料量)/蛋雞總數(shù)；

平均蛋重(g/個(gè))=總蛋重/總蛋數(shù)；

料蛋比=耗料量/總蛋重；

蛋殼厚度(mm)：蛋殼厚度儀測定；

蛋黃比率(%)=蛋黃重/蛋重×100；

蛋黃提取與效價(jià)檢測：分別于免疫前一天、免疫后第10、20、30、40、50 d和60 d在各試驗(yàn)組取10枚雞蛋，每枚雞蛋吸取5ml蛋黃，加入等量生理鹽水做1∶1稀釋，然后加入等量氯仿萃取30 min，4℃、5 000 r/min離心5 min，吸出上層水相用于抗體檢測?？贵w效價(jià)檢測方法為加入pH值為9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中，每孔25 μl；再加入25 μl 1∶10血清于清潔干燥96孔V型微量板第1孔，依次2倍倍比稀釋，充分混勻，最后一孔棄掉25 μl。再于每孔中加入4單位血凝素25 μl，充分混勻，加蓋置室溫1 h；最后于每孔中加入50 μl 0.5%的鵝紅細(xì)胞懸液，充分混合，室溫1 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：HI效價(jià)大于1∶20判為陽性。試驗(yàn)孔全部呈現(xiàn)+++～++++的紅細(xì)胞凝集為陰性結(jié)果，陽性結(jié)果以++凝集孔稀釋倍數(shù)作為該份血清的終點(diǎn)抑制效價(jià)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素E緩解免疫應(yīng)激對蛋雞健康狀況的影響

試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組均有蛋雞注射部位出現(xiàn)輕微腫脹，試驗(yàn)組1～5不良反應(yīng)發(fā)生率依次為1.3%、0.7%、0.7%、1.3%和0.7%，靜脈注射未見異常，各組死淘率均為0。Sunder等認(rèn)為維生素E用于蛋雞生產(chǎn)安全范圍較廣[3]。試驗(yàn)中蛋雞日糧添加維生素E范圍為30～180 mg/kg，未見蛋雞異常反應(yīng)。張丹俊等認(rèn)為出現(xiàn)不良反應(yīng)是由于個(gè)別蛋雞（過敏性體質(zhì)）對注射疫苗應(yīng)激反應(yīng)不同，注射疫苗后機(jī)體易發(fā)生局部炎癥反應(yīng)或較強(qiáng)烈的毒副應(yīng)激反應(yīng)[4]。實(shí)際上，不良反應(yīng)發(fā)生與死亡多與蛋雞體質(zhì)與注射方法有關(guān)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)多發(fā)生于首次胸肌免疫注射，癥狀不久就自行消失。蛋雞免疫過程中造成死亡的原因多與注射過深或刺破肝臟出血導(dǎo)致雞急性死亡有關(guān)。本次試驗(yàn)過程中蛋雞不良反應(yīng)發(fā)生率和死淘率均較低，說明日糧中維生素E添加量對蛋雞健康狀況無負(fù)面影響。同時(shí)，該免疫程序?qū)Φ半u健康狀況影響輕微，可以作為生產(chǎn)卵黃抗體免疫程序。

2.2 維生素E緩解免疫應(yīng)激對蛋雞生產(chǎn)性能的影響(見表3)

表3 維生素E緩解免疫應(yīng)激對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

試驗(yàn)組1與對照組比較，產(chǎn)蛋率下降9.17%，日采食量下降7.44 g/(d·只)，料蛋比提高0.11，差異顯著（P＜0.05）。可見，免疫應(yīng)激對蛋雞生產(chǎn)性能的影響較大，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降，料蛋比提高。由于免疫過程中蛋雞易受到驚嚇，導(dǎo)致生長、繁殖和免疫機(jī)能下降。因此，蛋雞表現(xiàn)生長緩慢，產(chǎn)蛋量下降，飼料利用率降低。王傳強(qiáng)等認(rèn)為一般單次免疫且免疫間隔時(shí)間較長，產(chǎn)蛋雞群體質(zhì)良好、疫苗注射方法正確的情況下，較少出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降等不良反應(yīng)[1]。首次免疫過程中，蛋雞采食量下降（3%左右），飲水正常，產(chǎn)蛋量下降（3%左右），3 d后恢復(fù)正常。由于本試驗(yàn)在60 d內(nèi)間隔6次進(jìn)行免疫注射，屬于高頻免疫，對蛋雞影響較大，生產(chǎn)性能下降。試驗(yàn)組1至試驗(yàn)組5隨著維生素E添加量的增加，蛋雞的產(chǎn)蛋率與采食量變化較小，差異不顯著(P＞0.05)。這個(gè)結(jié)論與咼于明等研究日糧中添加不同水平維生素E對蛋雞的采食量、飼料轉(zhuǎn)化率無顯著影響結(jié)論相似[5]。張桂芝等認(rèn)為，隨著蛋雞年齡的增長，機(jī)體自身抵抗力增強(qiáng)，維生素E通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力而提高生產(chǎn)性能的作用減弱[6]。本試驗(yàn)所選用的蛋雞，其自身的生產(chǎn)性能已經(jīng)趨于穩(wěn)定，因此維生素E添加水平對其影響不明顯。

2.3 維生素E緩解免疫應(yīng)激對蛋雞蛋品質(zhì)的影響(見表4)

表4 維生素E緩解免疫應(yīng)激對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

免疫應(yīng)激打亂了雞群正常產(chǎn)蛋規(guī)律，容易造成腹中雞蛋破裂、腹膜炎等病癥。破蛋率與蛋黃比重是卵黃抗體生產(chǎn)過程中兩個(gè)比較重要的參數(shù)。各試驗(yàn)組與對照組比較，蛋重、蛋殼厚度、蛋黃比率三項(xiàng)指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。表明維生素E對免疫應(yīng)激狀態(tài)下的蛋品質(zhì)緩解作用不明顯。生產(chǎn)中，蛋品質(zhì)受很多因素的影響，除了品種和遺傳等原因之外，營養(yǎng)因素影響最大。劉世發(fā)等研究免疫應(yīng)激對蛋雞鈣磷代謝的影響中認(rèn)為免疫應(yīng)激對蛋殼品質(zhì)和鈣磷代謝無顯著影響[7]。因此維生素E的緩解作用并不明顯。

2.4 維生素E緩解蛋雞免疫應(yīng)激對乙腦卵黃抗體產(chǎn)生規(guī)律的影響(見表5)

由表5可知，各試驗(yàn)組免疫前一天，乙腦抗體效價(jià)均為0。免疫后第10、20 d檢測卵黃抗體效價(jià)各試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。免疫后40、50 d和60 d檢測卵黃抗體效價(jià)，試驗(yàn)組4、5與試驗(yàn)組1、2、3比較差異顯著（P＜0.05），但是組間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組 1、2、3，60 d 抗體平均效價(jià)分別為6.5log2、6.4log2和6.5log2，差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組4與5抗體效價(jià)分別為7.2log2和7.3log2，兩組之間差異不顯著(P＞0.05)，但與試驗(yàn)組1、2、3比較差異顯著（P＜0.05）。表明日糧中添加維生素E 120 mg/kg或150 mg/kg對蛋雞體液免疫有促進(jìn)作用。維生素E作為免疫調(diào)節(jié)劑可以緩解各種應(yīng)激引起的不良影響。韓慕俊等研究指出，蛋雛雞飼糧中維生素E水平在40 IU/kg以上時(shí)可以提高血液中新城疫、禽流感的抗體滴度[8]。陳艷君等研究指出，飼糧中維生素E添加量為15 IU/kg時(shí)新城疫抗體滴度最高[9]。

表5 維生素E緩解蛋雞免疫應(yīng)激對乙腦抗體產(chǎn)生規(guī)律的影響（log2）

3 討論

維生素E是動物機(jī)體不可或缺的脂溶性維生素，具有促進(jìn)蛋雞繁殖性能，提高產(chǎn)蛋率、抗氧化、促免疫，增強(qiáng)抗應(yīng)激、抗病能力的作用。蛋雞飼料中應(yīng)用最為廣泛的商品維生素E是含量為50%的DL-α-生育酚醋酸酯。以生產(chǎn)卵黃抗體為目的蛋雞生產(chǎn)過程中，免疫應(yīng)激是不可避免的。蛋雞處于免疫應(yīng)激時(shí)期對維生素E的營養(yǎng)需求量應(yīng)綜合考慮蛋雞品種、飼養(yǎng)環(huán)境、基礎(chǔ)營養(yǎng)水平等綜合因素，是近年來研究的熱點(diǎn)。韓慕俊等研究表明，在沒有應(yīng)激因素存在時(shí)蛋雞日糧中維生素E需要量是很低的，免疫應(yīng)激的強(qiáng)度不大而且時(shí)間不長，只能導(dǎo)致短時(shí)間的采食量下降，對生產(chǎn)性能沒有太大的影響[8]。美國NRC（1994）推薦蛋雞維生素E的最低需要量為5 mg/kg。我國農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑安全使用規(guī)范》對蛋雞飼料維生素E推薦劑量為10～30 mg/kg，主要是用于促進(jìn)蛋雞繁殖性能，提高產(chǎn)蛋率。另有研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼料中添加大劑量維生素E，可以使蛋雞體內(nèi)抗體水平升高，吞噬細(xì)胞功能增強(qiáng)。給肉仔雞飼喂維生素E，可以提高機(jī)體對氣管炎病毒、綿羊紅細(xì)胞和新城疫病毒的體液免疫效果[10-12]，在肉仔雞日糧中添加80 IU/kg維生素E，感染性卵黃囊病毒的細(xì)胞免疫效果最佳[13]。大多數(shù)研究者認(rèn)為維生素E毒性輕微，在非應(yīng)激狀態(tài)下，高劑量的維生素E雖然對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)無影響，但有可能抑制禽類免疫系統(tǒng)。因此，不可任意加大維生素E添加量。本試驗(yàn)添加維生素E范圍為30～150 mg/kg主要是兼顧蛋雞繁殖機(jī)能與免疫機(jī)能。

4 結(jié)論

高頻免疫程序可導(dǎo)致蛋雞生產(chǎn)性能下降，日糧中添加30～150 mg/kg維生素E對緩解蛋雞生產(chǎn)性能與蛋品質(zhì)影響不大，120或150 mg/kg維生素E可以有效提高蛋雞抗體效價(jià)。