陳敬榮,鄭堯杰,尤付玲,楊　紅

(廣東藥學院基礎(chǔ)學院分子生物學實驗室，廣東 廣州　510006)

染料木素通過JNK調(diào)控Fas通路的抗Aβ誘導的PC12細胞凋亡機制研究

陳敬榮,鄭堯杰,尤付玲,楊紅

(廣東藥學院基礎(chǔ)學院分子生物學實驗室，廣東 廣州510006)

中國圖書分類號：R284.1；R329.25；R394.2；R745.7；R977.6

摘要:目的探討染料木素(genistein，GEN)通過激活JNK調(diào)控Fas通路抑制Aβ(25-35)誘導的PC12細胞損傷凋亡的作用及分子機制。方法建立Aβ(25-35)誘導的PC12細胞模型，MTT法和流式細胞儀法測定細胞活力和凋亡率，熒光定量PCR檢測Fas凋亡通路相關(guān)基因Fas、FasL、caspase-3和caspase-8 mRNA相對表達情況，分光光度法檢測caspase-3和caspase-8酶活性，Western blot檢測JNK和p-JNK蛋白表達水平變化。結(jié)果GEN下調(diào)Aβ(25-35)誘導引起的Fas、FasL、caspase-3和caspase-8 mRNA水平的增加，抑制Aβ(25-35)誘導的caspase-3和caspase-8酶活性，且明顯降低Aβ(25-35)誘導的JNK磷酸化水平。結(jié)論GEN通過降低Aβ(25-35)誘導的JNK磷酸化激活，調(diào)控JNK依賴的Fas凋亡通路，從而抑制Aβ(25-35)誘導的PC12細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞：染料木素；凋亡；Aβ(25-35)；JNK；Fas；機制

淀粉樣肽(β-amyloid, Aβ)的沉積被認為是神經(jīng)元損傷的主要原因，不溶解的Aβ 對神經(jīng)元具有毒性作用。目前的很多研究致力于闡明Aβ引發(fā)的神經(jīng)元凋亡機制，但仍無有效的針對性手段。在Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡實驗中，Shoji等[1]發(fā)現(xiàn)JNK信號轉(zhuǎn)導途徑在阿爾采末病(Alzheimer′s disease，AD)的發(fā)病過程中參與了早期老年斑的形成，造成彌散性Aβ沉積，并激活腦內(nèi)神經(jīng)元中的JNK。后者依次激活幾種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而這些因子的激活是Aβ誘導下游Fas受體介導的凋亡途徑所依賴的，隨后Fas配體(Fas Ligand, FasL)與受體Fas結(jié)合，誘導caspase級聯(lián)反應，最終導致神經(jīng)元凋亡[2]。

已有研究表明，黃酮類天然產(chǎn)物具有抗氧化、抗腫瘤、抑制酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)活性和細胞凋亡等作用[3]。染料木素(genistein，GEN)是大豆異黃酮中的一種成份，越來越多的研究顯示，GEN在抗腫瘤、心臟病、骨質(zhì)疏松癥和認知功能障礙[4]中具有重要作用。GEN在Aβ(25-35)誘導的神經(jīng)元凋亡通路中的保護效應越來越受到關(guān)注，但其抗Aβ毒性的分子機制還需要進一步闡明。本研究探討了GEN對Aβ(25-35)誘導的PC12細胞凋亡的分子保護機制，檢測了Fas凋亡通路相關(guān)基因的表達以及JNK磷酸化激活的情況，為GEN治療Aβ所致的神經(jīng)退行性疾病提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料高分化PC12細胞(中國科學院上海細胞所)；GEN、Aβ(25-35)(Sigma公司)；TRIzol(Invitrogen公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)(TaKaRa公司)； caspase-3和caspase-8活性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、SP600125(碧云天生物技術(shù)公司)；Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)抗體、SAPK/JNK 抗體 (CST公司)；Rabbit anti-β-actin、Goat anti-rabbit IgG(γ-chain specific)(博士德公司)；酶標儀(Biotek)、實時定量PCR儀(Biorad)；熒光顯微鏡(Leica公司)；流式細胞儀(BD Biosciences公司)；引物合成(上海生工)。

1.2細胞培養(yǎng)高分化PC12細胞在含有10%新生胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)液。待細胞豐度達80%后用0.25%胰酶消化傳代，實驗用細胞均處在對數(shù)生長期。

1.3MTT實驗取對數(shù)生長期的細胞，按照1×105/孔的密度接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。24 h后預先添加(0、12.5、25、50、100 μmol·L-1)GEN作用2 h，然后用20 μmol·L-1的Aβ(25-35)處理24 h。常規(guī)MTT方法在酶標儀測出各孔的吸光度(A值)。實驗中，每個濃度組設(shè)置6個復孔，分別計算各濃度組吸光度平均值與對照組相比的抑制程度，實驗重復3次，根據(jù)公式計算細胞存活率。細胞存活率/%=(A實驗組-A空白組)/ (A正常對照組-A空白組)×100%。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期的細胞，按照1×106/孔的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，24 h后預先添加(0、12.5、25、50 μmol·L-1)GEN作用2 h，然后用20 μmol·L-1的Aβ(25-35)處理24 h。把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞1次，每孔加入500 μL 0.25%胰酶消化細胞，然后加入上述的培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)，1 000×g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm的流式細胞儀下檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。定量分析凋亡細胞百分比。實驗重復3次，并采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.5RNA提取和實時熒光定量PCR(qPCR)檢測取對數(shù)生長期的細胞，按照1×106/孔的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，24 h后預先添加25 μmol·L-1GEN作用2 h，然后用20 μmol·L-1的Aβ(25-35)處理24 h，SP600125 (100 nmol·L-1) 先于Aβ(25-35) 1 h前加入。藥物處理后，根據(jù)Invitrogen公司生產(chǎn)的TRIzol的操作手冊進行總RNA的提取。取1 μg的總RNA在10 μL反應體系下，用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)進行第一鏈cDNA的合成。下面的引物用于qPCR反應：β-actin F，5′-CACTTTCTACAATGAGCTGCG-3′，β-actin R，5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′；Fas F，5′-CCCGGACCCAGAATACCAAG-3′，F(xiàn)as R，5′-GTTCGTGTGCAAGGCTCAAG-3′；FasL F，5′-GAACTGGCAGAACTCCGTGA-3′，F(xiàn)asL R，5′-TGTGCTGGGGTTGGCTATTT-3′；caspase-3 F，5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′，caspase-3 R，5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′；caspase-8 F，5′-GAGCTGCCAGTTTCTGTTTTG-3′，caspase-8 R，5′-GTTGAAGATCAGACAGTACCCC-3′。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，采取20 μL體系兩步法進行qPCR反應，反應條件：95℃30s，95℃ 5s，60℃30s，40個循環(huán)。實時定量PCR儀檢測各個基因，基于CT(threshold cycle)值法，采用2-ΔΔCt分析，每個樣本的mRNA含量用各內(nèi)參β-actin進行標準化。

1.6Western blot 檢測JNK及p-JNK蛋白表達取對數(shù)生長期的細胞，按照1×106/孔的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，24 h后預先添加25 μmol·L-1GEN作用2 h，然后用20 μmol·L-1的Aβ(25-35)處理24 h，SP600125 (100 nmol·L-1) 先于Aβ(25-35) 1h前加入。藥物處理后收集細胞，并得到細胞裂解液，BCA測得各自濃度，調(diào)整各樣品濃度一致，100 ℃沸水煮沸5 min，10%分離膠，5%濃縮膠， 80 V 30 min，120 V 60 min SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)。200 mAh，60 min濕轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，5%脫脂奶粉25 r·min-1搖床，封閉2 h。一抗(JNK，p-JNK)1 ∶2 000,TBST稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗2次，再用TBS洗1次，每次5 min；二抗(goat anti-rabbit IgG)1 ∶4 000孵育1 h，TBST洗3次，再用TBS洗1次，每次10 min。ECL發(fā)光顯色，曝光，掃描。

1.7caspase活性檢測取對數(shù)生長期的細胞，按照1×106/孔的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。按“1.6”藥物處理后，采用分光光度法，參照說明書測定caspase-3或caspase-8的酶活性。

2結(jié)果

2.1GEN抑制Aβ誘導的細胞活力下降為觀察GEN在Aβ誘導的PC12的保護作用，首先，用不同濃度Aβ(0~40 μmol·L-1)作用PC12細胞24 h和48 h，結(jié)果顯示，Aβ明顯降低PC12細胞存活率，最小劑量是20 μmol·L-1(P<0.05vscontrol)(Fig 1 A)。隨后我們檢測GEN在沒有Aβ誘導下對PC12細胞活力的影響，GEN(0～100 μmol·L-1)作用PC12細胞24 h，結(jié)果顯示，0～25 μmol·L-1GEN對細胞活力幾無影響，而50和100 μmol·L-1GEN使細胞存活率明顯降低(Fig 1B)。進一步檢測GEN對Aβ誘導的PC12細胞存活率的影響，PC12預先與不同濃度GEN(0～100 μmol·L-1)孵育2 h，再繼續(xù)用20 μmol·L-1的Aβ分別共同處理24 h。結(jié)果顯示，20 μmol·L-1Aβ單獨組明顯減少PC12細胞存活率(P<0.05vscontrol)，GEN (12.5、25、50和100 μmol·L-1)+ Aβ組細胞活力都高于Aβ單獨組(P<0.05vsAβ alone)，然而50 μmol·L-1和100 μmol·L-1GEN處理組細胞存活率明顯低于25 μmol·L-1GEN組，故25 μmol·L-1劑量的GEN具有最大的保護作用(Fig 1 C)。

2.2GEN減少Aβ誘導的細胞凋亡為了進一步證實GEN對Aβ誘導的PC12細胞的保護效應及其GEN最佳濃度的選擇。Annexin V-FITC雙染法檢測GEN(12.5、25、50 μmol·L-1)對Aβ誘導的PC12細胞的凋亡情況(Fig 2 A)。定量分析Annexin V-FITC凋亡細胞百分比結(jié)果顯示，Aβ(25-35)誘導的PC12細胞凋亡百分比明顯高于對照組(P<0.05)，GEN作用組(12.5、25、50 μmol·L-1)都明顯抑制Aβ誘導的細胞凋亡(P<0.05)，其中，25 μmol·L-1劑量的GEN具有最大抑制效應(Fig 2B)。因此，25 μmol·L-1的GEN被運用到后續(xù)的實驗。

2.3GEN抑制Aβ誘導的Fas/FasL mRNA的增加Fas凋亡途徑是凋亡機制的重要通路，在Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡機制研究中， Aβ誘導的JNK的激活和調(diào)控Fas受體介導的細胞凋亡已有研究[2]。為探討GEN對Aβ誘導的PC12的抗凋亡機制，我們用RT-qPCR檢測Fas通路2個重要基因Fas和FasL mRNA表達情況。RT-qPCR統(tǒng)計結(jié)果顯示，Aβ誘導組明顯增加FasL的表達，溫和上調(diào)Fas的表達(P<0.05或0.01vscontrol)，Aβ誘導引起Fas和FasL表達的增加與報道吻合[2]。GEN組明顯減少Aβ誘導的Fas、FasL的增加，同時，JNK抑制劑SP600125也可減少Fas、FasL的表達，GEN+SP600125合用組同樣明顯抑制Fas、FasL的表達，抑制作用與GEN組相當(P<0.05或0.01vsAβ組)，見Fig 3。

2.4GEN抑制Aβ誘導的caspase-3和caspase-8基因的表達以及酶活性在Fas凋亡機制中，caspase級聯(lián)反應是凋亡關(guān)鍵過程。為進一步探討GEN對Aβ刺激引起的Fas和FasL的調(diào)控以及與JNK的關(guān)系，首先采用RT-qPCR檢測caspase-3和caspase-8基因的表達。RT-qPCR統(tǒng)計結(jié)果顯示，GEN組、JNK抑制劑SP600125組和GEN+SP600125合用組均明顯下調(diào)caspase-3和caspase-8基因的表達(P<0.05vsAβ 組)(Fig 4 A)。GEN對caspase-3和caspase-8基因的調(diào)控作用進一步被caspase酶活性測定證實，與Aβ組相比，JNK抑制劑SP600125和GEN都可對Aβ刺激引起的caspase-3和caspase-8酶活力的增強起抑制作用(Fig 4B)。

Fig 1Prevention of Aβ(25-35)

A: Dose-dependent changes of cell viability of PC12 cells by Aβ treatment.*P<0.05 compared to Aβ control; B: Cells were treated with genistein (0, 12.5, 25, 50 and 100 μmol·L-1) for 24 h.*P<0.05 compared with control; C: Cells were pretreated with genistein (0, 12.5, 25, 50 and 100 μmol·L-1) for 2 h followed by exposure to 20 μmol·L-1Aβ(25-35) for 24 h.#P<0.05 compared to control;*P<0.05 compared to Aβ alone. Cell viability was evaluated by MTT assay

Fig 2GEN pretreatment attenuates Aβ(25-35) induced cell apoptosis

A:Annexin-V-FITC/PI double staining of PC12 cells; B: The bar chart describes the percentage distribution of apoptotic cells. Percentage of annexin-V-positive cells analysis of FACS obtained from three separate experiments and are expressed as mean ± SD,n=3;*P<0.05 compared to Aβ alone.

2.5GEN減少Aβ誘導的JNK磷酸化Aβ誘導引起JNK的激活已被證實[2]，為探討GEN對Aβ刺激引起的JNK激活的調(diào)控，我們檢測了p-JNK和總JNK蛋白表達情況。相對于Aβ單獨組，p-JNK 54和46 ku條帶被GEN減弱(P<0.05vsAβ 組)，JNK抑制劑SP600125也能明顯減弱p-JNK 54和46 ku條帶，兩者合用效果最強(Fig 5A、B)。

Fig 3Effect of GEN on the mRNA of Fas and FasL

PC12 cells were pretreated with or without GEN at concentrations of 25 μmol·L-1for 2 h followed by exposure to 20 μmol·L-1Aβ(25-35) for 24 h. SP600125 (100 nmol·L-1) was added to cultures 1 h prior to Aβ(25-35).*P<0.05,**P<0.01 compared to control;#P<0.05,##P<0.01 compared to Aβ alone.

3討論

目前，許多關(guān)于AD病理機制的研究集中在Aβ的沉積。在體外研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元突起退化與Aβ的表達有關(guān)聯(lián)[5]。注射Aβ至大鼠腦部會引起神經(jīng)元損傷[6]。Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡是涉及到各種信號通路的細胞死亡的一個基本過程。

GEN是大豆異黃酮的主要活性成份，口服可被小腸吸收[7]。有證據(jù)表明，GEN可穿過活體實驗動物血腦屏障[8]，在老年神經(jīng)退行性疾病中，可以與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮雌激素功能，促進神經(jīng)元再生[9]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，染料木素可通過增強PKC酶活性，調(diào)節(jié)α-/β-分泌酶活性，減少不溶性Aβ的形成和沉積，調(diào)節(jié) Bcl-2 和Bax基因的表達水平，降低細胞的凋亡程度，從而抑制Aβ誘導的神經(jīng)毒性作用[10-11]。GEN調(diào)控與凋亡通路相關(guān)的信號機制愈加被闡明。

分子信號網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用決定了細胞的命運[12]。在許多的應激反應的信號轉(zhuǎn)導通路中，JNK信號級聯(lián)在維持細胞穩(wěn)態(tài)和許多細胞活動中具有重要作用，比如細胞生長、轉(zhuǎn)化、分化和凋亡[13]。強有力的證據(jù)表明，Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡與JNK激活密切相關(guān)[14]。JNK信號的激活調(diào)控一些基因的轉(zhuǎn)錄活性，包括Fas/FasL[14]。SP600125是JNK磷酸化激活的抑制劑，可以有效抑制Aβ誘導的Fas/FasL的表達，JNK激活是Aβ誘導的細胞凋亡中的關(guān)鍵步驟[15]。因此，抑制JNK依賴的凋亡基因的表達可能是針對神經(jīng)元凋亡的一種非常有效的治療策略。JNK的激活調(diào)控Fas/FasL的表達，F(xiàn)asL與Fas聚合，然后通過胞質(zhì)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域招募接頭蛋白和caspase-8酶原，形成死亡誘導信號復合物(death-inducing signaling complex，DISC)，進而激活caspase-3，導致細胞凋亡。我們目前的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ誘導的PC12細胞凋亡涉及到JNK依賴的Fas/FasL的上調(diào)， GEN可明顯減少Aβ誘導的Fas/FasL的表達，GEN還可明顯降低Aβ誘導的JNK磷酸化水平，表明GEN對Aβ誘導的Fas/FasL表達的改變與JNK活性的抑制有關(guān)。

Fig 4　Effect of GEN on the mRNA and activity of caspase-3

The mRNA expression was detected by real-time PCR, and the activity expression was detected by colorimetric assay. PC12 cells were pretreated with or without GEN at concentrations of 25 μmol·L-1for 2 h followed by exposure to 20 μmol·L-1Aβ(25-35) for 24 h. SP600125 (100 nmol·L-1) was added to cultures 1 h prior to Aβ(25-35).**P<0.01 compared to control;#P<0.05 compared to Aβ alone.

Fig 5GEN attenuates Aβ(25-35)-induced JNK

phosphorylation detected by Western blot

PC12 cells were pretreated with or without GEN at concentrations of 25 μmol·L-1for 2 h followed by exposure to 20 μmol·L-1Aβ(25-35) for 24 h. SP600125 (100 nmol·L-1) was added to cultures 1 h prior to Aβ(25-35). A: JNK and p-JNK levels were determined by immunoblot analysis with antibody to JNK and p-JNK; B: Quantitative results of p-JNK are presented compared to control. Densitometric analysis of Western blot obtained from three separate experiments, and data are expressed as mean ± S.D,n=3.**P<0.01 compared to control;#P<0.05 compared to Aβ alone.

總之，我們的研究表明，GEN通過抑制Aβ誘導的PC12細胞JNK的磷酸化作用，進而下調(diào)Fas和FasL表達水平，降低caspase-3和caspase-8活性，發(fā)揮抑制Aβ毒性和神經(jīng)元凋亡的保護作用。抑制JNK依賴的凋亡基因的表達可能是針對神經(jīng)元凋亡的一種非常有效的治療策略，但GEN可能是一種涉及到多機制的藥物，其抗神經(jīng)細胞凋亡機制還需進一步的研究。

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◇作者更正◇

《中國藥理學通報》2014年30卷第11期“以細胞存亡調(diào)控蛋白c-FLIP為靶點的癌癥治療研究”一文1497頁，第10行“兩者相距大概200 bp”應改為“兩者相距大概200 kb”，特此更正。

(陳立立)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.007.html

◇論著◇

Genistein protects PC12 cells from Aβ(25-35)-induced apoptosis

via JNK signaling and regulation of Fas pathway

CHEN Jing-rong, ZHENG Yao-jie, YOU Fu-ling, YANG Hong

(SchoolofBasicCourse,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:AimTo investigate the effect of genistein(GEN) against Aβ(25-35)-induced PC12 cells in regulation of Fas pathway through the activation of JNK. MethodsAβ(25-35)-induced PC12 cells model was established. MTT and fluorescence activated cell sorting to analyze cell viability and apoptotic rate. Fluorescence quantitative PCR was used to detect Fas apoptotic pathways related gene Fas, FasL, caspase-3 and caspase-8 mRNA relative expression. Spectrophotometry was used to detect caspase-3 and caspase-8 enzyme activity. Western blot was adopted to detect JNK and p-JNK protein expression level changes. ResultsGEN attenuated Aβ(25-35)-induced upregulation of Fas and FasL, caspase-3 and caspase-8 mRNA level, caspase-3 and caspase-8 enzyme activity, and significantly reduced Aβ(25-35) induced JNK phosphorylation level. ConclusionGEN can protect PC12 cells from Aβ(25-35)-induced apoptosis via reducing Aβ(25-35)-induced phosphorylation of JNK activation, and then inhibit the JNK dependent Fas apoptotic pathway.

Key words:genistein;cell apoptosis;Aβ(25-35);JNK;Fas; mechanism

通訊作者楊紅(1965-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：新藥篩選與作用機制，，E-mail：yanghong2329@163.com

作者簡介：陳敬榮(1990-)，男，碩士生，研究方向：新藥物篩選與作用機制，E-mail：cjr2008love@163.com；

基金項目：廣東省科技計劃項目(No 2012B031800430，2010B0203 12016)

收稿日期:2014-09-24,修回日期:2014-10-28

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0175-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.007