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纖連蛋白降解片段對心肌細(xì)胞腱糖蛋白C表達(dá)的影響

韋舒杰，馬雙陶，楊大春，王強(qiáng)，李德，唐兵，楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川成都610083)

【摘要】目的:探討纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)降解片段對心肌細(xì)胞腱糖蛋白C(tenascin-C，TN-C)再表達(dá)的影響。方法:通過構(gòu)建攜帶FN片段(包括FN-f1、FN-f2、FN-f3、FN-f4、FN-f5、FN-f6和FN-f7)慢病毒載體轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，采用免疫熒光及Western blotting檢測TN-C的表達(dá)和分布情況。結(jié)果:相比于對照組，F(xiàn)N-f1、FN-f2、FN-f3和FN-f5組，免疫熒光結(jié)果顯示TN-C表達(dá)升高幅度分別為(2.72±0.11)、(2.51±0.06)、(2.14±0.10)、(2.39±0.09)，Western blotting則分別升高(0.415± 0.009)、(0.290±0.012)、(0.386±0.014)、(0.332±0.016)，TN-C表達(dá)顯著升高，同時FN表達(dá)不受影響。而FN-f4、FN-f6和FN-f7對TN-C及FN的表達(dá)均沒有影響。結(jié)論:部分FN片段可能參與TN-C的再表達(dá)和心肌重構(gòu)的過程。

【關(guān)鍵詞】腱糖蛋白C;纖連蛋白;心肌重構(gòu)

心室重構(gòu)，是促進(jìn)心力衰竭病程進(jìn)展的主要病理生理過程。在心室重構(gòu)的過程中，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的相互作用發(fā)揮了重要的生物信號作用［1］。在心臟各種ECM分子中，腱糖蛋白C(tenascin-C，TN-C)因其在心室重構(gòu)進(jìn)程中調(diào)控心肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)組織之間粘附，影響心肌細(xì)胞的生物學(xué)行為，而倍受重視［2-3］。雖然TN-C在心室重構(gòu)發(fā)展中的具體作用尚不清楚，但研究提示TN-C可能是調(diào)控心肌重構(gòu)進(jìn)展的潛在治療靶點［4］。

TN-C出現(xiàn)在胚胎期心臟發(fā)生發(fā)育多個重要過程中，而在健康成人心臟組織中停止表達(dá)［5-6］。重要的是在心臟發(fā)生各種病理狀況時(例如心力衰竭)，又可發(fā)生再表達(dá)［7］。然而，目前的研究還未能明確可促使TN-C再表達(dá)的確切誘導(dǎo)物。我們先前的報道已經(jīng)證實TN-C基質(zhì)沉積與纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)降解有關(guān)，并且在心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，纖連蛋白降解片段可誘導(dǎo)TN-C基質(zhì)沉積［8］。然而，何種類型的纖連蛋白降解片段可以促使TN-C的再表達(dá)尚不清楚。

在本研究中，構(gòu)建了表達(dá)FN降解片段的慢病毒載體，包括FN-f1、FN-f2、FN-f3、FN-f4、FN-f5、FN-f6和FN-f7，通過轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，其后評估研究上述片段對TN-C表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)

實驗經(jīng)過成都軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。大鼠胚胎源性心肌成肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫(中國，上海)，細(xì)胞于包含10％優(yōu)質(zhì)胎牛血清(GIBCO)、100 U/mL青鏈霉素(Hyclone)的DMEM F12培養(yǎng)基(Hyclone)中培養(yǎng)，95％空氣，5％二氧化碳，37℃。

1.2pMD19T-FN-fs載體構(gòu)建

人FN前體基因(GeneID: X02761.1)序列被劃分為7個片段。293T細(xì)胞總RNA按照TRIZOL(Invitrogen)操作流程提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA隨后用于FN-f1、FN-f2、FN-f3、FN-f4、FN-f5、FN-f6和FN-f7合成模板。引物序列如下: FN-f1-F:5'CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGG ACG AGC TTC CCC AAC TGG T 3'，F(xiàn)N-f1-R: 5'TAT TCG GCG CGC CCT ACC CAG GTC TGC GGC AGT T 3'; FN-f2-F: 5'CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGG CTA TTC CTG CAC CAA CTG ACG 3'; FN-f2-R: 5'TAT TCG GCG CGC CCT AAG TGG AGG CGT CGA TGA CC 3'; FN-f3-F: 5' CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGC CTA TCT CTG ATA CCA TCA TCC CA 3'; FN-f3-R:5'TAT TCG GCG CGC CCT AGC TTG CGG GGC TGT CTC CA 3'; FN-f4-F:5'CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGC AGC CTG GGA GCT CTA TTC C 3'; FN-f4-R: 5'TAT TCG GCG CGC CCT ATG GGA TGA TGG TAT CAG AGA TAG G 3'; FN-f5-F: 5'CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGA GTG GTC CTG TCG AAG TAT TTA TCA 3'; FN-f5-R: 5'TAT TCG GCG CGC CCT ACA GTG TGG TAA AGA CTC CAG TGG C 3'; FN-f6-F: 5'CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGT GTG TCA CAG ACA GTG GTG TGG T 3'; FN-f6-R: 5'TAT TCG GCG CGC CCT ATG AGC TTG GAT AGG TCT GTA AAG GT 3'; FN-f7-F:5'CTG TCA TTA ATT AAG CCA CCA TGT GTT ATG ACA ATG GAA AAC ACT ATC 3'; FN-f7-R: 5'TAT TCG GCG CGC CCT ACC TCT CAC ACT TCC ACT CTC CTC 3'。將克隆的cDNA連接到pMD-19T載體(TaKaRa，日本)，生成pMD19T-FN-fs，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，含有質(zhì)粒的菌落在X-gal/IPTG/Amp平板中篩選。PacI 和AscI消化pMD19T-FN-fs，1.5％瓊脂糖凝膠電泳評價。ABI3730XL DNA分析儀(國際設(shè)備貿(mào)易有限公司，美國)測定pMD19T-FN-fs載體序列。

1.3pLenti6.3-FN-fs-IRES-EGFP載體構(gòu)建

pMD19T-FN-fs和pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP經(jīng)PacI和AscI消化，T4 DNA連接酶連接，形成pLenti6.3-FN-fs-IRES-EGFP載體。PacI和AscI消化pLenti6.3-FN-fs-IRES-EGFP載體，1.5％瓊脂糖凝膠電泳評價。ABI3730XL DNA分析儀測定pLenti6.3-FN-fs-IRES-EGFP載體序列。

1.4慢病毒包裝、滴度測定及轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞

pLenti6.3-FN-fs-IRES-EGFP質(zhì)粒及病毒包裝質(zhì)?；旌衔锕餐D(zhuǎn)染293T細(xì)胞，達(dá)到50％～70％融合時，大約各質(zhì)粒90 mg轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。48 h后，收集上清測定被轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞病毒滴度。選擇生長狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞使用病毒工作液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使感染效率達(dá)到80％以上。

1.5免疫熒光試驗

培養(yǎng)的細(xì)胞4％多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，4％牛血清蛋白封閉，兔來源抗-FN(1∶200稀釋，Bioworld Technology，美國)和抗TN-C(1∶200稀釋，Epitomics，美國)一抗4℃孵育過夜，PBS洗滌，熒光探針Cy3標(biāo)記偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋，Proteintech，中國武漢)二抗室溫孵育40 min，PBS洗滌，DAPI核染10 min，PBS沖洗后，激光共聚焦顯微鏡(Olympus FluoView FV1000，美國)拍攝成像。

1.6Western-blotting檢測

通過如前所述Western印跡法檢測TN-C蛋白表達(dá)量［9］。蛋白裂解緩沖液均化細(xì)胞獲得蛋白裂解產(chǎn)物。蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白分析試劑盒(R＆S生物技術(shù)有限公司，中國上海)測定。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(12％)分離提取等量蛋白，隨后與將樣品轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5％脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉1 h，抗TN-C(1∶1 000稀釋，Epitomics公司，美國)和GAPDH(稀釋1∶5 000，Bioworld Technology公司，美國)抗體室溫孵育2 h，其后HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋，Abmart，中國上海)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Biosciences公司，瑞典)定影。NIH Image 1.61定量分析。

1.7Real-time PCR

Trizol法(Invitrogen)提取H9C2細(xì)胞總RNA。cDNA合成試劑盒(Fermentas國際公司，加拿大)將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。Mastercycler EP Realplex實時熒光定量PCR儀(Eppendorf，美國)中執(zhí)行Real-time PCR反應(yīng)，F(xiàn)N-fs mRNA水平通過SYBR Green(Qiagen)進(jìn)行定量。相關(guān)引物序列如下: FN-f1-F:5'ACT GAA AGA CCA GCA GAG GC 3'，F(xiàn)N-f1-R: 5'CCA ACG GCA TAA TGG GAA A 3'，132bp; FN-f2-F: 5'AAA GAA ATC AAC CTT GCT CCT G 3'，F(xiàn)N-f2-R: 5'CTG GTC TGC TTG TCA AAG TGT C 3'，115bp; FN-f3-F: 5'AGG GAC CTG GAA GTT GTT GC 3'，F(xiàn)N-f3-R: 5'CCT CCT GTT TCT CCG TAA GTG 3'，107bp; FN-f4-F: 5'AGA ATT GGT TTT AAG CTG GGT G 3'，F(xiàn)N-f4-R: 5'TCT CAG GAC TTG GAT GGT GTA G 3'，138bp; FN-f5-F:5'GAC TCC CTT TTC TCC TCT TGT G 3'，F(xiàn)N-f5-R: 5'CAG GTA CTG TGG CTC ATC TCC 3'，154bp; FN-f6-F: 5'CAG GAC GGA CAT CTT TGG TG 3'，F(xiàn)N-f6-R: 5'CAG GAC GGA CAT CTT TGG TG 3'，148bp; FN-f7-F: 5'GTG TCT TGG TAA TGG AAA AGG A 3'，F(xiàn)N-f7-R: 5'CAA TCT ACC ATC ATC CAG CCT 3'，135bp; rACTB-F: 5'GCT ATG TTG CCC TAG ACT TCG A 3'，rACTB-R: 5'GAT GCC ACA GGA TTC CAT ACC 3'，173bp。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，不同轉(zhuǎn)染組及與對照組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。取P＜0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞FN-fs的過表達(dá)

采用熒光定量PCR對FN-fs過表達(dá)進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后3 d，與空慢病毒處理組相比，F(xiàn)N-f1至FN-f7的表達(dá)依次增加了507倍、464倍、363倍、63倍、452倍、657倍和59倍。

2.2FN-fs轉(zhuǎn)染對FN表達(dá)的影響

免疫熒光檢測FN-fs轉(zhuǎn)染后H9C2細(xì)胞FN表達(dá)情況。結(jié)果顯示所有類型FN-fs轉(zhuǎn)染均未能引起FN表達(dá)情況的顯著改變(圖1)。

圖1　免疫熒光檢測FN-fs轉(zhuǎn)染后H9C2細(xì)胞FN表達(dá)情況

2.3FN-fs轉(zhuǎn)染對TN-C表達(dá)的影響

通過免疫熒光(圖2)和Western印跡法(圖3)檢測FN-fs轉(zhuǎn)染后的H9C2細(xì)胞TN-C的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果顯示，在未處理對照細(xì)胞組以及空白慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中，未探及TN-C有明顯表達(dá)，F(xiàn)N-f1、FN-f2、FN-f3和FN-f5慢病毒載體組中，TN-C表達(dá)升高幅度分別為2.72±0.11、2.51± 0.06、2.14±0.10、2.39±0.09，明顯高于對照組，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在Western印跡法結(jié)果中，F(xiàn)N-f1，F(xiàn)N-f2，F(xiàn)N-f3和FN-f5組相對于對照組，分別升高0.415±0.009、0.290±0.012、0.386± 0.014、0.332±0.016，TN-C表達(dá)明顯增高，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而FN-f4、FN-f6和FN-f7 這3種FN片段過表達(dá)無論是在免疫熒光或是Western印跡法檢測中，對TN-C的表達(dá)均無影響。

圖2　FN-fs轉(zhuǎn)染后H9C2細(xì)胞TN-C的表達(dá)情況

圖3　Western印跡法顯示FN-fs轉(zhuǎn)染后的H9C2細(xì)胞TN-C的表達(dá)情況

3　討論

本研究的創(chuàng)新之處在于發(fā)現(xiàn)了FN-f1、FN-f2、FN-f3和FN-f5可以誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞TN-C的再表達(dá)。TN-C作為TN蛋白家族發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的一員，已被證實其在心力衰竭和心室重構(gòu)發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［7］。同時，血清TN-C水平與心肌梗死后心室重構(gòu)相關(guān)，并且可以作為擴(kuò)張型心肌病以及肥厚型心肌病患者有用的預(yù)后標(biāo)志物［10-14］。TN-C基因敲除小鼠的實驗性運(yùn)用，更為TN-C可加重心室重構(gòu)、心肌纖維化、心梗后殘余心肌組織纖維化提供了強(qiáng)有力的證據(jù)［15］。基于當(dāng)前的相關(guān)研究，我們可大膽預(yù)測TN-C可作為一類控制及治療心室重構(gòu)心力衰竭的新靶點。但可調(diào)控TN-C表達(dá)的相關(guān)因素仍未見有報道。

我們之前的研究證實了依賴于基質(zhì)金屬酶激活的FN降解，可誘導(dǎo)心肌組織中TN-C基質(zhì)沉積?？刹⑽茨苊鞔_哪一類型的FN降解片段可促使TN-C的再表達(dá)。本研究表明，F(xiàn)N-f1、FN-f2、FN-f3和FN-f5可以在TN-C誘導(dǎo)再表達(dá)中發(fā)揮重要作用。我們的發(fā)現(xiàn)可能有助于進(jìn)一步理解FN降解片段調(diào)控TN-C再表達(dá)的具體機(jī)制。并且可以進(jìn)一步推斷，F(xiàn)N-f1、FN-f2、FN-f3和FN-f5可成為有效治療心力衰竭和阻止心室重構(gòu)進(jìn)展的潛在靶點。

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Effects of fibronectin fragments on tenascin-C expression in heart cells

WEI Shu-jie，MA Shuang-tao，YANG Da-chun，WANG Qiang，LI De，TANG Bing，YANG Yong-jian

(Department of Cardiology，Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To determine which fibronectin (FN)degradation fragments contribute to the induction of tenascin-C (TN-C)re-expression.Methods: Lentiviral vectors carrying FN fragments，including FN-f1，F(xiàn)N-f2，F(xiàn)N-f3，F(xiàn)N-f4，F(xiàn)N-f5，F(xiàn)N-f6 and FN-f7 were constructed.The protein expressions of TN-C and FN were measured with immunofluorescence assay and Western blotting.Results: Transfection with FN-f1，F(xiàn)N-f2，F(xiàn)N-f3 and FN-f5 significantly induced TN-C expression but did not affect FN expression in H9C2 cells.However，F(xiàn)N-f4，F(xiàn)N-f6 and FN-f7 did not affect the TN-C expression.Conclusion: Some FN fragments may be involved in TN-C re-expression and the development of ventricular remodeling.

【Key words】Tenascin-C; Fibronectin; Myocardial remodeling

通訊作者:楊永健，E-mail: yangyongjian38@yahoo.com

作者簡介:韋舒杰(1986-)，男，四川宜賓人，碩士研究生，主要從事心血管疾病方面的研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目(81070191)，四川省科技廳項目(2012JY0029)

收稿日期:2014-12-13

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.02.01

【文章編號】1005-3697(2015)02-0135-05

【中圖分類號】R735.7

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-5-1 01∶33網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.035.html