*通信作者:陸嘉惠,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事藥用植物資源研究。E-mail:jiahuil@shzu.edu.cn

4種甘草屬植物EST-SSR引物開發(fā)及其親緣關(guān)系分析

李曉嵐1,陸嘉惠1,2,3*,謝良碧1,張愛霞1,陳曉翠1,李學(xué)禹3

(1 石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832003;2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003;3 石河子大學(xué) 甘草研究所,新疆石河子 832003)

摘要:通過(guò)烏拉爾甘草表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)查找甘草屬的SSR位點(diǎn),并利用Primer 3.0軟件在線設(shè)計(jì)EST-SSR引物,對(duì)來(lái)自甘草屬4個(gè)種22份材料的EST-SSR指紋圖譜特征和聚類結(jié)果進(jìn)行分析,為探討甘草屬種間親緣關(guān)系和疑難種的分類地位提供分子依據(jù)。結(jié)果顯示:(1)去掉冗余序列后共得到441條EST序列,獲得504個(gè)SSR位點(diǎn),其中二核苷酸為重復(fù)單元的序列最多為350個(gè),占69.44%,重復(fù)類型中以TC/AT、TA/AG形式的微衛(wèi)星最為豐富。(2)設(shè)計(jì)的40對(duì)EST-SSR引物,均能擴(kuò)增出清晰條帶,其中15對(duì)引物具有多態(tài)性,在22份甘草屬植物材料中共獲得等位基因59個(gè),平均每對(duì)引物檢測(cè)到3.93個(gè)等位基因位點(diǎn),擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性比率為89.44%,能很好地表征甘草屬種間的等位基因差異。(3)引物Primer 64對(duì)4種甘草屬植物均能擴(kuò)增出特異性條帶,黃甘草在180和220 bp 2個(gè)位點(diǎn)分別與光果甘草、脹果甘草基因共享,具有雜交種特征。(4)聚類分析表明,當(dāng)相似性系數(shù)為0.82時(shí),22份材料被劃分為四組(與經(jīng)典分類結(jié)果一致),第一組為內(nèi)蒙古杭錦旗分布的烏拉爾甘草;第二組為新疆巴楚分布的光果甘草、黃甘草;第三組為新疆石河子分布的脹果甘草、黃甘草;第四組為新疆石河子分布的烏拉爾甘草;不同居群的黃甘草遺傳分化較大,可能與同域分布親本種的差異及種間的漸滲雜交有關(guān)。研究表明,開發(fā)的15對(duì)EST-SSR引物在甘草屬內(nèi)具有很好的適用性,可以為該屬的種間親緣關(guān)系和種內(nèi)遺傳分化研究及物種鑒定提供分子依據(jù)。

關(guān)鍵詞:甘草屬;EST;SSR;親緣關(guān)系

收稿日期:2014-11-23;修改稿收到日期:2015-03-06

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31260042)

作者簡(jiǎn)介:李曉嵐(1988-),女,在讀碩士研究生,主要從事藥用植物資源研究。E-mail:lixiaolan19880404@163.com

中圖分類號(hào):Q789 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

Development of EST-SSR Primers and Genetic

Relationship Analysis in FourGlycyrrhizaL.Species

LI Xiaolan1,LU Jiahui1,2,3*,XIE Liangbi1,ZHANG Aixia1,CHEN Xiaocui1,LI Xueyu3

(1 College of Life Science,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 The Key Oasis Eco-Agriculture Laboratory of Xinjiang Production and Construction Group,Xinjiang 832003,China;3 Institute of Licorice in Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

Abstract:The Glycyrrhiza L.SSRs were searched in the expressed sequence tag (EST)database of Glycyrrhiza uralensis,and the EST-SSR primers weredesigned by Primer 3.0 online software.The EST-SSR fingerprint characteristics and cluster trees of four species were then analyzed todiscuss the interspecific relationships among species and taxonomic status of thedoubtful species.(1)Total 504 SSRs were identified from 441 EST sequences.There were 350dinucleotide repeat sequences with 69.44% frequency,showing thedominant types in the SSRs.Both TC/AT and TA/AG types were abundant amongdinucleotide repeat sequences.(2)Thedistinct bands were produced in PCR amplifications for all 40 random selected EST-SSR primers.The polymorphic bands were observed in 15 primers,a total of 59 alleles in the 22 materials of the Glycyrrhiza L.were observed,which appeared to be 89.44% polymorphic among these 15 primers with an average of 3.93 alleles per primers.(3)The primer 64 could amplify specific bands in 4 species.G.eurycarpa had the same alleles as that of G.inflata at 180 bp site and that of G.grabra at 220 bp site,showing the hybrid characteristics.(4)The cluster analysis of SSRdata showed that when similarity coefficient was 0.82,22 materials from 4 species were clustered into 4 groups:G.uralensis in Hangjingqi,Neimenggu;G.eurycarpa and G.grabra in Bachu,Xinjiang;G.eurycarpa and G.inflata in Shihezi,Xinjiang;G.uralensis in Shihezi,Xinjiang.This cluster was in accord with the classical taxonomy.However,there was fairly large geneticdifferentiation indifferent populations of G.eurycarpa.It may be caused by thedifferentiation of sympatric parent species or introgressive hybridization.These results indicates that 15 primers is suitable for EST-SSR analysis of Glycyrrhiza L..It would be useful for species identification and study of genetic variation and species relationship of Glycyrrhiza L..

Key words:GlycyrrhizaL.;EST;SSR;genetic relationship

豆科(Leguminosae)甘草屬(GlycyrrhizaL.)植物全世界約20種,主要產(chǎn)地在中亞、北美及東歐,尤以中亞及地中海沿岸為分布中心。中國(guó)甘草屬植物集中分布于東北、華北和西北各省區(qū),而以新疆、內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅為中心產(chǎn)區(qū)[1-2]。甘草屬植物為重要的野生藥用植物資源,種內(nèi)、種間遺傳變異復(fù)雜,屬下種的親緣關(guān)系和分類鑒定一直存在爭(zhēng)議[3-4],給甘草屬植物資源的研究帶來(lái)混亂。Hayashi等曾對(duì)甘草屬一些中間類型植物葉中的黃酮成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與原種有差異,提取DNA和PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果提示,中間物可能起源于不同母系株[5]。目前,有關(guān)甘草屬植物分類學(xué)和遺傳多樣性研究主要集中在系統(tǒng)學(xué)[6]、細(xì)胞學(xué)[7]、等位酶[8]等方面,應(yīng)用分子標(biāo)記方法有關(guān)于RAPD、AFLP等標(biāo)記的報(bào)道[9-10],在甘草屬的種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)演化研究方面取得了一定進(jìn)展。但由于甘草屬植物種間的自然雜交現(xiàn)象[11-13],自然雜交種的存在使屬內(nèi)一些種的種間界限模糊,種的分類地位仍有待商榷[3,8]。植物SSR標(biāo)記多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性突出,是進(jìn)行屬、種等分類單元研究的重要分子標(biāo)記,并能通過(guò)共顯性的標(biāo)記進(jìn)行親本分析[14],EST-SSR標(biāo)記具有開發(fā)效率高、成本低的特點(diǎn),是SSR標(biāo)記的重要來(lái)源,因其來(lái)自基因編碼區(qū),更易獲得基因表達(dá)的信息,因而能夠反映出功能遺傳多樣性,與某些生理生化特征和形態(tài)特征相關(guān)聯(lián)[14]。目前已經(jīng)應(yīng)用在鵝掌楸[14]、蘋果[15]、葡萄[16]等物種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、親本分析和系統(tǒng)演化研究等領(lǐng)域。盡管國(guó)內(nèi)已有關(guān)于甘草屬的烏拉爾甘草的ESR資源的SSR信息分析[17],但將EST-SSR用于屬內(nèi)不同種的SSR遺傳多樣性分析,解決甘草屬內(nèi)的系統(tǒng)分類難題尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以來(lái)自甘草屬4個(gè)種的22份材料為試樣,通過(guò)對(duì)烏拉爾甘草EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的SSR分布進(jìn)行查找和信息分析,發(fā)掘SSR位點(diǎn),開發(fā)和篩選適合于甘草屬遺傳多樣性和親本分析的EST-SSR引物;同時(shí)對(duì)22份材料的EST-SSR指紋圖譜特征和聚類結(jié)果進(jìn)行種間的親緣關(guān)系、遺傳多樣性初步分析,為甘草屬內(nèi)種間關(guān)系及疑似雜交種的分類地位研究提供分子依據(jù)。

1材料和方法

1.1　材　料

供試材料為22份分別來(lái)自石河子大學(xué)甘草資源圃引種和石河子郊區(qū)野生的甘草材料(表1),每株采其幼嫩葉片,使用變色硅膠室溫干燥后,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　實(shí)驗(yàn)材料及其原產(chǎn)地

1.2　方　法

1.2.1總DNA提取及檢測(cè)采用改良后的CTAB法提取總DNA[18],使用Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometers測(cè)定DNA濃度后,最終用0.1 TE稀釋至25 ng/μL后低溫(-20 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2序列搜索及SSR位點(diǎn)查找登陸美國(guó)NCBI(National Center for Biotechnology Information,美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù),以Glycyrrhiza為關(guān)鍵詞搜索EST序列,得到55 942烏拉爾甘草EST,從中下載了4 600條烏拉爾甘草EST序列。為進(jìn)一步利用烏拉爾甘草EST建立SSR標(biāo)記,剔除長(zhǎng)度過(guò)短的序列(小于150 bp)和低質(zhì)量的序列后,對(duì)余下的441條序列利用SSRIT在線軟件(http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool)查找SSR,參數(shù)設(shè)定最大重復(fù)基元堿基數(shù)為decamer,最小重復(fù)次數(shù)為5。

1.2.3EST-SSR引物設(shè)計(jì)利用Primer 3.0在線(http://www.simgene.com/Primer 3)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)PCR引物,共設(shè)計(jì)了40對(duì)EST-SSR引物。引物設(shè)計(jì)原則:引物長(zhǎng)度為18～24 bp,最適為20 bp;Tm值為50 ℃～60 ℃,上下游引物的Tm值相差不大于5 ℃;GC含量為40%～60%,最適為50%;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100～300 bp;SSR位點(diǎn)的開始和結(jié)束位置距離5′和3′端均不少于30 bp;引物采用位于SSR上游和下游各150個(gè)堿基范圍內(nèi)的序列;避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)以及6個(gè)連續(xù)堿基配對(duì)的出現(xiàn)。設(shè)計(jì)完成后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4SSR-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)EST-SSR PCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀上進(jìn)行。分析所使用的PCR反應(yīng)總體積為20.0 μL,其中包括2×TaqPCR Master Mix(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板DNA(25 ng/μL)1.0 μL。針對(duì)不同引物設(shè)置了不同的退火溫度,最后確定PCR最適反應(yīng)程序如下:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及引物篩選由于2%瓊脂糖凝膠與6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果基本一致,并且瓊脂糖凝膠電泳較聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方便快速[19-20],故本實(shí)驗(yàn)采用5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳檢測(cè),Marker為20 bp Ladder(購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司)。電泳結(jié)束后,在紫外檢測(cè)儀上觀察,在凝膠成像系統(tǒng)中照相并保存圖像。

1.2.6數(shù)據(jù)處理采用人工讀帶的方法,將電泳圖上可重復(fù)的、清晰的條帶按照微衛(wèi)星基因片段大小和位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),同一位點(diǎn)出現(xiàn)的為“ 1 ”,同一位置無(wú)條帶或不易分辨的弱帶計(jì)為“ 0 ”,建立原始數(shù)據(jù)矩陣輸入NTSYS 3.0,計(jì)算樣品間的簡(jiǎn)單遺傳相似系數(shù),按非加權(quán)算數(shù)平均數(shù)聚類(UPGMA)方法構(gòu)建SSR聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1　烏拉爾甘草EST-SSR序列總體特征

從4 600條烏拉爾甘草EST序列中搜索到446條含SSR的EST,占搜索序列的9.70%,去除小于150 bp長(zhǎng)度的序列后有441條達(dá)到篩選條件,共查找到504個(gè)SSR。表2顯示,在所有可用的EST-SSR中,共有63類重復(fù)基元,二至六核苷酸重復(fù)基元均存在,其中以二核苷酸為重復(fù)基元(10種)出現(xiàn)的頻率最高,占64.75%(350條),三核苷酸重復(fù)基元(37種)占26.98%(136條)、四核苷酸重復(fù)基元(12種)占2.78%(14條)五核苷酸重復(fù)基元(2種)占0.40%(2條)、六核苷酸重復(fù)基元(2種)占0.40%(2條)。二核苷酸重復(fù)基元類型中以TC/AT形式的微衛(wèi)星最為豐富,分別占18.29%和18.00%,其次為TA/AG,分別占17.43%和13.71%。

2.2　引物篩選結(jié)果

利用引物設(shè)計(jì)軟件共設(shè)計(jì)了40對(duì)EST-SSR引物,以4種22份甘草屬植物DNA為模板對(duì)引物進(jìn)行篩選,40對(duì)EST-SSR引物均能擴(kuò)增出清晰條帶,有效擴(kuò)增率為100%,其中15對(duì)引物能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,多態(tài)性引物擴(kuò)增率為37.5%,多態(tài)性引物序列信息見表3。

表2　烏拉爾甘草EST序列中不同長(zhǎng)度

2.3　EST-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

15對(duì)引物對(duì)22份甘草屬植物基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增共得到等位基因59個(gè),等位位點(diǎn)數(shù)的變化從1到10不等,平均每對(duì)引物檢測(cè)到3.93個(gè)等位基因位點(diǎn),各引物擴(kuò)增帶的多態(tài)性比率分布在50%～100%(表3),平均擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性比率為89.44%。

圖1為引物Primer 64對(duì)4 種甘草屬植物22份材料的擴(kuò)增結(jié)果,該圖顯示4種甘草屬植物都有其特異的擴(kuò)增條帶,且不同居群的烏拉爾甘草具有不同特異性帶,不同居群的黃甘草亦具有不同擴(kuò)增條帶;新疆巴楚分布的黃甘草與同域分布的光果甘草在180 bp左右處有共有帶,而新疆石河子分布的黃甘草與同域分布的脹果甘草在220 bp處有共有帶,說(shuō)明黃甘草在180和220 bp這兩個(gè)位點(diǎn)分別與光果甘草、脹果甘草基因共享。

2.4　聚類結(jié)果分析

用Nei方法計(jì)算得到的相似系數(shù)矩陣,經(jīng)非加權(quán)算數(shù)平均聚類(UPGMA)方法建立甘草屬植物SSR聚類圖。由聚類圖可知(圖2),當(dāng)相似性系數(shù)為0.82時(shí),22份材料被劃分為4組:{1～4},{9,11,12,17,18,19},{10,13,14,15,16,20,21,22},{5～8}。第一組為內(nèi)蒙古杭錦旗分布的烏拉爾甘草;第二組為新疆巴楚分布的光果甘草和黃甘草;第三組為新疆石河子分布的脹果甘草、黃甘草;第四組為新疆石河子分布的烏拉爾甘草。同一物種同一居群的不同個(gè)體聚為一組,不同物種分支,說(shuō)明了基于SSR標(biāo)記的4種甘草屬植物遺傳分化結(jié)果與經(jīng)典分類是一致的,所開發(fā)的SSR引物和建立的SSR標(biāo)記體系是可信的。不同居群的黃甘草被分為2組,其種內(nèi)的遺傳距離大于與其同域分布的其他種的遺傳距離,這說(shuō)明不同居群的黃甘草存在較大遺傳差異,其遺傳分化模式值得探討。

表3　15對(duì)甘草屬EST-SSR引物信息

圖1　引物Primer 64在4種甘草屬植物的SSR多態(tài)擴(kuò)增圖譜

圖2　基于SSR標(biāo)記的4種甘草屬

3討論

Varshney等[21]和Eujayl等[22]認(rèn)為大多數(shù)植物的EST-SSR以三核苷酸和二核苷酸重復(fù)基元為主要類型,多數(shù)單子葉植物和雙子葉植物以三核苷酸重復(fù)基元為主。但本研究發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草EST-SSR以二核苷酸重復(fù)基元數(shù)目最多,占64.75%,三核苷酸占26.98%,這與芝麻[23],砂梨[24],蒺藜苜蓿[25]等植物EST-SSR特征研究具有相似結(jié)論。這可能與本研究設(shè)定的SSR查找參數(shù)重復(fù)序列長(zhǎng)度≥ 20 bp有關(guān),因?yàn)檩^低的重復(fù)序列長(zhǎng)度會(huì)增加某一類型核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量,進(jìn)而影響出現(xiàn)頻率最多的重復(fù)核苷酸的結(jié)果[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草EST-SSR中核苷酸堿基重復(fù)類型有63種,其中二核苷酸堿基重復(fù)類型有10種,以TC/AT形式的微衛(wèi)星最為豐富,其次為TA/AG。三核苷酸堿基重復(fù)類型有37種,占全部類型的58.73%,重復(fù)基元以AAC/TCT/GAA為主,除TCT重復(fù)外,其他兩種主要的三核苷酸重復(fù)也出現(xiàn)在豆科的蒺藜苜蓿[25]和大豆[26]中。

本研究共設(shè)計(jì)了40對(duì)甘草屬EST-SSR引物,并對(duì)22份甘草屬植物材料進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)40

對(duì)引物均有擴(kuò)增產(chǎn)物,引物有效擴(kuò)增效率為100%,其中15對(duì)引物具有多態(tài)性,占可擴(kuò)增引物的37.50%。盡管可擴(kuò)增出多態(tài)性的EST-SSR引物比例低,但是這15對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物多態(tài)性率為89.44%,能很好地表征甘草屬內(nèi)種間的等位基因差異。基于等位基因差異建立的SSR遺傳分化聚類圖也能較好地區(qū)分甘草屬的4個(gè)不同物種,說(shuō)明篩選出的這15對(duì)EST-SSR引物在甘草屬內(nèi)具有很好的適用性,可以為該屬的種間親緣關(guān)系和種內(nèi)遺傳分化研究及物種鑒定提供分子依據(jù)。

黃甘草一直是甘草屬植物有爭(zhēng)議的種,張鵬云[27]認(rèn)為黃甘草是脹果甘草與烏拉爾甘草的天然雜交種。在自然環(huán)境中,黃甘草與光果甘草、脹果甘草、烏拉爾甘草的形態(tài)性狀有過(guò)渡和重疊現(xiàn)象,分布區(qū)也有交叉重疊[9]。在葉表皮形態(tài)[7]、核型、等位酶、雜交試驗(yàn)分析中,黃甘草為較進(jìn)化類型,亦具有豐富的遺傳多樣性[8],與脹果甘草、烏拉爾甘草雜交親和指數(shù)高[13],SSR指紋圖譜顯示新疆巴楚黃甘草與同域分布的光果甘草在180 bp左右處有共有帶,而新疆石河子的黃甘草與同域分布的脹果甘草、烏拉爾甘草在220 bp處有共有帶,說(shuō)明黃甘草在180 bp、220 bp的位點(diǎn)分別與光果甘草,脹果甘草和烏拉爾甘草基因共享,不同居群的黃甘草遺傳特性可能會(huì)因同域分布的親本種不同,而出現(xiàn)不同的SSR擴(kuò)增帶,但親本分析還有待進(jìn)行多樣本的SSR標(biāo)記。本研究結(jié)果顯示,黃甘草可能是脹果甘草與烏拉爾甘草的雜交種,或者脹果甘草與光果甘草的雜交種。1998年的《亞洲中部植物》(第8冊(cè)第1分冊(cè))將黃甘草作為脹果甘草的異名處理[3]。本研究中,SSR多態(tài)擴(kuò)增圖譜和聚類分析均表明2個(gè)居群的黃甘草與脹果甘草遺傳差異較大,這與RAPD的研究結(jié)果一致[9],將其歸并脹果甘草是不合理的,這將會(huì)掩蓋其特有的遺傳背景,失去有價(jià)值的性狀。SSR聚類結(jié)果顯示新疆巴楚分布的黃甘草與同域分布的光果甘草單獨(dú)聚為一支,親緣關(guān)系最近;而新疆石河子分布的黃甘草則與脹果甘草聚為一支,親緣關(guān)系最近。黃甘草這種種內(nèi)遺傳差異大于種間的現(xiàn)象,表明不同居群的黃甘草遺傳背景的差異,極有可能是由于與同域分布的親本種反復(fù)漸滲回交而導(dǎo)致的基因向某一親本融合造成的,有的可能趨向于母本,有的則表現(xiàn)為父本傾向,其漸滲雜交的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(編輯:宋亞珍)