鄧順江，黃韋華，吳林洪，張 蕾，葉 辛，劉 鵬，李騰達(dá)，龍曙萍，錢(qián) 琤，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003；4.解放軍第100醫(yī)院，江蘇蘇州 215007)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)被認(rèn)為是一種由自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增加以及生成減少引起的疾病，臨床上以血小板計(jì)數(shù)減少和皮膚黏膜出血為特點(diǎn)[1]。但研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為ITP的發(fā)病是一個(gè)多步驟的過(guò)程，各種免疫細(xì)胞包括T,B細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞以及相關(guān)的細(xì)胞因子在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2～6]。

Micro-RNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度大約為22個(gè)核苷酸的微小非編碼RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[7]，因而參與體內(nèi)多種生理病理過(guò)程。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，最近有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在ITP的發(fā)病中也發(fā)揮了重要的作用[8～10]。例如，miR-155在ITP患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中表達(dá)上調(diào)，而在治療后表達(dá)下調(diào)[11]；miR-302c-3p，miR-483-5p等miRNA在ITP兒童患者的血漿中表達(dá)水平升高。然而，ITP患者中具體有哪些miRNA表達(dá)異常目前還有待進(jìn)一步研究，miRNA在ITP的發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制至今還未闡明。

我們前期通過(guò)基因芯片的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-205在ITP患者中表達(dá)明顯上調(diào)，此次研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)患者PBMC中miR-205的表達(dá)水平，并分析其與患者血小板計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供新線索。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取長(zhǎng)海醫(yī)院2014～2015年收治的ITP患者外周抗凝全血43例，其中男性21例，女性22例，年齡為22～63歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國(guó)專家共識(shí)(修訂版)”[12]，且均未接受過(guò)相關(guān)治療。同時(shí)選取體檢中心健康對(duì)照組38例，其中男性20例，女性18例，年齡為20～62歲，每例標(biāo)本大約2 ml。ITP組和健康對(duì)照組在年齡和性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑和儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒(購(gòu)自takara公司)；Trizo試劑(Invitrogen life technologies)；淋巴細(xì)胞分離液，氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇，異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DEPC水，dd水，紅細(xì)胞裂解液，2 ml EP管，200 μl EP管，Centrifuge 5417 R低溫高速離心機(jī)，純水儀，紫外分光光度計(jì)(ND-1000，Nanodrop Technologies)，梯度PCR儀(ABI)，PCR儀(ABI7500)。

1.3 檢測(cè)方法 外周血PBMC的分離和總RNA的提取：用淋巴細(xì)胞分離液從EDTA-K2抗凝的2 ml靜脈中分離PBMC，用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)(ND-1000，Nanodrop Technologies)檢測(cè)所提取RNA的濃度及純度。

CDNA的合成以及Real-timePCR反應(yīng)miR-205以及U6的特異引物由上海賽百勝公司設(shè)計(jì)和合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用定量PCR試劑盒進(jìn)行核酸擴(kuò)增，試劑盒購(gòu)自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄和PCR條件嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 ITP患者分組標(biāo)準(zhǔn) 選取的未經(jīng)治療的ITP患者歸為初診組(naive ITP group)，ITP患者的治療符合國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[12]，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后：血小板>100×109/L且病情穩(wěn)定的患者歸完全緩解組(Complete remission group，CR group)，共14例；血小板<100×109/L的患者或治療有效但復(fù)發(fā)的患者歸不完全緩解組(incmplete remission group，IR group)，共29例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Studentttests)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)miR-205的表達(dá) 與38例正常對(duì)照組相比，43例ITP初診患者(Naive ITP)PBMC miR-205的表達(dá)水平更高(1.81±0.48 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.31，P<0.01)；治療后不完全緩解組(IR group)和初診患者相比，miR-205的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.112)，與正常對(duì)照組相比，則表達(dá)升高(1.63±0.65 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.2，P<0.01)；14例治療后完全緩解組(CR group)治療后(After treatment)PBMC miR-205的表達(dá)低于治療前(Before treatment)的表達(dá)水平(1.07±0.43 vs 1.91±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.68，P<0.01)。

2.2 相關(guān)性分析 ITP患者PBMC miR-205與血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ITP患者PBMC miR-205與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.069 6，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

3 討論

MicroRNA是一種微小(19～23個(gè)核苷酸)的單鏈非編碼RNA，通過(guò)結(jié)合mRNA的3’非翻譯序列區(qū)(3’untranslated sequence region，3’-UTR)而使mRNA降解或者抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，一個(gè)microRNA可能結(jié)合多個(gè)mRNA，一個(gè)mRNA也可能被多個(gè)microRNA所調(diào)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)microRNA在多種疾病狀態(tài)下存在異常的表達(dá)，提示其參與了人體的發(fā)病過(guò)程。miR-205的編碼基因LOC642587定位于染色體1q32.2區(qū)，miR-205的前體位于LOC642587的第二個(gè)內(nèi)含子和第三個(gè)外顯子鏈接的區(qū)域，是一個(gè)高度保守的microRNA，在多種疾病中都表現(xiàn)出異常的表達(dá)，比如Duan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-205通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因SMAD2而抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，miR-205的表達(dá)低于癌旁組織。有研究[15，16]發(fā)現(xiàn)miR-205抑制其靶基因MLL-AF4的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而MLL-AF4是一種可以引起急性白血病的致癌基因，miR-205高表達(dá)的最終結(jié)果是抑制細(xì)胞的增殖，這給急性白血病的治療找到了新的突破口。Hu等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-205通過(guò)抑制其靶基因VEGFA和FGF2從而增加了乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度。

圖1 原發(fā)性血小板減少癥(ITP)患者PBMC miR-205表達(dá)水平與血小板計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性

ITP是臨床上常見(jiàn)的由血小板減少和破壞增多而引起的自身免疫性血液系統(tǒng)疾病。血小板的數(shù)量在一定程度上反映了TIP的嚴(yán)重程度，患者血小板計(jì)數(shù)結(jié)果越低，表明患者病情越重，反之則病情相對(duì)較輕。本次研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC中miR-205表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，并且miR-205的表達(dá)水平與患者外周血血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，這提示miR-205可能參與了ITP的發(fā)病，并且可能與ITP 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，癥狀越嚴(yán)重的患者，其miR-205的表達(dá)水平也越高。另外我們對(duì)43例ITP初診患者進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)29例未完全緩解組miR-205的表達(dá)水平和初診時(shí)相比基本未改變，而14例完全緩解組治療后miR-205的表達(dá)水平與治療前相比，顯著降低，這也提示了miR-205與ITP的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。但miR-205是如何影響血小板的數(shù)量的，是作用于哪個(gè)靶基因以及通過(guò)什么信號(hào)通路而參與到ITP的發(fā)病與預(yù)后還有待進(jìn)一步探索。

[1] Wang T，Wang Z，Yang R．Thrombopoietic growth factors in the treatment of immune thrombocytopenic purpura[J]．Crit Rev Oncol Hematol，2011，77(3)：172-183．

[2] Hu Y，Li H，Zhang L，et al．Elevated profiles of Th22 cells and correlations with Th17 cells in patients with immune thrombocytopenia[J]．Hum Immunol，2012，73(6)：629-635．

[3] Cao J，Chen C，Li L，et al．Effects of high-dose dexamethasone on regulating interleukin-22 production and correcting Th1 and Th22 polarization in immune thrombocytopenia[J]．J Clin Immunol，2012，32(3)：523-529．

[4] Wang T，Zhao H，Ren H，et al．Type 1 and type 2 T-cell profiles in idiopathic thrombocytopenic purpura[J]．Haematologica，2005，90(7)：914-923．

[5] Li X，Zhong H，Bao W，et al．Defective regulatory B-cell compartment in patients with immune thrombocytopenia[J]．Blood，2012，120(16)：3318-3325．

[6] 葉 辛，石 磊，谷明莉，等．原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者顆粒溶素、顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)及臨床意義[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，29(1)：20-23．

Ye X,Shi L,Gu ML,et al.Expression of granzyme B,granulysin and perforin from patients with primary immune thrombocytopenia[J]．J Mod Lab Med，2014，29(1)：20-23．

[7] Bartel DP．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J]．Cell，2004，116(2)：281-297．

[8] Sui T，Ma L，Li X，et al．Plasma microRNA profile in immune thrombocytopenia：screening and verification[J]．National Medical Journal of China，2014，94(14)：1083-1086．

[9] Bay A，Coskun E，Oztuzcu S，et al．Plasma microRNA profiling of pediatric patients with immune thrombocytopenic purpura[J]．Blood Coagul Fibrinolysis，2014，25(4)：379-383．

[10] Jernás M，Nookaew I，Wadenvik H，et al．MicroRNA regulate immunological pathways in T-cells in immune thrombocytopenia (ITP)[J]．Blood，2013，121(11)：2095-2098．

[11] Qian BH，Ye X，Zhang L，et al．Increased miR-155 expression in peripheral blood mononuclear cells of primary immune thrombocytopenia patients was correlated with serum cytokine profiles[J]．Acta Haematol，2015，133(3)：257-263．

[12] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液分會(huì)血栓與止血學(xué)組．成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國(guó)專家共識(shí)(修訂版)[J]．中華血液學(xué)雜志，2011，32(3)：214-216．

Hemostasis and Thrombosis Group,Hematology Society,Chinese Medical Association.Consensus of Chinese experts on diagnosis and treatment of adult primary immune thromboaytopenia[J]．Chinese Journal of Hematology，2011，32(3)：214-216．

[13] Griffiths-Jones S，Saini HK，van Dongen S，et al．miRBase：tools for microRNA genomics[J]．Nucleic Acids Res，2008，36(Database issue)：D154-158．

[14] Duan Y，Chen Q．TGF-beta1 regulating miR-205/miR-195 expression affects the TGF-beta signal pathway by respectively targeting SMAD2/SMAD7[J]．Oncology Reports，2016，36(4)：1837-1844．

[15] Dou L，Li J，Zheng D，et al．MicroRNA-205 downregulates mixed-lineage-AF4 oncogene expression in acute lymphoblastic leukemia[J]．Onco Targets and Therapy，2013，6(1)：1153-1160．

[16] Dou L，Zheng D，Li J，et al．Methylation-mediated repression of microRNA-143 enhances MLL-AF4 oncogene expression[J]．Oncogene，2012，31(4)：507-517．

[17] Hu Y，Qiu Y，Yague E，et al．miRNA-205 targets VEGFA and FGF2 and regulates resistance to chemotherapeutics in breast cancer[J]．Cell Death & Disease，2016，7(6)：e2291．