吳艷玲，夏麗潔，張富春

(新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊　830046)

新疆家蠶抗菌肽誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞AGS凋亡的研究

吳艷玲，夏麗潔，張富春

(新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046)

中國圖書分類號(hào)：R329.25；R735.202.2；R977.6；R979.1

摘要：目的探討新疆家蠶抗菌肽(cecropinXJ)是否通過誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞AGS凋亡產(chǎn)生抗腫瘤的作用。方法選擇0.01~1 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)的 cecropinXJ與人胃癌細(xì)胞AGS和人正常胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測(cè)cecropinXJ對(duì)AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞增殖的影響；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位的變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)和Western blot 檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3 以及細(xì)胞色素C mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果CecropinXJ在體外能明顯抑制胃癌AGS細(xì)胞的增殖(P<0.05)，并具有濃度依賴性，IC50值為61.19 mg·L-1，但對(duì)GES-1細(xì)胞無明顯的抑制增殖作用。經(jīng)cecropinXJ處理24 h后，AGS細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡特征，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，線粒體膜電位下降。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，cecropinXJ 能夠引起B(yǎng)cl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放并活化caspase-3。CecropinXJ促進(jìn)caspase-3活性呈劑量依賴，經(jīng)caspase-3和caspase-9特異性抑制劑處理后可降低cecropinXJ介導(dǎo)的AGS細(xì)胞死亡率。結(jié)論CecropinXJ可通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)和活化caspase-3誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡，是其抗腫瘤機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：新疆家蠶抗菌肽(cecropinXJ)；胃癌；AGS細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Bax；caspase-3;抗腫瘤

Cecropins是Boman等[1-2]首次從惜古比天蠶(hyatophora cecropia)中提取出來的一類抗菌肽家族，目前已發(fā)現(xiàn)的cecropins達(dá)20多種。這類家族具有形成特定兩親性α-螺旋的能力，使得它們可針對(duì)非極性脂質(zhì)的細(xì)胞膜并在微摩爾濃度下對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有強(qiáng)烈的抗菌活性。已有文獻(xiàn)證明，cecropins可抑制多種腫瘤細(xì)胞系如白血病[3]、肝癌[4]、膀胱癌[5]和胃癌[6]的增殖，但不損傷正常細(xì)胞，這一特點(diǎn)使得抗菌肽有望成為新一代的抗腫瘤藥物。

就目前研究結(jié)果顯示，cecropins的毒性機(jī)制很保守，除了通過細(xì)胞膜裂解機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞快速死亡，還可以進(jìn)入細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路，引起細(xì)胞程序性死亡[7]。 Paredes-Gamero等[8]報(bào)道，低濃度的抗菌肽可能是通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+和自由基，激活caspase-3的信號(hào)通路促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡，而高濃度的抗菌肽通過裂解細(xì)胞膜直接促使細(xì)胞死亡。

1材料

1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和人正常胃上皮細(xì)胞GES-1由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2藥品與試劑cecropinXJ：由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)表達(dá)和純化，儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆?；DMEM培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；胎牛血清：美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)：北京Solarbio公司；噻唑藍(lán)(MTT)、Hoechst 33258、2,7′-二氯雙氫熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)、3,3′-二己基含氧碳菁碘代物[DiOC6(3)]：美國Sigma公司；Bax、Bcl-2、caspase-3、細(xì)胞色素C單克隆抗體(1 ∶2 000)：美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH單克隆抗體、HRP-goat anti-mouse IgG：美國Proteintech公司；TRIzol Reagent：美國Invitrogen公司；caspase-3抑制劑Ac-DEVE-fmk、caspase-8抑制劑Ac-IETD-fmk、caspase-9抑制劑Ac-LEHD-fmk：瑞士Enzo Life Sciences公司；caspase-3檢測(cè)試劑盒：上海貝博生物有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus):日本TaKaRa公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒:北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:德國Heraeus公司；7500 system熒光定量PCR儀：美國ABI公司；ImageQuant LAS 4000 min超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀、酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡：德國Leica公司；流式細(xì)胞儀：美國BD公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和人胃上皮細(xì)胞GES-1在含有10%胎牛血清、105U·L-1青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)為了檢測(cè)cecropinXJ對(duì)AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞增殖的影響，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞以每孔4×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。選擇濃度范圍在0~1 000 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，不加cecropinXJ為陰性對(duì)照，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。處理過后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT (5 g·L-1)溶液于37℃避光孵育4 h。然后，每孔加入100 μL DMSO溶液，于酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm/655 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率/%=[(A處理組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化收集0、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h的AGS細(xì)胞，用2.5%戊二醛溶液4℃固定過夜。0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗2 h，加入800 μl 1%鋨酸進(jìn)行雙固定。通過分級(jí)乙醇、丙酮梯度逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋后制備超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.4Hoechst 33258觀察細(xì)胞凋亡情況收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞1×108·L-1，接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。加入濃度分別為0、20、50、80、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后用95%乙醇4℃固定10 min。去固定液，用PBS洗2次后，加入終濃度為0.5 g·L-1的Hoechst 33258染色液，于4℃避光染色10 min。PBS洗滌后，50%甘油封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，按以下公式計(jì)算：細(xì)胞凋亡率/%=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平通過流式細(xì)胞儀測(cè)定H2DCF-DA熒光強(qiáng)度測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞1×108·L-1，接種于6孔板內(nèi)，5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。加入濃度分別為0、20、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入終濃度為10 μmol·L-1的H2DCF-DA熒光探針，于37℃避光孵育30 min。吸去H2DCF-DA熒光探針，用PBS洗2遍后，胰酶消化重懸于1 mL PBS中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

制造活動(dòng)的經(jīng)濟(jì)成本包括其制造活動(dòng)運(yùn)行中的工時(shí)成本以及制造活動(dòng)運(yùn)行的資源消耗成本兩部分。制造活動(dòng)MAi的經(jīng)濟(jì)成本

2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化線粒體膜電位在細(xì)胞凋亡過程中的變化通過 DiOC6(3)進(jìn)行測(cè)定。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞1×108·L-1，接種于6孔板內(nèi)，5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。加入濃度分別為0、20、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入終濃度為40 nmol·L-1的DiOC6(3)染料，于37℃避光孵育30 min。吸去染料，用PBS洗2遍后，胰酶消化重懸于1 mL PBS中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3、細(xì)胞色素C mRNA的表達(dá)培養(yǎng)AGS細(xì)胞大約至80%時(shí)，用不同濃度cecropinXJ 即0、20、50、100 mg·L-1處理24 h。收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。qRT-PCR引物為caspase-3：5′-AGACATACTCCTTCCATCAA-3′(上游)，5′-TCATAGCACAGCATCACT-3′(下游)；細(xì)胞色素C：5′-TGGATACTCTTACACAGCCG-3′(上游)，5′-AAGTCTGCCCTTTCTTCCTT-3′(下游)；Bax：5′-GATGATTGCCGCCGTGGAC-3′(上游)，5′-GGGTGAGGAGGCTTGAGGAG-3′(下游)；Bcl-2：5′-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3′(上游)，5′-GGATCCAGGTGTGCAGGTGC-3′(下游)；GAPDH：5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′(上游)，5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′ (下游)。SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒檢測(cè)mRNA的表達(dá)變化，GAPDH作為內(nèi)參。25 μL反應(yīng)體系包括：12.5 μL Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，1 μL上游引物和下游引物(2.5 μmol·L-1)， 0.5 μL ROX Refrence Dye II (50×)和100 ng cDNA。通過95 ℃ 30 s的預(yù)熱激活DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.8Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3、細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)培養(yǎng)AGS細(xì)胞于100 mm培養(yǎng)皿中，加入濃度分別為0、20、50、80、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，收集5×106個(gè)細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入100 μL冷的細(xì)胞裂解液，高速渦旋振蕩15 s，置冰上裂解15 min。14 000 r·min-1離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg總蛋白的裂解上清，進(jìn)行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗滌膜3次，然后分別與Bax、Bcl-2、caspase-3、細(xì)胞色素C、GAPDH 單克隆抗體(1 ∶2 000) 4℃孵育過夜。TBS/T洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒于ImageQuant LAS 4000 min超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光，GAPDH作為內(nèi)參。

2.9Caspase-3活性的檢測(cè)培養(yǎng)AGS細(xì)胞于100 mm培養(yǎng)皿中，加入濃度分別為0、20、50、80、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，收集5×106個(gè)細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，按試劑盒說明書方法重懸于100 μL冷的裂解緩沖液中，高速渦旋振蕩15 s，置冰上裂解15 min。14 000 r·min-1離心15 min，取上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg總蛋白的裂解上清，加入90 μL檢測(cè)緩沖液，加入10 μL Ac-DEVD-pNA，在37℃避光反應(yīng)2 h或過夜。測(cè)定405 nm下的吸光度值(A值)。根據(jù)處理組細(xì)胞的吸光度值與空白對(duì)照細(xì)胞的吸光度值的比值計(jì)算caspase-3的相對(duì)活性。caspase-3的相對(duì)活性=A處理組/A對(duì)照組。

2.10Caspase抑制劑對(duì)cecropinXJ介導(dǎo)的AGS細(xì)胞死亡的影響為了確定cecropinXJ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能有caspase相關(guān)的信號(hào)通路參與，將caspase-3抑制劑(Ac-DEVD-fmk)、caspase-8抑制劑(Ac-IETD-fmk)、caspase-9抑制劑(Ac-LEHD-fmk)與AGS細(xì)胞共孵育1 h，加入濃度分別為0、60 mg·L-1cecropinXJ進(jìn)行處理，cecropinXJ單獨(dú)處理作為對(duì)照。通過MTT法檢測(cè)caspase抑制劑對(duì)cecropinXJ介導(dǎo)的AGS細(xì)胞死亡的影響。

3結(jié)果

3.1CecropinXJ抑制AGS細(xì)胞的增殖通過MTT法檢測(cè)濃度范圍在0.01~1 000 mg·L-1cecropinXJ對(duì)AGS細(xì)胞和GES-1細(xì)胞增殖的影響，F(xiàn)ig 1結(jié)果顯示,經(jīng)cecropinXJ處理24 h后，與對(duì)照組相比，cecropinXJ從濃度0.5 mg·L-1開始能明顯抑制AGS細(xì)胞的增殖(P<0.05)，并具有濃度依賴性。其半數(shù)有效抑制濃度IC50=61.19 mg·L-1。但cecropinXJ對(duì)GES-1細(xì)胞作用24 h后，在作用濃度為200 mg·L-1以內(nèi)時(shí)，對(duì)GES-1細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖幾乎沒有影響，而當(dāng)cecropinXJ作用濃度達(dá)到500 mg·L-1時(shí)，對(duì)GES-1的生長(zhǎng)才具有明顯抑制作用(P<0.05)。由此可知，cecropinXJ對(duì)于非腫瘤細(xì)胞系在一定濃度范圍內(nèi)不具有增殖抑制作用，而當(dāng)cecropinXJ濃度大于500 mg·L-1時(shí)，對(duì)非腫瘤細(xì)胞系具有增殖抑制作用，而該抑制作用可能與細(xì)胞毒性相關(guān)。

Fig 1　Effects of cecropinXJ on the proliferation of

*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group

3.2CecropinXJ破壞AGS細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)如Fig 2所示，正常的AGS細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整，并可見大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體。細(xì)胞核內(nèi)染色體分布均勻，核仁清晰。而用50 mg·L-1cecropinXJ處理的AGS細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)被破壞，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，并集聚于核膜周圍。核膜、胞膜、各細(xì)胞器膜均完整。100 mg·L-1cecropinXJ處理的AGS細(xì)胞大多為壞死的細(xì)胞，這些細(xì)胞的染色質(zhì)呈不規(guī)則的團(tuán)塊狀，但不像凋亡細(xì)胞那樣集中于核周邊。細(xì)胞膜、核膜和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)被破壞，線粒體空泡化，細(xì)胞崩解，胞質(zhì)及其內(nèi)容物外泄。

Fig 2Effects of cecropinXJ on morphology of AGS cells

by transmission electron microscopy

3.3CecropinXJ誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化通過Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Hoechst 33258熒光染色圖片顯示，對(duì)照組的細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞核為藍(lán)色均勻淡染。而不同濃度cecropinXJ處理24 h后的AGS細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)致密深染并片段化，表現(xiàn)為典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。如Fig 3所示，隨著cecropinXJ濃度的增加，這種致密深染的細(xì)胞的數(shù)量也隨之增加，至80 mg·L-1時(shí)AGS細(xì)胞總凋亡率已達(dá)到了(45.73±1.94)%。依據(jù)這些形態(tài)學(xué)的變化說明cecropinXJ能夠引起AGS細(xì)胞的凋亡。

3.4CecropinXJ促進(jìn)AGS細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的含量變化對(duì)于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。為了探討cecropinXJ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化相關(guān)，我們用H2DCF-DA熒光探針檢測(cè)不同濃度cecropinXJ處理24 h后AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的變化，其中DCF的熒光強(qiáng)度反映了活性氧的水平。Fig 4結(jié)果顯示，經(jīng)20 mg·L-1和50 mg·L-1cecropinXJ處理后AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加，但無顯著性差異，而100 mg·L-1cecropinXJ處理后，AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧含量明顯增加(P<0.01)。結(jié)果表明，cecropinXJ可促進(jìn)AGS細(xì)胞活性氧產(chǎn)生，并具有濃度依賴性。

Fig 3　Changes in apoptotic nuclear morphology of cecropinXJ-treated AGS cells by Hoechst 33258 staining (magnification:10×)

*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·L-1cecropin XJ group

Fig 4 CecropinXJ promotes ROS production of AGS cells

Fig 5CecropinXJ decreases mitochondrial membrane potential in AGS cells

**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group

Fig 6Effects of cecropinXJ on expression of caspase-3,

Bcl-2, Bax and cytochrome C in AGS cells

A: The relative expression of caspase-3, Bcl-2, Bax and cytochrome C by qRT-PCR; B: The protein expression of caspase-3, Bcl-2, Bax and cytochrome C by Western blot. GAPDH was used as reference.**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group

3.5CecropinXJ降低線粒體膜電位(Δψm)為了驗(yàn)證cecropinXJ處理后能否誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位的改變，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DiOC6(3)熒光染料的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度下降說明線粒體膜遭到破壞，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。Fig 5結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理后熒光強(qiáng)度從(1 188.32±5.50)減弱到(985.89±42.31)、(643.96±94.91) 和(533.56±36.58)，具有濃度依賴性。此結(jié)果表明，cecropinXJ可改變線粒體膜的通透性從而降低線粒體膜電位。

3.6CecropinXJ對(duì)AGS細(xì)胞中caspase-3、Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C表達(dá)的影響caspase家族和Bcl-2家族在細(xì)胞的凋亡過程中扮演舉足輕重的作用，在本實(shí)驗(yàn)中，選取了caspase家族中的caspase-3以及Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，通過qRT-PCR和Western blot的方法進(jìn)一步驗(yàn)證caspase家族和Bcl-2家族成員是否參與了cecropinXJ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。如Fig 6所示，經(jīng)cecropinXJ處理之后，caspase-3被剪切，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax和細(xì)胞色素C表達(dá)均上調(diào)，并具有濃度依賴性。研究表明，當(dāng)Bcl-2/Bax表達(dá)比率發(fā)生變化時(shí)，可改變線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活caspase-3，使細(xì)胞凋亡[11]。

Fig 7　CecropinXJ regulates caspase activity

A: AGS cells were treated with various concentration of cecropinXJ (0, 20, 50, 80, 100 mg·L-1) for 24 h and detected caspase-3 activity by caspase activity detection kit.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group; B: MTT assays detected the cell death ratio induced by cecropinXJ after addition of caspase-3 inhibitor (Ac-DEVE-fmk), caspase-8 inhibitor (Ac-IETD-fmk) and caspase-9 inhibitor (Ac-LEHD-fmk).**P<0.01vscecropin XJ group.

3.7CecropinXJ調(diào)節(jié)caspase-3的活性細(xì)胞凋亡的過程涉及一系列蛋白酶活性的變化，其中絕大多數(shù)為caspase酶。為了進(jìn)一步確定cecropinXJ激活的凋亡信號(hào)途徑，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性以及用caspase-3抑制劑Ac-DEVE-fmk、caspase-8抑制劑Ac-IETD-fmk、caspase-9抑制劑Ac-LEHD-fmk處理后對(duì)cecropinXJ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響。如Fig 7所示，50 mg·L-1cecropinXJ處理24 h后，caspase-3的活性較對(duì)照組相比具有明顯的增加(P<0.05)，是對(duì)照組的1.4倍，而100 mg·L-1cecropinXJ處理后，caspase-3的活性是對(duì)照組的2.39倍，說明cecropinXJ可激活caspase-3的活性并具有濃度依賴性。在AGS細(xì)胞中，caspase-3抑制劑Ac-DEVE-fmk和caspase-9抑制劑Ac-LEHD-fmk均能明顯地降低cecropinXJ誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞死亡率，分別可使細(xì)胞的死亡率從(51.70±7.19)%減少到(23.93±6.66)%和(31.6±9.61)%，而caspase-8抑制劑Ac-IETD-fmk對(duì)細(xì)胞死亡率無影響。表明caspase-3和caspase-9參與cecropinXJ激活的凋亡信號(hào)途徑，caspase-8與此通路無關(guān)。

4討論

目前發(fā)現(xiàn)許多抗菌肽具有抗腫瘤活性，并且已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)。自Moore等[12]首次發(fā)現(xiàn) Cecropin B對(duì)哺乳動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性以來，許多文獻(xiàn)相繼報(bào)道了Cecropin家族的抗菌肽對(duì)胃癌、膀胱癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有殺傷作用[13]，并且由于其結(jié)構(gòu)本身能形成特定的兩親α-螺旋，可針對(duì)非極性脂質(zhì)的細(xì)胞膜，當(dāng)在膜上定位時(shí)，它們?cè)谀ど闲纬呻x子滲透通道，隨后進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞去極化，發(fā)生不可逆的細(xì)胞破裂，最后死亡。Zhang等[14]研究證明來自于中國柞蠶的cecropin對(duì)大鼠大腸癌細(xì)胞具有明顯的抗腫瘤作用，但對(duì)人正常胃上皮細(xì)胞毒性低，表明cecropins能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，但對(duì)正常的真核細(xì)胞影響甚微。Hui等[15]通過檢測(cè)cecropin A 對(duì)白血病細(xì)胞的IC50顯示，cecropin A 可裂解白血病細(xì)胞，但對(duì)淋巴細(xì)胞無毒副作用，而傳統(tǒng)的化療藥物如5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞無選擇性。通過 MTT檢測(cè)顯示，cecropinXJ在500 mg·L-1作用濃度范圍內(nèi)對(duì)正常胃上皮細(xì)胞系GES-1的增殖幾乎沒有影響，并且能明顯抑制AGS細(xì)胞增殖，隨著濃度的增高，抑制效果增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，其IC50=61.19 mg·L-1，此結(jié)果表明cecropinXJ同其他的cecropins一樣具有對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷作用。形態(tài)學(xué)的改變是判斷凋亡的基礎(chǔ)，主要特點(diǎn)有染色質(zhì)固縮、DNA片段化、線粒體腫脹或是出現(xiàn)凋亡小體[16-17]。透射電鏡和Hoechst 33258熒光染色結(jié)果顯示，cecropinXJ處理的AGS細(xì)胞具有明顯的凋亡現(xiàn)象，且隨著濃度的增加凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯呈增多的趨勢(shì)。

大多數(shù)的抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到的，細(xì)胞凋亡的途徑主要為Fas死亡受體途徑和線粒體內(nèi)途徑。據(jù)報(bào)道，引起腫瘤細(xì)胞凋亡主要的途徑是線粒體內(nèi)途徑[18]。Risso等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可增加細(xì)胞膜通透性隨之進(jìn)入胞內(nèi)，由于線粒體膜帶有大量負(fù)電荷分子，陽離子的抗菌肽通過靜電作用與線粒體膜作用，使線粒體膜電位下降，隨后細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧作為強(qiáng)烈的凋亡誘導(dǎo)信號(hào)，過量的活性氧增加線粒體膜通透性，凋亡啟動(dòng)因子細(xì)胞色素C被釋放并激活半胱氨酸水解酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體外研究抗菌肽或cecropins誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的文獻(xiàn)很多，如Cerón等[20]報(bào)道cecropin A可誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是由于cecropin A促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸外翻和DNA片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但此過程不引起caspase酶的激活。而另外一種抗菌肽蜂毒肽 (melittin)，在蜂毒中發(fā)現(xiàn)的一種含有26個(gè)氨基酸的抗菌肽，通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧、激活caspase誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)cecropinXJ處理以后活性氧在AGS細(xì)胞內(nèi)迅速積累，并且線粒體膜電位下降，這表明cecropinXJ參與AGS細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。為了進(jìn)一步確認(rèn)cecropinXJ是否是通過caspase依賴的途徑，通過qRT-PCR、Western blot以及酶活性的檢測(cè)確定cecropinXJ對(duì)caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果表明，cecropinXJ在mRNA和蛋白水平上均可上調(diào)caspase-3的表達(dá)，而且caspase-3的活性隨著cecropinXJ濃度的增加而逐漸增加，在使用caspase-3和caspase-9抑制劑之后降低了cecropinXJ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率，但是caspase-8抑制劑無此效果，說明caspase-8不參與cecropinXJ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。綜上結(jié)果顯示cecropinXJ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是依賴caspase的途徑。

Bcl-2是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控因子，主要定位在核膜的胞質(zhì)面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，包括促凋亡(如Bax)和抗凋亡(如Bcl-2)兩類家族，其中Bax和Bcl-2往往成比例存在，Bax的表達(dá)上調(diào)能夠拮抗Bcl-2的抑凋亡效應(yīng)。當(dāng)Bax/Bcl-2比例上升時(shí)，線粒體膜電位發(fā)生變化，可導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因子(如細(xì)胞色素C)從線粒體內(nèi)釋放出來，激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]。通過cecropinXJ處理之后，AGS細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)，使Bax/Bcl-2比例明顯增高，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。說明cecropinXJ對(duì)線粒體膜的影響是顯著的，這與線粒體膜電位的結(jié)果相一致。

綜上所述，cecropinXJ對(duì)AGS細(xì)胞的增殖有抑制作用，其抗腫瘤活性可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。其凋亡的相關(guān)機(jī)制可能為cecropinXJ處理之后引起AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的升高，Bax/Bcl-2比例上升，從而使線粒體膜電位下降，增加線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放并激活caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，cecropinXJ可能是通過線粒體內(nèi)途徑的機(jī)制誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步開發(fā)cecropinXJ成為抗腫瘤藥物奠定了理論基礎(chǔ)。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.009.html

Apoptosis of human gastric carcinoma AGS cells induced by cecropinXJ

WU Yan-ling, XIA Li-jie, ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,

XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract:AimTo investigate the apoptosis of human gastric carcinoma AGS cells induced by cecropinXJ. MethodsHuman gastric carcinoma AGS cells and human normal epithelial cells GES-1 were co-cultured with different concentrations of cecropinXJ ranging from 0.01 to 1 000 mg·L-1for 24 h. MTT assay was used to observe the effects of cecropinXJ on the proliferation of AGS cells and GES-1 cells. The ultrastructural changes of the AGS cells were observed by transmission electron microscopy. Hoechst staining was used to detect cell apoptosis. The changes of intracellular reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial potential were analysed by flow cytometery. The expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and cytochrome C in mRNA level was investigated by qRT-PCR. Western blot was used to determine the protein expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and cytochrome C. ResultsCecropinXJ significantly suppressed the proliferation of AGS cells in vitro (P<0.05) in a dose-dependent manner, IC50=61.19 mg·L-1, but had no inhibitive effects on the proliferation of GES-1 cells. After treatment for 24 h, cecropinXJ induced AGS cells nuclear condensation, and increased ROS production, disrupted mitochondrial integrity. The results of qRT-PCR and Western blot demonstrated cecropinXJ could up-regulate the expression of Bax and down-regulate the expression of Bcl-2, promote the release of cytochrome C and activate caspase-3. Meanwhile, cecropinXJ promoted caspase-3 activity in a dose-dependent manner, and cell death ratio of AGS cells induced by cecropinXJ was significantly reduced by caspase-3 and caspase-9 specific inhibitors treatment. ConclusionCecropinXJ can induce apoptosis of AGS cells by downregulating Bcl-2, upregulating Bax and activating caspase-3, which may be one of its anti-tumor mechanisms.

Key words:cecropinXJ; human gastric carcinoma; AGS cells; cell apoptosis; Bcl-2; Bax; caspase-3; anti-tumor

通訊作者張富春(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，，E-mail: zfcxju@xju.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：吳艷玲(1991-)，女，碩士生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail: 394219460@qq.com；

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No 201110101)

收稿日期:2014-09-21,修回日期:2014-10-28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0186-08

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.009