■楊 柳 王 磊 張 一 陳宇飛

（吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130507）

豆粕是大豆經(jīng)提取豆油后得到的副產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)成分齊全且均衡。發(fā)酵豆粕是通過(guò)微生物發(fā)酵，去除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)性能和使用價(jià)值，擴(kuò)大豆粕的使用范圍[1]。

我國(guó)飼料工業(yè)生產(chǎn)中蛋白質(zhì)飼料資源嚴(yán)重不足，高品質(zhì)動(dòng)物蛋白原料魚(yú)粉主要依賴進(jìn)口[2]，而目前全球性魚(yú)類資源的日趨減少，直接導(dǎo)致魚(yú)粉價(jià)格直接上漲，豆粕代替魚(yú)粉已成必然趨勢(shì)。目前對(duì)豆粕固態(tài)發(fā)酵較多地研究了單菌發(fā)酵和兩種細(xì)菌混合發(fā)酵。

劉喚明等[3]研究了由枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵豆粕的發(fā)酵工藝，提高了發(fā)酵豆粕的水解度；姚琨等[4]綜述了微生物發(fā)酵法。

制備發(fā)酵豆粕的優(yōu)缺點(diǎn)，提出了小肽含量、各種氨基酸含量以及發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化需要標(biāo)識(shí)等；劉曉艷等[5]以高溫豆粕為原料,研究了枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵法制備多肽飼料的最優(yōu)發(fā)酵工藝；王平[6]在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下,確定了乳酸菌和枯草芽孢桿菌的最佳接種菌齡，得出生物降解是去除抗原蛋白最有效的方法；劉洋等[7]利用4株實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵，得出米曲霉在混合體系中對(duì)其含量的影響較大。

本文參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，選擇可溶性蛋白和大豆球蛋白為指標(biāo)，考核豆粕發(fā)酵后可利用蛋白的增加量和抗?fàn)I養(yǎng)蛋白的減少量。采用多菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕，對(duì)其工藝進(jìn)行研究，多菌混合發(fā)酵可以彌補(bǔ)單菌發(fā)酵的不足，更好地提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)和降低生長(zhǎng)抑制因子。優(yōu)化工藝條件，為發(fā)酵豆粕更好地應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：益海嘉里公司購(gòu)得，化學(xué)試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。

菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌。保存于吉林工商學(xué)院食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，菌種含量為1×108CFU/ml，菌種比例為1∶1∶1。

設(shè)備：SKD-2000凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器廠；SPH2102C立式恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；101-2型干燥箱：上海安競(jìng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ.SG46-280S型手提式滅菌器，西化儀（北京）科技有限公司；BCD-271海爾冰箱：青島海爾股份有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰。

1.2 方法

1.2.1 豆粕發(fā)酵工藝

采用張雁平等[8]豆粕發(fā)酵工藝方法進(jìn)行研究。

1.2.2 可溶性蛋白的測(cè)定

按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBAT19541-2004獲得上清液[9]，通過(guò)茚三酮比色法測(cè)定上清液中游離氨基酸的含量。

1.2.3 大豆球蛋白的測(cè)定

采用王碩[10]酶聯(lián)免疫吸附方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，初步確定菌種添加量5%、發(fā)酵時(shí)間6 d、發(fā)酵溫度40℃、初始含水量40%、外源酶的添加量0.3%、初始pH值為7共6個(gè)因素，以可溶性蛋白和大豆球蛋白為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)蛋白含量影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接菌量對(duì)蛋白的影響（見(jiàn)圖1）

由圖1可知：可溶性蛋白含量隨著接種量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，即菌種含量過(guò)多或過(guò)少都對(duì)蛋白影響較大；大豆球蛋白的含量正好相反，當(dāng)含量為4%時(shí)達(dá)到最低值，之后開(kāi)始緩慢上升，因此，確定菌種含量為4%時(shí)，效果最佳。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白的影響（見(jiàn)圖2）

由圖2可知：可溶性蛋白的曲線呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。1～3 d曲線上升明顯，是在多種酶的作用下，大分子蛋白的降解速度較快，而酶量減少造成了曲線的平緩，5 d以后，可溶性蛋白急劇增多，說(shuō)明在微生物的作用下，大分子蛋白開(kāi)始全面降解；大豆球蛋白的曲線總體呈下降趨勢(shì)，2～4 d是大豆球蛋白降解高峰期，4 d以后，大豆球蛋白含量相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明大豆蛋白已經(jīng)降解完畢。綜合來(lái)看，發(fā)酵時(shí)間為5～7 d，較為理想。

圖1 接菌量對(duì)蛋白的影響

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白的影響（見(jiàn)圖3）

由圖3可知：可溶性蛋白曲線呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢(shì)，總體變化幅度不大，蛋白含量在110 μmol/g左右。大豆球蛋白的曲線是先下降、后上升的趨勢(shì)，說(shuō)明溫度對(duì)大豆球蛋白含量的影響較大，綜合來(lái)看，35～45℃范圍內(nèi)，兩種蛋白含量較為理想。

2.1.4 初始含水量對(duì)蛋白的影響（見(jiàn)圖4）

由圖4可知：可溶性蛋白含量呈上升趨勢(shì)，含水量在30%～60%時(shí)，可溶性蛋白含量增加明顯，說(shuō)明可溶性蛋白含量與初始含水量具有相關(guān)性，而含水量達(dá)到一定值以后，含水量的增加對(duì)可溶性蛋白含量影響不大，因?yàn)楹康脑黾哟龠M(jìn)水解酶的擴(kuò)散，造成發(fā)酵底物多孔性的降低。大豆球蛋白的含量前期呈驟然下降趨勢(shì)，含水量達(dá)40%以后，大豆球蛋白的含量不再變化。綜合兩個(gè)因素，初始含水量在40%～60%較為理想。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白的影響

圖4 初始含水量對(duì)蛋白的影響

2.1.5 外源酶的添加量對(duì)蛋白的影響(見(jiàn)圖5)

由圖5可知：可溶性蛋白的含量呈上升趨勢(shì)，酶添加量在0.15%～0.3%時(shí)，曲線上升明顯，之后上升趨勢(shì)稍緩，說(shuō)明酶的添加量對(duì)可溶性蛋白的影響較大，但是添加量超過(guò)0.6%以后，影響效果不明顯。大豆球蛋白的含量隨著酶添加量的增加，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，酶添加量在0.3%～0.45%時(shí)，曲線最低，說(shuō)明大豆球蛋白含量最小、降解最快。綜合兩種蛋白的變化情況，0.3%～0.6%的酶添加量較為理想。

圖5 外源酶的添加量對(duì)蛋白的影響

2.1.6 初始pH值對(duì)蛋白的影響（見(jiàn)圖6）

圖6 初始pH值對(duì)蛋白的影響

由圖6可知：隨著pH值增加，可溶性蛋白呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而大豆球蛋白則是先降低后逐漸升高的趨勢(shì)，可見(jiàn)，pH值對(duì)蛋白的影響較為明顯，當(dāng)pH值為6.5時(shí)最佳。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，確定菌種添加量為4%，初始pH值為6.5，選定發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始含水量、外源酶添加量四個(gè)因素，進(jìn)行4因素、3水平的正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知：對(duì)可溶性蛋白含量影響因素順序?yàn)椋築＞A＞D＞C。最佳組合為A3B2C1D2。即：發(fā)酵時(shí)間為7 d、發(fā)酵溫度40℃，初始含水量為40%、外源酶添加量為0.45%。

對(duì)大豆球蛋白含量影響因素順序?yàn)椋築＞A＞C=D。最佳組合為A3B2C3D2，即發(fā)酵時(shí)間為7 d、發(fā)酵溫度40℃，初始含水量為60%、外源酶添加量為0.45%。

從影響因素看，對(duì)大豆球蛋白含量影響因素的初始含水量與外源酶的添加量相同，因此總的影響因素順序?yàn)锽＞A＞D＞C；從最佳組合上看，初始含水量差別較大，考慮到含水量過(guò)多，會(huì)增加較大的干燥成本，確定初始含水量為40%。因此總的最佳組合為A3B2C1D2。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，菌種添加量為4%，初始pH值為6.5、發(fā)酵時(shí)間為7 d、發(fā)酵溫度40℃，初始含水量為40%、外源酶添加量為0.45%，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為可溶性蛋白的含量為168.5 μmol/g，大豆球蛋白的含量為11.2 μmol/g，效果理想。

3 結(jié)論

研究了混菌固態(tài)發(fā)酵的工藝條件，以可溶性蛋白和大豆球蛋白含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了菌種添加量為4%，初始pH值為6.5。做了發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始含水量、外源酶添加量的4因素3水平的正交試驗(yàn)，得出：最佳組合為A3B2C1D2，即發(fā)酵時(shí)間為7 d、發(fā)酵溫度40℃，初始含水量為40%、外源酶添加量為0.45%。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下可溶性蛋白的含量為168.5 μmol/g，大豆球蛋白的含量為11.2 μmol/g，效果理想。