*通信作者:劉選明,博士,教授,主要從植物分子生物學(xué)方向研究。E-mail:xml05@hnu.edu.cn

擬南芥GH3.9基因的過表達(dá)及其表型分析

周蘋,唐冬英,郭明,譚振華,趙小英,劉選明*

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院,植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410082)

摘要:為研究GH3.9基因在植物生長發(fā)育過程中的作用,利用RT-PCR成功克隆到GH3.9基因,該基因全長為1 750 bp。通過構(gòu)建pEGAD-GH3.9過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得過表達(dá)GH3.9基因純系轉(zhuǎn)基因株系GH3.9ox-3和GH3.9ox-7。對擬南芥野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因株系(GH3.9ox-3和GH3.9ox-7)幼苗用不同光強(qiáng)和光質(zhì)進(jìn)行處理,結(jié)果顯示:在藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光等不同光照強(qiáng)度下培養(yǎng),過表達(dá)株系幼苗下胚軸的生長均明顯受到抑制,且較野生型明顯;采用不同光周期處理擬南芥幼苗,過表達(dá)幼苗下胚軸的伸長明顯低于野生型;對成年植株表型進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系植株矮小、雄蕊變短、果莢短小。研究表明:GH3.9基因參與了擬南芥生長發(fā)育調(diào)控,過表達(dá)GH3.9基因?qū)M南芥生長有抑制作用。

關(guān)鍵詞:擬南芥;GH3.9基因;過表達(dá);表型分析

收稿日期:2014-10-15;修改稿收到日期:2015-01-18

基金項(xiàng)目:湖南省自然科學(xué)基金(11JJA002);湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心(20134486)

作者簡介:周蘋(1972-),女,碩士,實(shí)驗(yàn)師,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:76615803@qq.com

中圖分類號:Q785;Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Overexpression and Phenotype Analysis ofGH3.9

Gene inArabidopsisthaliana

ZHOU Ping,TANGdongying,GUO Ming,TAN Zhenhua,ZHAO Xiaoying,LIU Xuanming*

(Hunan Province Key Laboratory of Plant Functional Genomics anddevelopmental Regulation,College of Biology,Hunan University,Changsha 410082,China)

Abstract:To investigate the role of GH3.9 in plant growth anddevelopment,we cloned the 1 750 bp full-length gene with RT-PCR method and obtained GH3.9ox-3 and GH3.9ox-9 pure lines of Arabidopsis thaliana by constructing pEGAD-GH3.9 overexpression vector and transforming A.thaliana.After treating the sowed wild-type and mutant seeds (GH3.9ox-3 and GH3.9ox-9) with blue,red and far-red light atdifferent intensity,we found that:the growth of hypocotyls in the mutants was more sensitive to the strong light suppression comparing with wild-type.Moreover,the hypocotyls of mutants appeared to grow slower when treateddifferent forms of white light.The mutants plant sizes and silique sizes appeared smaller.The results indicate that GH3.9 gene might play an important role in the growth anddevelopment of plants.

Key words:Arabidopsisthaliana;GH3.9 gene;overexpression;phenotype analysis

植物生長素能夠誘導(dǎo)一些基因快速高表達(dá),這些基因被稱為生長素早期響應(yīng)基因(primary-response genes)[1]。一般在生長素處理后2～3 min就能檢測到基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控植物相關(guān)基因的后續(xù)表達(dá),影響植物的生長發(fā)育[2]。植物的GH3基因是一種典型的植物生長素早期響應(yīng)基因[3]。第一個(gè)GH3基因于1987年在大豆中被發(fā)現(xiàn),后來又陸續(xù)在水稻、擬南芥等植物中發(fā)現(xiàn)GH3基因家族成員。目前在擬南芥的基因組中包括20個(gè)GH3基因,據(jù)其序列的相似性分為3個(gè)亞族[4]。擬南芥大部分GH3蛋白都具有一種或多種植物生長素的氨基酸化合成酶活性[5-6],并參與光信號反應(yīng)途徑[7]。氨基酸化的生長素不具有生物活性,其中部分可以經(jīng)蛋白水解酶水解成活性生長素,另外一部分被分解代謝。GH3蛋白的氨基酸化合成酶的作用和蛋白水解酶的共同作用維持了擬南芥體內(nèi)生長素的動(dòng)態(tài)平衡[8]。

GH3.9基因位于擬南芥的2號染色體上,屬于GH3基因家族的II類,能催化IAA腺苷化以及與氨基酸的連接。研究表明,GH3.9基因的功能缺失突變體僅表現(xiàn)為初生根伸長,對IAA敏感性增強(qiáng),在形態(tài)上沒有多大變化[9-10]。本研究通過構(gòu)建擬南芥GH3.9基因的過表達(dá)載體,獲得了過表達(dá)的純合株系,并從光質(zhì)、光強(qiáng)、光周期等方面對擬南芥下胚軸發(fā)育的影響進(jìn)行了分析,以期探討該基因是否參與了擬南芥光信號反應(yīng)途徑和生長發(fā)育調(diào)控。

1材料和方法

1.1　材　料

本實(shí)驗(yàn)所用的野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Columbia-4生態(tài)型。

1.2　方　法

1.2.1擬南芥材料的收集和處理將擬南芥種子用75%酒精浸泡30 s,再用10% NaClO浸泡10 min,吸出浸泡液后,用無菌水洗4～6次,放入4 ℃冰箱處理4d。0.1%瓊脂懸浮種子,然后直接將種子播在含0.8%瓊脂的固體MS培養(yǎng)基表面,置22 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用于觀察成年植株表型的擬南芥,直接播種在土壤中,22 ℃長日照培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2.2RNA提取和cDNA合成收集16d的野生型擬南芥幼苗,用RNAeasy Mini Kit按照說明提取總RNA,采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA,用作目的基因克隆的模板。根據(jù)Tair(http://arabidopsis.org/)中公布的擬南芥基因組序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,上游引物F1(5′-CCGAATTCATGGATGTAATGAAGCTTGATCACG-3′,引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn))和下游引物R1(5′-TTGGATCCTCATGGAACCCAAGTCGGGTC-3′,引入BamHⅠ酶切位點(diǎn))。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸110 s,38個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物取10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3植物過表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)回收試劑盒操作指南回收PCR產(chǎn)物,將純化的已回收PCR片段與pGEM-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩選鑒定,將陽性克隆送上海生物工程技術(shù)有限公司測序,所得序列分別在TAIR和GenBank進(jìn)行Blast對比分析。將測序正確的質(zhì)粒和pEGAD載體進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切,分別純化回收pEGAD載體線性片段和GH3.9基因片段,然后用T4連接酶連接,構(gòu)建成由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含有GH3.9基因的植物表達(dá)載體。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,并在含有卡那霉素、利福平的LB平板中篩選,獲得陽性克隆。

1.2.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和過表達(dá)純合子的篩選將pEGAD-GH3.9陽性重組質(zhì)粒1 μL和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)40 μL混合,然后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯小槽內(nèi)電擊。菌液涂布于含有卡那霉素50 μg/mL、利福平50 μg/mL的LB平板上,28 ℃培養(yǎng)2～3d。擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。采用花序浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥,成熟期收取轉(zhuǎn)基因種子。

種子經(jīng)表面消毒,置于4 ℃冰箱冷處理4d。播種在培養(yǎng)土中,待長出2片真葉,噴灑1∶1 000的Basta除草劑進(jìn)行篩選,利用GH3.9基因特異性引物,通過RT-PCR對具有Basta抗性的陽性植株進(jìn)行鑒定,篩選GH3.9基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

1.2.5半定量RT-PCR分析采用RNAeasy Mini Kit提取總RNA,采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA。 將cDNA稀釋10倍,20 μL PCR反應(yīng)體系中加1 μL稀釋的cDNA模板。用RT-PCR半定量檢測GH3.9基因的mRNA水平,以持家基因Actin2的PCR產(chǎn)物作為分子內(nèi)標(biāo)(表1)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;接著94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸110 s;循環(huán)數(shù)為35個(gè)。反應(yīng)結(jié)束后,取10 μL PCR反應(yīng)液,在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。RT-PCR反應(yīng)及電泳重復(fù)3次。

1.2.6不同光照強(qiáng)度處理擬南芥幼苗野生型和過表達(dá)植株的種子播種后直接放置于光強(qiáng)度為0.1、1.0、10.0、100.0 μmol·m-2·s-1的藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光及黑暗條件下培養(yǎng),各取20株6日齡幼苗,測量下胚軸長度。

表1　RT-PCR引物

1.2.7不同光周期處理擬南芥幼苗野生型和過表達(dá)植株的種子播種后直接置于不同光周期處理,22 ℃恒溫培養(yǎng),隨后各取20株7日齡幼苗,測量下胚軸長度。長日照處理為16 h光照,8 h黑暗;短日照處理為8 h光照,16 h黑暗。

2結(jié)果與分析

2.1　 GH3.9基因的cDNA合成

以擬南芥Col-4野生型總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模版,PCR擴(kuò)增1 750 bp的GH3.9基因全長,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,擴(kuò)增片段條帶大小與理論大小一致(圖1),說明利用RT-PCR已成功克隆到GH3.9基因。

圖1　 GH3.9基因擴(kuò)增

2.2　 GH3.9基因過表達(dá)突變體的構(gòu)建及驗(yàn)證

將PCR擴(kuò)增得到的GH3.9基因參照1.2.3方案導(dǎo)入到過表達(dá)載體pEGAD中,隨后將篩選得到的pEGAD-GH3.9陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。用農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)卡那霉素、利福平篩選獲得純合的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以Actin2為內(nèi)參,采用半定量RT-PCR方法比較野生型和轉(zhuǎn)基因植株GH3.9的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)GH3.9基因確實(shí)在轉(zhuǎn)基因植株中超表達(dá)(圖2)。

2.3　不同光處理對 GH3.9基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗下胚軸伸長的影響

2.3.1不同光強(qiáng)和光質(zhì)處理結(jié)果的比較圖3顯示,不同強(qiáng)度藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光處理后發(fā)現(xiàn),在黑暗狀態(tài)及0.1 μmol·m-2·s-1弱光照射下,過表達(dá)和野生型擬南芥幼苗下胚軸生長沒有明顯不同。強(qiáng)光下,和野生型相比,過表達(dá)株系下胚軸的伸長受到

圖2　轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定

圖3　不同光處理下擬南芥幼苗下胚軸生長

更強(qiáng)的抑制(圖3)。可見,GH3.9基因的過表達(dá)突變體,對強(qiáng)光抑制下胚軸的伸長更加敏感,推測GH3.9基因可能參與植物的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.3.2不同光周期處理的比較野生型和過表達(dá)植株的種子播種后,分別在長日照(16 h光照,8 h黑暗)和短日照(8 h光照,16 h黑暗)條件下培養(yǎng)。結(jié)果(圖4)表明,與野生型相比,無論是哪種光周期

圖4　不同日照條件下擬南芥幼苗各材料下胚軸長度比較

圖5　長日照條件下擬南芥花各材料的

圖6　擬南芥各材料果莢長度比較

下,過表達(dá)幼苗的下胚軸伸長都受到明顯抑制(圖版Ⅰ,A、B)。

2.4　 GH3.9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

長日照培養(yǎng)下,收集成熟花20朵,雄蕊和雌蕊長度比(圖5)顯示,過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的雄蕊明顯變短(圖版Ⅰ,C)。從成熟植株上直接收集成熟的果莢各20個(gè),測量果莢長度,結(jié)果(圖6)表明,野生型果莢要比過表達(dá)株系果莢長(圖版Ⅰ,E),且過表達(dá)植株明顯矮小(圖版Ⅰ,D)。推測GH3.9基因過表達(dá)嚴(yán)重影響了植物的生長發(fā)育。

3討論

光和生長素是影響植物生長發(fā)育的重要因素。其中,光調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與植物對生長素的反應(yīng)相關(guān),而生長素調(diào)控基因突變會(huì)影響光信號的傳遞。作為生長素早期響應(yīng)基因,一方面 GH3蛋白通過調(diào)節(jié)游離生長素的濃度來實(shí)現(xiàn)對活性生長素的調(diào)控[4],這是因?yàn)镚H3蛋白具有生長素氨基酸化酶活性,可以將氨基酸結(jié)合到生長素上,使其失去活性,以維持植物體內(nèi)生長素的動(dòng)態(tài)平衡[5];另一方面,GH3蛋白還參與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,通過影響植物對光的吸收來影響植物的生長發(fā)育[8]。通過對部分GH3基因過表達(dá)突變體研究發(fā)現(xiàn),他們的表型跟野生型相比都有很明顯的區(qū)別,例如根系變短、側(cè)根變少、植株矮小[11-12]。

GH3.9基因作為擬南芥GH3基因家族20個(gè)基因中的第9號基因,目前對它的研究尚不夠深入。我們通過前期對GH3.9基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),GH3.9基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域存在大量與光反應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件,如G-box、GT1-motif、TCT-motif、GA-motif,推測植物GH3.9基因參與了光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究通過構(gòu)建過表達(dá)GH3.9載體,篩選得到純系過表達(dá)GH3.9植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光等不同光照強(qiáng)度培養(yǎng)下,過表達(dá)植株幼苗下胚軸抑制均較野生型明顯;而黑暗情況下,GH3.9基因過表達(dá)幼苗下胚軸發(fā)育與野生型相比無明顯差異。進(jìn)一步證明了該基因參與光對擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),正常光照下過表達(dá)GH3.9植株果莢短小、雄蕊變短、植株矮小,表明植物各個(gè)器官的生長發(fā)育均受抑制。推測過量表達(dá)的GH3.9蛋白除了通過光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,還通過催化過多的游離生長素氨基酸化影響植物體內(nèi)生長素動(dòng)態(tài)平衡,進(jìn)而抑制生長素信號途徑,導(dǎo)致擬南芥形態(tài)的變化和生長發(fā)育抑制。我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對GH3.9基因的光以及生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的具體調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行深入探討。

參考文獻(xiàn):

[1]SUN T(孫濤),CHAI T Y(柴團(tuán)耀),LIU G Y(劉戈宇),etal.Progress in theGH3 gene family[J].ChineseJournalofBiotechnology(生物工程學(xué)報(bào)),2008,24(11):1 860-1 866(in Chinese).

[2]RAMOD J A,ZENSER N,LEYSER O,etal.Rapiddegradation of auxin/indoleacetic acid proteins requires conserved amino acids ofdomain Ⅱ and is proteasomedependent[J].ThePlantCell,2001,13(10):2 349-2 360.

[3]GUILFOYLE T J.Auxin-regulated genes and promoters[C]//HOOYKAAS P J J,HALL MA,LI- BBENGA K R.Biochemistry and molecular biology of plant hormones[J].Amsterdam:Elsevier,1999:423-459.

[4]HAGEN G,GUILFOYLE T.Auxin-responsive gene expression:genes,promoters and regulatory factors[J].PlantMolecularBiology,2002,49(3/4):373-385.

[5]STASWICK P E,SERBAN B,ROWE M,etal.Characterization of anArabidopsisenzyme family that conjugates amino acids to indole-3-acetic acid[J].ThePlantCell,2005,17(2):616-627.

[6]STASWICK P E,TIRYAKI I.The oxylipin signal jasmonic acid is activated by an enzyme that conjugates it to isoleucine inArabidopsis[J].ThePlantCell,2004,16(8):2 117-2 127.

[7]TAKASE T,NAKAZAWA M,ISHIKAWA A,etal.Ydk 1-D,an auxin-responsive GH3 mutant that is involved in hypocotyl and root elongation[J].ThePlantJournal,2004,37(4):471-483.

[8]LI Y(黎穎),ZUO K J(左開井),TANG K X(唐克軒).A survey of functional studies of theGH3 gene family in plants[J].ChineseBulletinofBotany(植物學(xué)通報(bào)),2008,25(5):507-515(in Chinese).

[9]KHAN S,STONE J M.ArabidopsisthalianaGH3.9 influences primary root growth[J].Planta,2007,226(1):21-34.

[10]BIERFREUND N M,TINTELNOT S,RESKI R,etal.Loss of GH3 functiondoes not affect phytochrome-mediateddevelopment in a moss,Physcomitrella patens[J].JournalofPlantPhysiology,2004,161(7):823-835.

[11]NAKAZAWA M,YABE N,ICHIKAWA T,etal.DFL1,an auxin-responsiveGH3 gene homologue negatively regulates shoot cell elongation and lateral root formation,and positively regulates the light response of hypocotyl length[J].ThePlantJournal,2001,25(2):213-221.

[12]PARK J E,SEO P J,LEE A K,etal.AnArabidopsisGH3 gene,encoding an auxin-conjugating enzyme,mediates phytochrome B-regulated light signals in hypocotyl growth[J].PlantandCellPhysiology,2007,48(8):1 236-1 241.

圖版 Ⅰ擬南芥幼苗及成熟植株表型分析

每張圖從左至右均依次為:擬南芥野生型、擬南芥過表達(dá)植株GH3.9ox-3和GH3.9ox-7

A.長日照下擬南芥幼苗;B.短日照下擬南芥幼苗;C.擬南芥花朵;D.50d齡擬南芥植株;E.擬南芥果莢。

Plate ⅠSeedlings and phenotype analysis ofA.thaliana

From left to right,they are wild-type,GH3.9ox-3 andGH3.9ox-7

Fig.A.Seedlings in longday;Fig.B.Seedlings in shortday;Fig.C.Flowers;Fig.D.50-old-day plants;Fig.E.Siliques.

(編輯:宋亞珍)