林靜霞, 張芳菲, 張澤喬, 鐘遠秋, 陳永鋒

南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

銀屑病(psoriasis)是一種有遺傳背景的由免疫異常介導的慢性紅斑鱗屑性皮膚病[1]，主要表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)激活引起的細胞炎癥反應(yīng)以及角質(zhì)形成細胞的異常增殖和分化[2]，目前其發(fā)病機制研究仍不完善。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，大量的易感基因座位于人類基因組的非編碼區(qū)[3]，表明非編碼區(qū)在銀屑病的進程中發(fā)揮著重要作用。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類新的具有調(diào)控功能的RNA，可參與包括細胞增殖、分化、凋亡、發(fā)育和免疫反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學過程[4],在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平等多方面影響疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。目前基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的差異表達研究，利用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)，可發(fā)現(xiàn)大量lncRNA在銀屑病患者皮損組織中異常表達，并可能作為銀屑病的新易感位點[6]。lncRNA在調(diào)控銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵通路中發(fā)揮著重要作用，具有潛在的研究意義[7]。因此，本研究通過分析銀屑病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，探討細胞周期的lncRNA異常與銀屑病發(fā)病的關(guān)系，為進一步揭示lncRNA在銀屑病細胞周期中的作用機制提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究分析數(shù)據(jù)均來源于GEO數(shù)據(jù)庫，包括兩個數(shù)據(jù)集GSE54456和GSE63979，其中正常對照組90個，銀屑病皮損組99個，共189個樣本。

1.1.2 試劑和儀器 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Thermo Fisher)，PBS緩沖液(Thermo Fisher)，胰酶(Thermo Fisher)，siRNA(銳博生物)，轉(zhuǎn)染試劑盒(銳博生物)，細胞周期試劑盒(聯(lián)科生物)。生物安全柜(新加坡ESCO公司)，細胞培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)，離心機(Thermo)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 信號通路富集分析 通過DEseq2分析來自GEO數(shù)據(jù)庫的銀屑病皮損組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，篩選銀屑病組與健康對照組差異表達的基因。篩選條件為log2FC絕對值>2、P<0.05，并構(gòu)建基因表達矩陣[8]。采用DAVID功能注釋對在銀屑病中差異表達上調(diào)的基因進行基因功能富集分析，KEGG信號通路設(shè)定P<0.05，并采用GSEA 軟件包進行分析[9]。

1.2.2 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 利用WGCNA構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)[10]，去除弱共表達基因?qū)?，鄰接閾值高?.02，并與至少一個lncRNA分子相互作用，形成lncRNA-蛋白編碼基因共表達網(wǎng)絡(luò)[11]。

1.2.3 siRNA干擾 將HaCaT細胞培養(yǎng)至30%～50%的濃度，然后用50 nM siRNA轉(zhuǎn)染48 h。操作按試劑盒說明書進行。

1.2.4 流式細胞術(shù)分析細胞周期 將HaCaT細胞接種到6孔板中，培養(yǎng)至30%～50%的濃度，然后轉(zhuǎn)染siRNA 48 h。收集細胞，用PBS緩沖液洗滌，在4 ℃的70%乙醇中固定過夜。在37 ℃下用RNase A去除RNA 30 min。最后，在室溫下用碘化丙啶(PI)染色30 min，并在流式細胞儀上進行分析。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以三個獨立實驗的均數(shù)±標準差表示。siRNA干擾LINC01206的HaCaT細胞與對照組HaCaT細胞的細胞周期中G0/G1期、G2/M期和S期等的細胞數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病差異表達基因富集于細胞周期通路

通過整合分析銀屑病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集與健康對照組的差異表達基因，篩選出1 319個在銀屑病中差異表達上調(diào)的基因(圖1A)。對銀屑病皮損中表達上調(diào)的基因進行KEGG信號通路富集分析，表明其主要富集在趨化因子信號通路以及細胞周期通路等(圖1B)?；蚣细患治鼋Y(jié)果顯示，銀屑病皮損中細胞周期通路表達升高，且P<0.01(圖1C)，說明銀屑病中存在細胞周期的失調(diào)。

圖1 細胞周期的失調(diào)與銀屑病有關(guān) 1A：銀屑病差異表達基因火山圖；1B：銀屑病中表達上調(diào)基因KEGG信號通路富集分析；1C: 在GSEA基因集合富集分析中，細胞周期通路信號升高

2.2 lncRNA與細胞周期相關(guān)基因共表達

篩選與銀屑病細胞周期通路相關(guān)的差異表達的lncRNA(圖2A)，利用WGCNA構(gòu)建lncRNA與蛋白編碼基因共表達網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示在細胞周期通路中，有9個 lncRNA與14個蛋白編碼基因有關(guān)聯(lián)(圖2B)。通過提取細胞周期相關(guān)lncRNA在對照組及銀屑病皮損組的表達量，分析結(jié)果顯示LINC01206在銀屑病皮損組織中表達倍數(shù)最高，且有統(tǒng)計學差異(表1)。結(jié)合共表達網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，LINC01206可通過與細胞周期通路中的關(guān)鍵基因CCNB1和CCNE1等的相互作用參與銀屑病進程。

表1 細胞周期通路相關(guān)的差異表達的lncRNA

圖2 lncRNA參與銀屑病細胞周期進程 2A：熱圖顯示對照組與銀屑病皮損中與細胞周期通路有關(guān)聯(lián)的lncRNA的差異表達情況；2B：加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建細胞周期通路中l(wèi)ncRNA與蛋白編碼基因的共表達網(wǎng)絡(luò)

2.3 siRNA敲低LINC01206的表達引起細胞周期G2/M期的阻滯

通過在HaCaT細胞中轉(zhuǎn)染50 nM siRNA干擾LINC01206的表達，并使用流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)48 h后HaCaT細胞的細胞周期分布，結(jié)果顯示siRNA敲低HaCaT細胞中LINC01206的表達，會引起細胞周期G2/M期的阻滯(圖3A～3C)，提示lncRNA可以調(diào)控HaCaT細胞的細胞周期過程。

圖3 siRNA敲低LINC01206的表達引起細胞周期G2/M期的阻滯 3A、3B: 流式細胞術(shù)檢測對照組(3A)及siRNA干擾LINC01206組(3B)的HaCaT細胞周期;3C: 細胞周期各時期細胞數(shù)統(tǒng)計

3 討論

lncRNA參與了從基因表達到蛋白質(zhì)翻譯和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定等細胞生命過程，在發(fā)育、機體內(nèi)平衡和維持細胞命運中發(fā)揮重要作用[4]。本研究結(jié)果證實了lncRNA失調(diào)與多種細胞信號通路相關(guān)，并在銀屑病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[12]。銀屑病角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，銀屑病病變與免疫反應(yīng)、細胞角質(zhì)化及細胞周期等多種途徑有關(guān)[13]。細胞周期對于細胞生命過程至關(guān)重要，其參與分裂細胞中的增殖、分化和凋亡[14]。細胞的正常分裂依賴于調(diào)節(jié)細胞周期階段時間順序的檢查點，包括 G1/S、G2/M和中期/后期轉(zhuǎn)變[15]。目前已有多項研究表明，lncRNA通過多種途徑參與細胞周期進程的調(diào)控[16]。如lncRNA DLEU2通過抑制p53表達來促進細胞周期進程并抑制Notch信號通路的活性，從而促進宮頸癌細胞的增殖[17]；而lncRNA PLAC2可通過抑制STAT1核轉(zhuǎn)移降低RP36表達，從而阻斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的細胞周期進程[18]。同時也有研究顯示，通過敲低lncRNA MIR31HG可導致HaCaT細胞G2/M期的細胞周期停滯，影響細胞增殖[19]。這提示lncRNA可通過調(diào)控銀屑病細胞周期來發(fā)揮功能。

本研究通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，銀屑病上調(diào)的基因富集在細胞周期通路中；lncRNA與細胞周期蛋白編碼基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析顯示，LINC01206、LINC01269、LINC01215和LINC02159等通過與細胞周期信號通路關(guān)鍵基因CCNA2、CCNB1和CCNE1的相互作用調(diào)控銀屑病進程。表明lncRNA可能通過與RNA結(jié)合蛋白相互作用來參與銀屑病細胞周期的調(diào)控[20]。同時，lncRNA與蛋白編碼基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示，LINC01206通過作用于細胞周期檢查點相關(guān)基因CCNB1和CCNE1來調(diào)控銀屑病進程。為深入了解lncRNA在銀屑病細胞周期中的功能，本研究通過小干擾RNA在HaCaT細胞中敲低細胞周期通路中差異表達最明顯的LINC01206，并采用流式細胞術(shù)檢測HaCaT細胞的細胞周期進程，結(jié)果顯示，LINC01206表達的降低將引起HaCaT細胞周期G2/M期的阻滯，表明lncRNA可能通過介導HaCaT細胞周期、調(diào)控細胞生命過程參與銀屑病發(fā)病。

綜上所述，銀屑病病變引起lncRNA的差異表達，而lncRNA的表達變化能夠作用于細胞周期，并導致細胞周期檢查點的失調(diào)，從而影響銀屑病的進程。因此，對銀屑病細胞周期中差異表達lncRNA的研究，將有助于解釋銀屑病發(fā)病過程中角質(zhì)形成細胞異常增殖的機制，為進一步闡明lncRNA在銀屑病中的生物學功能以及在銀屑病發(fā)病機制中的調(diào)控作用提供新的理論依據(jù)，提示細胞周期中的lncRNA將有望成為銀屑病治療的新藥物靶點。