韓澤平，謝杏儀，何金花，黎毓光，呂鈺冰，周嘉彬

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣州 511400)

傳統(tǒng)中藥馬錢子(又名番木鱉)，是馬錢子科植物馬錢子的干燥成熟種子，具有抗炎消腫，散結(jié)活血，通絡(luò)止痛等功效，臨床廣泛應(yīng)用于各種風(fēng)濕頑痹、骨病和腫瘤以及癌性疼痛等治療[1]。馬錢子堿(Brucine)是從馬錢子中提取的吲哚型結(jié)構(gòu)的生物堿，是馬錢子組成和發(fā)揮藥效的主要成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿不僅可在體外顯著地抑制多種細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[2]，而且動物實(shí)驗表明馬錢子堿也可有效地抑制體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[3，4]，成為近年來抗腫瘤藥物研究的一個熱點(diǎn)。本實(shí)驗旨在研究馬錢子堿在體外對人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株KCL-22細(xì)胞的增殖及凋亡作用，為臨床治療白血病提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥物 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國ABGAB公司)，多克隆兔抗人細(xì)胞色素C(Cyt-C)，Caspase-3，Caspase-9(美國Santa Cruz公司)，Bcl-2，Bax為鼠抗人單克隆抗體(美國Cell signal公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體及二抗(辣根過氧化物酶鏈接的抗鼠IgG、辣根過氧化物酶鏈接的抗兔IgG)均購于武漢博士德生物工程有限公司。MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Promega，Westem細(xì)胞裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天生物制品有限公司。馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京中國藥品生物制品檢定所(規(guī)格：20 mg/支，批號：110706-201306)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人慢性粒細(xì)胞白血病KCL-22細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈。用含10 ml胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，置于5 ml/dl CO2，37℃，飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3天換液傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)對照品(20 mg/支)，為白色粉末狀制劑，加入少許濃鹽酸，待馬錢子堿完全溶解后加入12.625 ml無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，配制成濃度為1.280 mg/ml的儲存液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，0.22 μm微孔濾膜濾過除菌后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MTS法檢測細(xì)胞增殖 收集KCL-22細(xì)胞，RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，接種于96孔板，使細(xì)胞密度為5×104/ml，每孔100 μl。設(shè)調(diào)零組(不接種細(xì)胞)、對照組(終濃度為0 μg/ml馬錢子堿)與不同濃度的實(shí)驗組(馬錢子堿終質(zhì)量濃度分別為50，100，200，400 μg/ml)，每組設(shè)3個平行孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24，48，72 h后加入MTS 試劑10 μl/孔，37℃避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔的吸光度，計算細(xì)胞抑制率。抑制率(%)=(A對照組-A實(shí)驗組)/A對照組×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書。收集經(jīng)過0～400 μg/ml馬錢子堿處理48 h的KCL-22細(xì)胞，PBS洗滌2次，用1×Binding buffer重懸，使細(xì)胞密度為1×106/ml，吸取400 μl細(xì)胞懸液分別移入5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育15 min，繼續(xù)加入5 μl PI混勻后室溫避光孵育5 min，迅速加入400 μl 1×binding buffer，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 分別收集終濃度為0，50，100，200，400 μg/ml馬錢子堿作用48 h后的KCL-22細(xì)胞，PBS液洗3次。加入100 μl蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4℃ 12 000 r/min，離心15 min，收集上清液，運(yùn)用蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA法蛋白定量。12 g/dl十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜到醋酸纖維膜(NC)上。轉(zhuǎn)膜成功后，50 g/L脫脂奶封閉1 h，分別加入一抗Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，Cyt-C和β-actin，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL發(fā)光試劑后在暗室曝光、顯影、照相及結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 馬錢子堿對KCL-22細(xì)胞增殖的抑制作用 馬錢子堿對白血病KCL-22細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。0～400 μg/ml馬錢子堿抑制作用隨藥物濃度的增高和作用時間的延長而增大，呈明顯的劑量和時間依賴性，各實(shí)驗組(50，100，200，400 μg/ml)與對照組(0 μg/ml)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度的馬錢子堿作用24，48，72h后對白血病KCL-22細(xì)胞的增殖抑制影響

2.2 馬錢子堿對白血病KCL-22細(xì)胞的凋亡作用 不同濃度的馬錢子堿作用白血病KCL-22細(xì)胞48 h后，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡狀況，見圖2A。經(jīng)馬錢子堿(0，50，100，200，400 μg/ml)作用后，KCL-22細(xì)胞的凋亡率分別為(1.2±0.25)%，(21.4±1.1)%，(35.2±2.71)%，(52.8±3.03)%和(68.6±2.87)%，凋亡率隨著馬錢子堿濃度的增加而逐漸上升(P<0.05)。其中，以早期細(xì)胞凋亡現(xiàn)象最為明顯，并呈濃度依賴性，早期凋亡率達(dá)(50.7±1.4)%，見圖2B。

2.3 細(xì)胞凋亡的信號通路檢測 Western blotting結(jié)果顯示，馬錢子堿作用48 h后，KCL-22細(xì)胞內(nèi)Pro-Caspase-9和Pro-Caspase-3隨著藥物濃度的增加表達(dá)減弱，并逐漸出現(xiàn)切割活化條帶Cleaved-Caspase-9，Cleaved-Caspase-3。Cyt-C蛋白的表達(dá)水平隨藥物濃度增高而顯著上升，呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。進(jìn)一步檢測馬錢子堿對線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)的變化。結(jié)果表明，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)隨藥物濃度增加而減少，而Bax蛋白的表達(dá)卻呈上升趨勢，見圖3。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡代表圖；B：KCL-22細(xì)胞早期凋亡率。1)：對照組．馬錢子堿終濃度0 μg/ml；2)：馬錢子堿終濃度 50 μg/ml；3)：馬錢子堿終濃度100 μg/ml；4)：馬錢子堿終濃度200 μg/ml；5)：馬錢子堿終濃度400 μg/ml；*與對照組比較，P<0.05。

3討論腫瘤細(xì)胞可通過逃脫程序性細(xì)胞死亡而實(shí)現(xiàn)惡性增殖[5]。因此，了解程序性細(xì)胞死亡的機(jī)制并設(shè)計誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡的治療方法對治療腫瘤尤為重要。慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML) 是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，表現(xiàn)為大量的不成熟白細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)貧血、出血、感染及器官浸潤等癥狀，主要發(fā)病在青壯年群體[6]?；熓侵委烠ML的主要手段，然而，目前一線化療藥物治療的效果并不理想，唯一治愈的方法是造血干細(xì)胞移植，但造血干細(xì)胞的供者缺少且治療費(fèi)用極高，因此尋找更為高效、低毒的治療藥物成為了燃眉之急。近年來，中藥在抗腫瘤方面取得了很好的療效，利用中藥及其提取物治療白血病，已經(jīng)日益受到廣泛重視。

圖3 Western blotting法檢測不同濃度馬錢子堿處理KCL-22細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

馬錢子堿是從傳統(tǒng)中藥馬錢子中提取的吲哚型結(jié)構(gòu)的生物堿，體外研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿可顯著抑制多種細(xì)胞的增殖，是近年來抗腫瘤研究較多的一種中藥成分。已證實(shí)，馬錢子堿具有抗多種血液腫瘤作用，且在一定范圍內(nèi)其作用呈劑量和時間依賴性[7～9]。本研究以慢性粒細(xì)胞白血病KCL-22細(xì)胞作為研究對象，探討馬錢子堿對其的作用。MTS結(jié)果顯示，不同濃度馬錢子堿對KCL-22細(xì)胞有不同程度的抑制作用，且抑制率隨馬錢子堿濃度的增大而升高，隨作用時間的延長而升高，呈現(xiàn)明顯的時間-劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，又稱I型程序性細(xì)胞死亡(program rtled cell death，PCD)，是近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。本研究運(yùn)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了馬錢子堿對KCL-22細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，客觀地顯示了在0～400 μg/ml濃度范圍內(nèi)馬錢子堿濃度與凋亡率的劑量效應(yīng)關(guān)系。值得注意的是，馬錢子堿以誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡為主，并隨著藥物濃度的增強(qiáng)，早期凋亡率在一定范圍內(nèi)逐漸上升(圖2)。Bcl-2家族蛋白作為細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，其主要作用部位是線粒體外膜[10]。研究表明[11]，一般狀態(tài)下易位到線粒體的Bax不斷被線粒體上的Bcl-2等抗凋亡蛋白移回細(xì)胞質(zhì)從而保證線粒體外膜正常的通透性。當(dāng)細(xì)胞受凋亡信號刺激后，線粒體膜上的Bcl-2減少，引起B(yǎng)ax /Bcl-2比率增加，線粒體外膜通透性增大，使線粒體內(nèi)的促凋亡物質(zhì)Cyt-C等釋放到包漿中，激活Caspase家族。Caspase家族蛋白的激活在細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要角色，被認(rèn)為是誘發(fā)凋亡的直接效應(yīng)物。生理狀態(tài)下Caspase以無活性的前體形式存在，在凋亡信號刺激下，線粒體膜通透性升高釋放Cyt-C與Caspase-9前體形成凋亡小體的復(fù)合體，通過凋亡小體對線粒體通路的Caspase-9進(jìn)行募集和自切割活化活化的Caspase-9切割活化下游的Caspase-3激活級聯(lián)反應(yīng)，活化的Caspase-3能裂解DNA，使DNA片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn)形態(tài)學(xué)和生物學(xué)的改變[12]，達(dá)到抑制細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。本研究的結(jié)果表明，在馬錢子堿誘導(dǎo)KCL-22細(xì)胞凋亡的過程中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)隨著藥物濃度的增加而遞減，而凋亡蛋白Bax則相反，使得Bax/Bcl-2的比率增加，促使Cyt-C的釋放，Cyt-C的表達(dá)量呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢，最終導(dǎo)致Caspase-9，Caspase-3被切割活化，提示馬錢子堿可能通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2，釋放Cty-C，激活Caspase-9，Caspase-3依賴的內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)KCL-22細(xì)胞發(fā)生不可逆凋亡。

綜上所述，馬錢子堿處理后可抑制慢性白血病KCL-22細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，這種作用可能是通過調(diào)控Bax/Bcl-2平衡、釋放Cyt-C及激活Caspase-9，Caspase-3實(shí)現(xiàn)的。我們將進(jìn)一步探討馬錢子堿誘導(dǎo)KCL-22細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為慢性粒細(xì)胞白血病的治療提供新的思路和資料，也可更好地為臨床治療提供參考和幫助。

[1] 唐 敏，伍冠一，朱 嬋，等．馬錢子堿鎮(zhèn)痛研究進(jìn)展[J]．中草藥，2014，45(12)：1791-1795．

Tang M，Wu GY，Zhu C，et al．Research progress on analgesic properties of brucine[J]．Chinese Traditional and Herbal Drugs，2014，45(12)：1791-1795．

[2] 楊福偉，王 辰，王光明，等．Brucine抗腫瘤的分子水平研究進(jìn)展[J]．中國老年學(xué)雜志，2014，34(17)：5022-5024．

Yang FW，Wang C，Wang GM，et al．Research progre-ss on anti-tumor molecular level of Brucine[J]．Chinese Journal of Gerontology，2014，34(17)：5022-5024．

[3] Shu G，Mi X，Cai J，et al．Brucine，an alkaloid from seeds of Strychnos nux-vomica Linn，represses hepatocellular carcinoma cell migration and metastasis：the role of hypoxia inducible factor 1 pathway[J]．Toxicol Lett，2013，222(2)：91-101．

[4] Li P，Zhang M，Ma WJ，et al．Effects of brucine on vascular endothelial growth factor expression and microvessel density in a nude mouse model of bone metastasis due to breast cancer[J]．Chin J Integr Med，2012，18(8)：605-609．

[5] Qiu JX，He YQ，Wang Y，et al．Plumbagin induces the apoptosis of human tongue carcinoma cells through the mitochondria-mediated pathway[J]．Med Sci Monit Basic Res，2013(19)：228-236．

[6] Thompson PA，Kantarjian HM，Cortes JE．Diagnosis and treatment of chronic myeloid leukemia in 2015[J]．Mayo Clin Proc，2015，90(10)：1440-1454．

[7] 辛 菲，魏 武，紀(jì)愛芳，等．馬錢子堿誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制[J]．中國實(shí)驗血液學(xué)雜志，2014，22(3)：681-686．

Xin F，Wei W，Ji AF，et al．Inducing-apoptosis effect of brucine on human monocytic leukemia cell line THP-1 and its mechanism[J]．Journal of Experimental Hematology，2014，22(3)：681-686．

[8] 李仙仙，魏 武，紀(jì)愛芳，等．馬錢子堿對白血病細(xì)胞株HL-60的作用研究[J]．白血病·淋巴瘤，2013，22(10)：593-596．

Li XX，Wei W，Ji AF，et al．Effects of brucine on chronic myeloid leukemia cell line HL-60[J]．Journal of Leukemia & Lymphoma，2013，22(10)：593-596．

[9] 王海麗，魏 武，紀(jì)愛芳，等．馬錢子堿對人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用[J]．中國實(shí)驗血液學(xué)雜志，2011，19(3)：630-633．

Wang HL，We W，Ji AF，et al．Apoptosis-inducing effects of brucine on human chronic myeloid leukemia cell line K562[J]．Journal of Experimental Hematology，2011，19(3)：630-633．

[10] Ola M S，Nawaz M，Ahsan H．Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis[J]．Mol Cell Biochem，2011，351(1/2)：41-58.

[11] Ashkenazi A．Targeting the extrinsic apoptotic pathway in cancer：lessons learned and future directions[J]．J Clin Invest，2015，125(2)：487-489．

[12] Goldar S，Khaniani MS，Derakhshan SM，et al．Molecular mechanisms of apoptosis and roles in cancer development and treatment[J]．Asian Pac J Cancer Prev，2015，16(6)：2129-2144．