吉曉霞，曾　穎，何　潔，譚　暉，易　嵐，黃衛(wèi)國(guó)，伍尤華，蘇　琦

(1.山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院病理科，山西 運(yùn)城　044000；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽　421002；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，湖南 衡陽　421002)

DADS通過Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯

吉曉霞1,2，曾穎2，何潔2，譚暉2，易嵐2，黃衛(wèi)國(guó)2，伍尤華3，蘇琦2

(1.山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院病理科，山西 運(yùn)城044000；2.南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽421002；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，湖南 衡陽421002)

摘要：目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞周期阻滯及其分子機(jī)制。方法采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)觀察DADS對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與周期阻滯效應(yīng)。Western blot檢測(cè)DADS對(duì)HL-60細(xì)胞Chk1/2以及下游分子的影響。結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，60、120 μmol·L-1DADS處理后，其群體倍增時(shí)間從19.14 h增加到35.03、71.82 h (P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，30、60、90、120 μmol·L-1DADS對(duì)HL-60細(xì)胞克隆形成率的抑制率分別為35.06%、62.10%、93.79%、99.35% (P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示， 60和120μmol·L-1DADS分別作用HL-60細(xì)胞24 h后，DADS可呈時(shí)間與濃度依賴性誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯 (P<0.05)。60 μmol·L-1DADS處理HL-60細(xì)胞后，p-Chk1可呈時(shí)間依賴性上調(diào) (P<0.05)，而Chk1與Chk2總蛋白和p-Chk2無改變 (P>0.05)。并且，Cdc25C、CyclinB1和CDK1分別呈時(shí)間依賴性下調(diào) (P<0.05)，但 14-3-3蛋白表達(dá)沒有改變 (P>0.05)。結(jié)論DADS能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖，并通過Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滯HL-60細(xì)胞于G2/M期。

關(guān)鍵詞：二烯丙基二硫；人白血病HL-60細(xì)胞；增殖抑制；G2/M期阻滯；Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路；分子機(jī)制

白血病是常見惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例約30萬，死亡率高達(dá)70%，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。研究表明，二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)可抑制白血病等多種腫瘤增殖，其機(jī)制與增加組蛋白乙?；揎棧铚[瘤細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)分化等有關(guān)[2]。我們前期工作證實(shí)，DADS能明顯抑制人白血病HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制與G2/M期阻滯，抑制ERK和激活p38、JNK信號(hào)通路，活化caspase，下調(diào)Bag-1、Bcl-2、PCNA、Mcl-1、CDK1，上調(diào)Fas-L、Bax，通過上調(diào)Rac2介導(dǎo)Rac2-NADPH氧化酶-ROS-JNK通路等有關(guān)[3-8]。

腫瘤是多基因變化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂的一類疾病，G2/M期檢測(cè)點(diǎn)激酶Chk1和Chk2在細(xì)胞癌變過程中起著至關(guān)重要的作用，其介導(dǎo)Cdc25 磷酸酶與Cdks的活化和抑制是控制細(xì)胞G2/M期的關(guān)鍵[9]。本研究探討DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制，了解Chk與細(xì)胞周期之間的相互作用，從而為DADS防治HL-60細(xì)胞的信號(hào)干預(yù)治療提供新思路。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑HL-60細(xì)胞為人急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。DADS：Fluka公司產(chǎn)品，d420=1.0，Mr 146.28，純度80%，含10%~20% DAS。DADS與Tween 80以1 ∶2的比例充分溶解后，加入體積分?jǐn)?shù)為0.90的生理鹽水稀釋100倍，震蕩混勻，作為母液保存于-20℃冰箱中，臨用時(shí)將此母液稀釋至所需濃度。Tween 80為華美公司產(chǎn)品。培養(yǎng)液：Gibco公司產(chǎn)品。RPMI 1640培養(yǎng)基10.4 g溶于1 000 mL蒸餾水中，加NaHCO32 g，用1 mol·L-1HCl調(diào)pH值為7.0，抽濾除菌，4℃冰箱保存，臨用時(shí)加10%小牛血清。小牛血清：杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，臨用時(shí)經(jīng)56℃水浴30 min滅活，-20℃保存。BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Pierce公司；顯影定影試劑盒、麗春紅染色液、預(yù)染蛋白Marker購于Fermentas公司。ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒、Chk1(FL-467)、Chk2(H-300)、14-3-3 (aC-12)與CDK1多克隆抗體購于Santa Cruz公司；P-Chk1 (Ser345) 多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；P-Chk2 (T387) 多克隆抗體購于美國(guó)Abzoom公司；羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購自KPL 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI-1640，每2~3天換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組不加DADS，溶媒對(duì)照組加等量的Tween 80，處理組加DADS。

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，加處理因素，每24 h取4復(fù)孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)4次，求出3孔細(xì)胞的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，連續(xù)計(jì)數(shù)4 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。腫瘤細(xì)胞群體倍增時(shí)間按公式計(jì)算：TD=t×lg2/lg(Nt/N0)(Nt為t時(shí)間的細(xì)胞數(shù)，N0為初種細(xì)胞數(shù))。

1.4軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心，加培養(yǎng)基重懸使之分散成單個(gè)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.25×106·L-1。取出37℃保溫的不同密度的細(xì)胞懸液4 mL移入小燒杯中，加入50℃的5%瓊脂1 mL，迅速混勻，即配成0.2%瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入24孔培養(yǎng)板中，每孔加1 mL，置室溫使瓊脂凝固。培養(yǎng)板移入CO2孵箱，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)2~3周。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75 μm或含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆，并計(jì)算形成抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)設(shè)立空白對(duì)照組和藥物處理組，藥物處理組包括30、60、120 μmol·L-1DADS分別作用24 h。1 000 r·min-1離心5 min，收集培養(yǎng)細(xì)胞，預(yù)冷PBS吹打重懸，離心沉淀，重復(fù)1次。用4℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞，冰盒送檢。樣本上機(jī)前離心洗滌，棄上清，加1 g·L-1碘化丙啶50 μL，振蕩混勻，避光置冰箱30 min，上機(jī)檢測(cè)時(shí)300目尼龍網(wǎng)濾過，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期和DNA含量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western blot分別收集細(xì)胞，冰PBS洗兩次，以1×107個(gè)細(xì)胞濃度加入100 μL裂解液(100 mmol·L-1NaCl, 10 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.6,1 mmol·L-1EDTA pH8.0,1 mg·L-1Aprotinin, 100 mg·L-1PMSF)，冰上裂解1 h，12 000 r·min-1離心10 min，吸出上清液，即為細(xì)胞總蛋白。根據(jù)Bradford法，分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，以溶劑為空白對(duì)照，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算蛋白質(zhì)含量。收集蛋白，變性后經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L-1，NaCl 137 mmol·L-1含0.1% Tween-20)封閉1h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min;相應(yīng)的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞群體倍增時(shí)間HL-60細(xì)胞群體倍增時(shí)間為19.14 h，隨著DADS濃度增加到60、120 μmol·L-1，細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別延長(zhǎng)到35.03、71.82 h(P<0.05)。Tween 80和30 μmol·L-1DADS對(duì)HL-60細(xì)胞群體倍增時(shí)間無明顯影響 (P>0.05)。

2.2DADS對(duì)HL-60細(xì)胞克隆形成的影響Fig 1顯示，30、60、90、120 μmol·L-1DADS對(duì)HL-60細(xì)胞軟瓊脂克隆形成的抑制率分別為35.06%、62.10%、93.79%、99.35%，抑制作用呈劑量依賴關(guān)系 (P<0.05)。Tween 80對(duì)HL-60克隆形成無明顯影響 (P>0.05)。

Fig 1Clone formation of HL-60 cells by DADS (×20)

A: Control HL-60 cells; B: Tween-80; C: DADS 30 μmol·L-1; D: DADS 60 μmol·L-1; E: DADS 90 μmol·L-1; F: DADS 120 μmol·L-1

2.3DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的周期阻滯作用Fig 2顯示，60、120 μmol·L-1DADS作用HL-60細(xì)胞24 h后，G2/M期百分率增加到17.6%、22.3%，與對(duì)照組比較差異有顯著性 (P<0.05)。表明DADS可阻滯HL-60細(xì)胞于G2/M期。

Fig 2Effect of G2/M in HL-60 cells treated by

DADS at different time

A: Control; B: DADS 30 μmol·L-1; C:DADS 60 μmol·L-1; D:DADS 120 μmol·L-1

2.4DADS對(duì)HL-60細(xì)胞Chk1和磷酸化Chk1表達(dá)的影響Fig 3顯示，60 μmol·L-1DADS作用HL-60細(xì)胞1 h后，與對(duì)照組比較，p-Chk1表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào) (P<0.05)；Chk1總蛋白表達(dá)無改變 (P>0.05)。

Fig 3Expression of Chk1 and p-Chk1

in HL-60 cells treated by DADS

*P<0.05vscontrol (0 h)

2.5DADS對(duì)HL-60細(xì)胞Chk2和p-Chk2表達(dá)的影響Fig 4顯示，60 μmol·L-1DADS在作用不同時(shí)間后，與對(duì)照組比較，Chk2與p-Chk2隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)無明顯差異 (P>0.05)。

Fig 4Expression of Chk2 and p-Chk2

in HL-60 cells treated by DADS

2.6DADS對(duì)HL-60細(xì)胞Chk下游分子Cdc25C表達(dá)的影響Fig 5顯示，60 μmol·L-1DADS處理HL-60細(xì)胞4 h后，與對(duì)照組比較，Cdc25C表達(dá)開始下降，到36 h，Cdc25C下調(diào)90.16%，DADS呈時(shí)間依賴性抑制Cdc25C表達(dá) (P<0.05)。

Fig 5Effect of DADS on expression of Cdc25C in HL-60 cells

*P<0.05vscontrol

2.7DADS對(duì)HL-60細(xì)胞Chk下游分子Cyclin B1表達(dá)的影響Fig 6顯示，DADS處理4 h后，Cyclin B1的表達(dá)即開始下調(diào)，DADS處理12 h后，CyclinB1的表達(dá)明顯下調(diào) (P<0.05)；36 h時(shí)，與對(duì)照組比較，CyclinB1表達(dá)明顯下降89.02% (P<0.05)。

Fig 6Effect of DADS on expression of CyclinB1 in HL-60 cells

*P<0.05vscontrol

2.8DADS對(duì)HL-60細(xì)胞Chk下游分子CDK1表達(dá)的影響Fig 7顯示，60 μmol·L-1DADS呈時(shí)間依賴性抑制HL-60細(xì)胞CDK1表達(dá) (P<0.05)。DADS處理4 h后，CDK1表達(dá)即開始下調(diào)，處理8 h后，CDK1表達(dá)明顯下降，到36 h時(shí)，CDK1表達(dá)下調(diào)34.87% (P<0.05)。

Fig 7Effect of DADS on expression of CDK1 in HL-60 cells

*P<0.05vscontrol

2.9DADS對(duì)HL-60細(xì)胞14-3-3蛋白表達(dá)的影響60 μmol·L-1DADS處理后，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，14-3-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組無明顯差異 (P>0.05)。

3討論

本研究采用細(xì)胞計(jì)數(shù)與軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DADS可明顯抑制白血病HL-60細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)細(xì)胞群體倍增時(shí)間，抑制細(xì)胞克隆形成，并隨濃度的增加而作用增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，60、120 μmol·L-1DADS作用HL-60細(xì)胞24 h后，DADS呈濃度依賴性阻滯HL-60細(xì)胞G2/M期，表明DADS抑制HL-60細(xì)胞增殖效應(yīng)與G2/M期阻滯有密切關(guān)系。

細(xì)胞周期調(diào)控在腫瘤的發(fā)生和治療中起著重要的作用。DNA損害有G1/S、S與G2/M檢查點(diǎn)，這些檢查點(diǎn)能夠使DNA容易修復(fù)和促進(jìn)未修復(fù)的細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤細(xì)胞檢查點(diǎn)，已成為腫瘤治療的新策略。G2/M期檢測(cè)點(diǎn)能防止受損的DNA和未完成復(fù)制的DNA進(jìn)入有絲分裂，故G2/M期阻滯顯得更為重要。目前，已經(jīng)研發(fā)許多特異性靶向檢查點(diǎn)的化合物，其靶點(diǎn)之一是Chk1[7]。目前認(rèn)為，調(diào)控細(xì)胞周期G2/M阻滯途徑主要是ATR/Chk1/Cdc25C。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，Chk1在絲氨酸317和345位點(diǎn)被ATR磷酸化?；罨腃hk1可通過特異性磷酸化Cdc25C，阻止Cdc25C對(duì)Cdc2的去磷酸化作用，從而抑制CDK1與Cyclin B復(fù)合物的活性，阻滯細(xì)胞在G2/M期[8-15]。Yu 等[8]研究顯示，mTOR抑制劑RAD001與輻射結(jié)合可通過活化Chk1，抑制CDK1與cyclin B1復(fù)合物形成，阻滯口腔癌SCC4細(xì)胞于G2/M。NSC746364可通過ATR/Chk1通路下調(diào)cyclin B1與激活caspase-3，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞G2/M阻滯與凋亡[9]。MMEQ可促進(jìn)Chk1與Cdc25c表達(dá)，誘導(dǎo)膀胱癌TSGH8301細(xì)胞G2/M阻滯[10]。洋地黃毒苷及其衍生物D6-MA誘導(dǎo)肺癌NCI-H460細(xì)胞凋亡與G2/M阻滯和Chk1/2和p53相關(guān)蛋白下調(diào)有關(guān)[11]。鬼臼毒素HY-1可通過ATR-Chk1-Cdc25C通路調(diào)控結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞G2/M阻滯[12]。雞血藤能夠通過磷酸化Chk1/Chk2抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞和結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖與阻滯在G2/M[13]。Glionitrin A可活化ATM-ATR-Chk1/2通路，上調(diào)p-histone 2AX，促進(jìn)前列腺癌DU145細(xì)胞S與G2/M阻滯與凋亡[14]。我們研究顯示，DADS可磷酸化Chk1，而不是Chk2，下調(diào)Cdc25C與Cyclin B1，阻滯人胃癌BGC823細(xì)胞在G2/M期。并且，Chk1轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞可增加G2/M阻滯，而沉默Chk1可消除DADS下調(diào)Cdc25C與Cyclin B1和G2/M阻滯。但是，Chk2高表達(dá)與沉默Chk2無此作用。表明DADS是通過特異性Chk1磷酸化，而不是Chk2，調(diào)控Chk1/Cdc25C/Cyclin B1通路誘導(dǎo) BGC823細(xì)胞G2/M阻滯[15]。

關(guān)于白血病的研究，Yuan 等[16]發(fā)現(xiàn)，Pim 激酶可在Ser 280磷酸化Chk1誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡與G2/M阻滯。Chk1在熱應(yīng)激誘導(dǎo)白血病Jurkat細(xì)胞凋亡與G2/M阻滯起著重要作用，Chk1抑制劑與干擾Chk1可廢除熱應(yīng)激誘導(dǎo)白血病Jurkat細(xì)胞凋亡與G2/M檢查點(diǎn)活化，有趣的是，ATR-Chk1途徑優(yōu)先活化，而不是ATR-Chk2[17]。本研究結(jié)果顯示，DADS處理HL-60細(xì)胞后，p-Chk1表達(dá)上調(diào)，而p-Chk2沒有改變，表明DADS激活Chk1，而不是Chk2，并且，Cdc25C呈時(shí)間依賴性表達(dá)下降，隨即Cyclin B1和CDK1幾乎同時(shí)下調(diào)，表明Chk1活化可抑制Cdc25C活性，影響CDK1與Cyclin B1復(fù)合物的活化，從而導(dǎo)致G2/M阻滯，提示DADS通過Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路導(dǎo)致HL-60細(xì)胞阻滯于G2/M期。本研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白表達(dá)沒有改變，其是否與Cdc25C結(jié)合調(diào)控Cdc25C活性，影響Cyclin B1和CDK1作用尚待進(jìn)一步研究。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.015.html

DADS induces G2/M arrest through Chk1/Cdc25C/CyclinB1/

CDK1 pathway in human leukemia HL-60 cells

JI Xiao-xia1,2, ZENG Ying2, HE Jie2, TAN Hui2, YI Lan2, HUANG Wei-guo2, WU You-hua3, SU Qi2

(1.DeptofPathology,YunchengCentralHospital,YunchengShanxi044000,China; 2.CancerResearchInstitute,

KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversity,HengyangHunan421002,China;

3.DeptofOncology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421002,China)

AbstractAimTo study the effects of cycle arrest and molecular mechanism in human leukemia HL-60 cells induced by diallyl disulfide (DADS). MethodsCell count, colony formation in soft agar experiments and flow cytometry analysis were employed to observe the DADS-induced cell growth inhibition and the effect of cycle arrest in HL-60 cells. The expressions of Chk1/2 and its downstream element in HL-60 cells were detected by Western blot. ResultsCell count revealed that population doubling time increased to 35.03 h and 71.82 h, respectively, from 19.14 h in HL-60 cells treated with 60 and 120 μmol·L-1DADS (P<0.05). Colony formation in soft agar experiments showed that colony formation inhibition rate of HL-60 cells exposed to 30, 60, 90 and 120 μmol·L-1DADS increased to 35.06%, 62.10%, 93.79% and 99.35%, respectively (P<0.05). Flow cytometry analysis exhibited that HL-60 cells treated with 60 and 120 μmol·L-1DADS for 24 h and 48h arrested in G2/M phase in a concentration-and time-dependent manner (P<0.05). Western blot disclosed that the expression of p-Chk1 increased in a time-dependent manner (P<0.05); however, Chk1, Chk2 and p-Chk2 were not changed in HL-60 cells treated with 60 μmol·L-1DADS (P>0.05). The expression of Cdc25C, CyclinB1 and CDK1 decreased after treated with 60 μmol·L-1DADS in a time-dependent manner (P<0.05), but the expression of 14-3-3 protein did not change (P>0.05). ConclusionDADS can inhibit the proliferation of HL-60 cells, and induce G2/M arrest through Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1 pathway.

Key words:diallyl disulfide; leukemia HL-60 cells; growth inhibition; G2/M arrest; Chk1/Cdc25C/CyclinB1/CDK1 pathway; molecular mechanism

通訊作者伍尤華(1962-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：惡性腫瘤的化學(xué)治療，，E-mail: 330270372@qq.com; 蘇琦(1945-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤發(fā)生及防治的分子機(jī)制，，Tel/Fax: 0734-8281547，E-mail:suqi1945@163.com

作者簡(jiǎn)介：曾穎(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：腫瘤防治的分子機(jī)制，并列第一作者，E-mail: zengying2003@126.com;

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31201027, 81100375)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(No 10C1184)

收稿日期:2014-11-09,修回日期:2014-12-08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：中國(guó)圖書分類號(hào)：R329.24；R329.28；R733.7；R916.4；R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.015