ARHI基因抑制U937白血病細(xì)胞株生長并誘導(dǎo)其G2/M期阻滯及凋亡*

陸英1△，劉相富1，劉玲玲2，李芳1，覃雪玲1，林東軍1, 2△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1輸血科，2血液科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討抑癌基因ARHI在急性髓細(xì)胞白血病中的表達(dá)情況，同時(shí)探索其對U937細(xì)胞生長的影響。方法: RT-PCR方法檢測急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株、人胚腎細(xì)胞293FT、白血病原代細(xì)胞以及健康志愿者血細(xì)胞中ARHI mRNA的表達(dá)情況。構(gòu)建高表達(dá)ARHI的MSCV-IRES-GFP-ARHI 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，MTT法連續(xù)8 d檢測細(xì)胞活性繪制生長曲線。新鮮培養(yǎng)基重懸U937細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡。結(jié)果: 293FT細(xì)胞、健康志愿者血細(xì)胞中均檢測到ARHI mRNA表達(dá)，而白血病細(xì)胞株以及白血病患者原代細(xì)胞中未檢測到該基因的表達(dá)。生長曲線顯示高表達(dá)ARHI基因的U937(U937-ARHI)細(xì)胞在第6～8天細(xì)胞活力低于對照(U937-GFP)組。高表達(dá)ARHI的U937細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率均高于對照組(P<0.05)。結(jié)論: ARHI在急性髓系白血病細(xì)胞中的表達(dá)減低；高表達(dá)ARHI基因能抑制U937細(xì)胞生長、阻滯其細(xì)胞周期在G2/M期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]ARHI基因； 急性髓細(xì)胞白血??； 細(xì)胞周期； 凋亡

[中圖分類號]R733.72[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.005

[文章編號]1000-4718(2015)11-1956-05

[收稿日期]2015-03-25[修回日期] 2015-09-24

[基金項(xiàng)目]*廣東省科技計(jì)劃(No．2012B031800063)；廣東省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目(No. B2012111)

通訊作者△Tel: 020-85252230； E-mail： songwangcai@yahoo.com

ARHIgene inhibits cell growth, induces G2/M phase arrest and apoptosis of acute myeloid leukemia cell line U937LU Ying1, LIU Xiang-fu1, LIU Ling-ling2, LI Fang1, QIN Xue-ling1, LIN Dong-jun1, 2

(1DepartmentofBloodTransfusion,2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:xiaolu1196@163.com；lindongjun0168@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the expression of aplasia rashomolog member I (ARHI) gene in acute myeloid leukemia cells (AML) and to study the effects of ARHI on the growth of AML cell line U937.METHODS: The mRNA expression of ARHI in AML cells, 293FT cells, AML primary cells and healthy volunteer blood cells were detected by RT-PCR. After transfection with the MSCV-IRES-GFP-ARHI plasmid to the U937 cells, the growth curve was analyzed by MTT assay. U937 cells were re-suspended by fresh medium and cultured for 24 h, then the cell cycle distribution and apoptotic rate were determined. RESULTS: The mRNA of ARHI was positively detectable in 293FT cells and healthy volunteer blood cells instead of AML cell line and AML primary cells. The growth curve showed that cell viability in U937 cells with high expression of ARHI (U937-ARHI) was lower than that in the control cells (U937-GFP) on 6th～8th day. The ratio of G2/M phase and apoptotic rate in the U937-ARHI cells were increased compare with control group(P<0.05). CONCLUSION: The mRNA level of ARHI is low in AML cells. High expression of ARHI gene in U937 cells inhibits cell growth, arrests the cells at G2/M phase and induces apoptosis.

[KEY WORDS]ARHIgene; Acute myeloid leukemia; Cell cycle; Apoptosis

急性白血病是一種來源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及到多種因素，其中抑癌基因的失活在白血病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。抑癌基因又稱為腫瘤抑制基因，是一類能抑制細(xì)胞過度增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化從而抑制腫瘤形成的基因，它的丟失或失活可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因包括P53、P16、P73、RUNX3等均與白血病的發(fā)病有關(guān)[1-4]。

ARHI基因定位于人染色體1p31，總長大約8 kb，其中包括2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子。ARHI為Ras超家族成員之一，屬于小GTP結(jié)合蛋白，與Ras、Rap基因有著50%～60%的同源性，但是Ras/Rap家族均存在效應(yīng)區(qū)YDPTIEDSY，而ARHI則擁有獨(dú)特的基序YLPTIENTY[5]。ARHI基因最早是在1999年由Yu等[6]從卵巢和乳腺上皮細(xì)胞及其癌細(xì)胞中克隆而來，與大部分Ras超家族成員不同的是,ARHI表現(xiàn)為抑癌基因，目前研究較多的是其在實(shí)體腫瘤中的作用，ARHI基因表達(dá)缺失與腫瘤進(jìn)展以及不良預(yù)后相關(guān)[7-8]。然而ARHI在白血病細(xì)胞中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將探索ARHI在急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的表達(dá)情況及其對細(xì)胞生長的影響。

材料和方法

1試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；構(gòu)建載體所用的酶包括高保真DNA聚合酶、BglII 限制性內(nèi)切酶、SalI 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶以及Taq DNA聚合酶均購自TaKaRa；反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自Thermo；MTT、碘化丙啶以及RNase A購自Sigma。細(xì)胞培養(yǎng)箱、PCR儀以及酶標(biāo)儀購自Bio-Rad；熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympus；流式細(xì)胞儀購自BD。

2細(xì)胞培養(yǎng)

U937細(xì)胞、293FT 細(xì)胞為中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞；AML原代細(xì)胞取自本院血液科患者的骨髓；正常外周血標(biāo)本取自健康志愿者。U937為懸浮細(xì)胞，接種于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～3 d換液1次。293FT 細(xì)胞系為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含有 10% 四季青血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d傳代1次。

3方法

3.1全長基因的擴(kuò)增查找GenBank里ARHI基因的編碼序列，mRNA開放編碼閱讀框ORF：其編碼氨基酸的CDS為295～985。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼蛋白質(zhì)序列基因全長。上游引物序列為5’-CCAGATCTATGGGTAACGCCAGCTTTGGCT-3’，下游引物序列為5’-GGCCCGTCGACTCACATGATTATGCACTTG-3’，酶切位點(diǎn)前面設(shè)置保護(hù)堿基。

3.2反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR利用 TRIzol 法提取白血病細(xì)胞株以及原代細(xì)胞的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成 cDNA。然后利用PCR擴(kuò)增ARHI基因(690 bp)。 反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。

3.3MSCV-IRES-GFP-ARHI載體的構(gòu)建雙酶切PCR產(chǎn)物和MSCV-IRES-GFP質(zhì)粒，酶連反應(yīng)獲取目的質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化、挑克隆以及搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒。

3.4構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)ARHI的細(xì)胞株提取MSCV-IRES-GFP-ARHI 重組載體質(zhì)粒，pKat質(zhì)粒以及pVSV-G質(zhì)粒。將293FT 細(xì)胞以適宜的密度接種于培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行包裝；利用Lipofectamine 2000將上述3種質(zhì)粒以一定比例混合共轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞；16～18 h 后換為新鮮培養(yǎng)基；24和48 h后分別收集上清。感染U937細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光細(xì)胞；繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×107/L，進(jìn)行流式分選出帶GFP的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了MSCV-IRES-GFP的細(xì)胞簡稱為U937-GFP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了MSCV-IRES-GFP-ARHI的細(xì)胞簡稱為U937-ARHI細(xì)胞。

3.5細(xì)胞生長曲線測定取生長良好的細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔的細(xì)胞為500個(gè)。24 h 后用MTT法檢測活細(xì)胞數(shù)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，細(xì)胞培養(yǎng)4 h，加DMSO后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測。以后每隔24 h 檢測1次，連續(xù)計(jì)數(shù) 8 d，然后繪制生長曲線。

3.6細(xì)胞周期檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，將U937-GFP和U937-ARHI細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基重懸后接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×105/L，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法測定細(xì)胞周期。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間的比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1白血病細(xì)胞中ARHI mRNA的表達(dá)水平

本研究用RT-PCR法檢測人胚腎細(xì)胞293FT以及AML細(xì)胞株U937、HL-60、NB4中的ARHI mRNA表達(dá)情況，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示293FT細(xì)胞有ARHI mRNA的表達(dá)，HL-60、U937以及NB4 3種AML細(xì)胞株中未檢測到ARHI mRNA表達(dá)；此外，3例AML患者的血標(biāo)本也未檢測到ARHI mRNA表達(dá)，而在志愿者血細(xì)胞中有表達(dá)，見圖1、表1。結(jié)果提示ARHI基因表達(dá)可能與白血病發(fā)病有關(guān)，因此本研究構(gòu)建了高表達(dá)ARHI的U937細(xì)胞株，觀察此基因?qū)Π籽〖?xì)胞生長的影響。

Figure 1.The mRNA level of ARHI in 293FT cells, leukemia cell lines, AML primary cells and healthy volunteer blood cells. H: healthy volunteer blood cells; P: AML primary cells.

圖1293FT細(xì)胞、白血病細(xì)胞株、AML原代白血病細(xì)胞以及健康志愿者外周血中ARHI mRNA的表達(dá)情況

表1　患者的一般資料

2MSCV-IRES-GFP-ARHI質(zhì)粒的驗(yàn)證

利用BglⅡ以及SalⅠ雙酶切質(zhì)粒，瓊脂糖跑膠可見620 bp的ARHI基因以及MSCV-IRES-GFP載體。同時(shí)對目的基因進(jìn)行完整測序，使用 Blast 軟件進(jìn)行序列比對，驗(yàn)證結(jié)果相符,見圖2。

Figure 2.ARHIwas linked to MSCV-IRES-GFP plasmid.

圖2雙酶切驗(yàn)證ARHI連接至MSCV-IRES-GFP載體

3穩(wěn)定高表達(dá)ARHI的U937細(xì)胞株的鑒定

經(jīng)慢病毒感染的U937細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選出帶GFP 細(xì)胞。在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光細(xì)胞(圖3)；提取U937-GFP、U937-ARHI細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR 檢測，可見U937-ARHI細(xì)胞高表達(dá)ARHI基因(圖4)。

Figure 3.Images of U937 cells infected with MSCV-IRES-GFP or MSCV-IRES-GFP-ARHI under fluorescence microscope (×200).

圖3慢病毒轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞中可見綠色熒光

Figure 4.The mRNA level of ARHI in U937-GFP cells and U937-ARHI cells.

圖4U937-GFP和U937-ARHI細(xì)胞中ARHI mRNA的表達(dá)水平

4細(xì)胞的生長曲線

將U937-GFP細(xì)胞和U937-ARHI細(xì)胞培養(yǎng)8 d，每天用MTT法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果如圖5所示，第1～5天2種細(xì)胞活性相似，然而第6～8天，U937-GFP的細(xì)胞活性明顯高于U937-ARHI細(xì)胞(P<0.05)。

Figure 5.The growth curve of U937-GFP cells and U937-ARHI cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsU937-GFP.

圖5U937-GFP細(xì)胞以及U937-ARHI細(xì)胞的生長曲線

5細(xì)胞周期檢測

相同數(shù)量的U937-GFP細(xì)胞和U937-ARHI細(xì)胞經(jīng)新鮮培養(yǎng)基重懸，在6孔板培養(yǎng)24 h后用流式細(xì)胞術(shù)測定其細(xì)胞周期，結(jié)果顯示U937-ARHI細(xì)胞G2/M期的比例高于U937-GFP，說明ARHI基因可以使細(xì)胞阻滯在G2/M期，另外，U937-ARHI細(xì)胞的凋亡率高于U937-GFP細(xì)胞,見圖6、表2。

Figure 6.The cell cycle distribution of U937-GFP cells and U937-ARHI cells. Mean±SD.n=3.

圖6U937-GFP和U937-ARHI的細(xì)胞周期及凋亡

表2　U937-GFP和U937-ARHI細(xì)胞的周期以及凋亡率

*P<0.05vsU937-GFP.

討論

ARHI又名DIRAS3、NOEY2基因，是1999年發(fā)現(xiàn)的母源性印跡抑癌基因?；蛴≯E是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了修飾，使帶有親代印跡的等位基因具有不同的表達(dá)特性，表現(xiàn)為僅一方親本來源的同源基因表達(dá)，而來自另一親本的不表達(dá)。在正常細(xì)胞中，母源性的ARHI等位基因上發(fā)生CpG島甲基化修飾，使其轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，而父源性的等位基因不受修飾，從而能夠在子代中表達(dá)[9]。

自1999年美國德克薩斯大學(xué)Andesron癌癥中心的科研團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)ARHI基因后，其生物學(xué)功能以及與腫瘤的關(guān)系得到廣泛研究，研究最多的是其在卵巢癌以及乳腺癌中的作用。ARHI在人體多種組織中均有表達(dá)，其中正常卵巢的表達(dá)最高[6]，在正常卵巢組織中ARHI mRNA 表達(dá)率為100%，在卵巢癌組織中表達(dá)水平下調(diào)，Yu等[6]科研團(tuán)隊(duì)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對40例卵巢癌患者手術(shù)組織標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)ARHI基因表達(dá)缺失率達(dá)88%[10]。此外，研究發(fā)現(xiàn)ARHI基因表達(dá)缺失還與卵巢癌瘤進(jìn)展以及不良預(yù)后相關(guān)[8]。同樣，在正常乳腺組織中均存在ARHI mRNA表達(dá)，而乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，提示ARHI在乳腺癌發(fā)病過程中起重要作用[11]。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，ARHI在其它實(shí)體腫瘤中也存在異常表達(dá)，Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)在正常胰腺組織中，ARHI表達(dá)位于導(dǎo)管上皮，腺泡細(xì)胞和胰島細(xì)胞在胰腺癌組織中表達(dá)缺失率為50%。另外，在肝癌、胃癌、甲狀腺癌等腫瘤中也發(fā)現(xiàn)ARHI的作用[13-15]。

ARHI在實(shí)體腫瘤中的研究報(bào)道顯示其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，那么其在血液系統(tǒng)腫瘤中的作用如何呢，本研究首先用RT-PCR法檢測了ARHI mRNA在正常上皮細(xì)胞株293FT以及AML細(xì)胞株中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在293FT細(xì)胞中可檢測到ARHI，而在U937、HL-60、NB4中未檢測到它的表達(dá)。此外，本研究比較了健康志愿者以及AML患者外周血標(biāo)本中ARHI mRNA的表達(dá)情況，3例志愿者的血標(biāo)本中可檢測到ARHI mRNA，而AML原代細(xì)胞中并無表達(dá)，由于樣本量少，本文沒法做出準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)分析，但是這個(gè)結(jié)果提示了ARHI基因在白血病原代細(xì)胞中表達(dá)減少，這和實(shí)體腫瘤的結(jié)果是一致的[10-11]。

發(fā)現(xiàn)ARHI基因在白血病細(xì)胞中表達(dá)減少后，本研究進(jìn)一步觀察了此基因?qū)Π籽“l(fā)病以及發(fā)展的可能影響。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ARHI基因主要有以下生物學(xué)功能。(1)抑制細(xì)胞增殖：Xu等[16]在2000年建立一個(gè)高表達(dá)ARHI的轉(zhuǎn)基因鼠模型，發(fā)現(xiàn)子代鼠的體重明顯低于正常鼠，且子代鼠體重降低程度與ARHI基因表達(dá)水平相關(guān)，說明該基因在鼠科動物的生長發(fā)育過程中是一個(gè)負(fù)性調(diào)控因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ARHI的轉(zhuǎn)基因鼠體重降低與泌乳素水平降低有關(guān)。除了正常細(xì)胞外，研究發(fā)現(xiàn)ARHI基因能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，包括卵巢癌[5]、乳腺癌[17]、胰腺癌[18]等。(2)參與調(diào)控細(xì)胞周期：細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞，從一次完成分裂開始，到下一次完成分裂為止的過程。一般分為分裂間期和分裂期2個(gè)階段。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分裂期分為G1、S、G2/M 3個(gè)階段。研究發(fā)現(xiàn)ARHI基因可以使不同的腫瘤細(xì)胞阻滯在不同的細(xì)胞周期。在胰腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)ARHI可誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期阻滯，其機(jī)制為磷酸化蛋白激酶Akt水平降低導(dǎo)致P53蛋白積聚，從而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21WAF1使細(xì)胞周期阻滯在G1[17]。另有研究表明高表達(dá)ARHI基因可以使卵巢癌細(xì)胞SKOV3阻滯在S期，其機(jī)制可能與磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子以及磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶水平降低有關(guān)[18]。此外DNA 去甲基化試劑和/或組蛋白去乙?；敢种苿┛梢栽诼殉舶?Hey 和 SKOv3 中誘導(dǎo)ARHI表達(dá)而造成G2/M 期阻滯[19]。(3)促進(jìn)細(xì)胞凋亡：有研究發(fā)現(xiàn)將高表達(dá)ARHI基因腺病毒載體的液體注射到無ARHI表達(dá)的裸鼠乳腺癌及卵巢癌模型中，發(fā)現(xiàn)部分乳腺癌以及卵巢癌出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與calpain蛋白酶和鈣蛋白酶介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[20]。在胰腺癌細(xì)胞系中再表達(dá)ARHI基因后，凋亡細(xì)胞比例增加，此作用與ARHI基因下調(diào)NF-κB通路有關(guān)[21]。(4)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：有研究發(fā)現(xiàn)ARHI是一個(gè)新的能調(diào)控細(xì)胞自噬的基因，其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[22]。

基于以上ARHI的生物學(xué)功能，本研究檢測了該基因?qū)ML細(xì)胞的生長、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了高表達(dá)ARHI基因的U937細(xì)胞株(U937-ARHI)，連續(xù)8 d檢測了細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示，在生長曲線的前期2組細(xì)胞的活性相似，然而至生長曲線的后期(6～8 d)，U937 -ARHI細(xì)胞活性低于U937-GFP細(xì)胞，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ARHI基因能夠抑制U937的生長，此結(jié)果與該基因在實(shí)體腫瘤中的作用一致[5, 17]。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARHI基因可以使U937細(xì)胞阻滯在G2/M期從而影響細(xì)胞的有絲分裂。凋亡相關(guān)檢測也表明轉(zhuǎn)染了ARHI基因的U937細(xì)胞的凋亡率大于對照組細(xì)胞。從凋亡率的數(shù)值分析看，U937-GFP細(xì)胞的基礎(chǔ)凋亡率非常低，僅為0.02%，在轉(zhuǎn)染了ARHI基因后，雖然凋亡率大大增加到1.19%，但是數(shù)量仍然很低，這也解釋了為什么生長曲線中前5天2種的細(xì)胞活性無差異，直至第6天當(dāng)?shù)蛲鲆约爸芷谧铚募?xì)胞積累到一定數(shù)量后，兩者才出現(xiàn)活性細(xì)胞數(shù)量的差異。

本研究觀察了ARHI在AML細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，ARHI mRNA在白血病細(xì)胞中的表達(dá)少于正常細(xì)胞，進(jìn)一步構(gòu)建高表達(dá)ARHI的U937細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，ARHI能夠抑制白血病細(xì)胞的生長，其作用機(jī)制可能與其阻滯細(xì)胞周期在G2/M期以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。下一步的實(shí)驗(yàn)將收集更多的急性白血病原代細(xì)胞標(biāo)本，檢測ARHI mRNA和ARHI蛋白的表達(dá)情況，做更進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析，在此基礎(chǔ)上，研究ARHI在白血病細(xì)胞中表達(dá)減少的可能原因。根據(jù)ARHI在實(shí)體腫瘤中的研究報(bào)道，ARHI基因失活的原因主要為雜合性缺失以及甲基化。ARHI是一種印跡基因，雖然其母源性等位基因不表達(dá)，但其父源性等位基因能夠轉(zhuǎn)錄、翻譯出具有正常功能的蛋白質(zhì)。乳腺癌以及卵巢癌細(xì)胞中均存在ARHI父源性等位基因的雜合性缺失[23]。抑癌基因甲基化在腫瘤中多有報(bào)道，本課題組既往的研究亦發(fā)現(xiàn)RUNX3基因、p53基因在白血病中存在甲基化現(xiàn)象[4,24]。ARHI是新近發(fā)現(xiàn)的新的抑癌基因，其啟動子區(qū)域存在2個(gè)CpG島，CpG島I和II，第3個(gè)CpG島位于蛋白編碼區(qū)域[25]。在卵巢癌、乳腺癌以及胰腺癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有ARHI基因的甲基化[18, 26]。 如果其在白血病細(xì)胞中也存在基因甲基化現(xiàn)象，那么ARHI基因?qū)⒊蔀槿ゼ谆幬镏委煱籽〉挠忠蛔饔冒悬c(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)