金蓮花藥渣發(fā)酵物體外增強氟康唑抗白念珠菌作用的影響

姬建秀姜妍①韓淑英②

(河北省唐山市協和醫(yī)院河北唐山063000；①華北理工大學冀唐學院；②基礎醫(yī)學院)

[摘要]①目的觀察金蓮花藥渣發(fā)酵提取物(EGRF)對氟康唑抗白念珠菌作用的影響。②方法藥物以倍比稀釋，用試管法和平皿法測定氟康唑、EGRF及氟康唑+EGRF對白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。③結果氟康唑和EGRF對白念珠菌的MIC為0.125mg/mL和1.25mg/mL，MBC為0.25mg/mL和2.5mg/mL；二者合用的MIC和MBC為(0.004+0.020)mg/mL和(0.008+0.040)mg/mL，氟康唑合用與單用MIC和MBC的效價比均為1：31.25；EGRF合用與單用MIC和MBC的效價比均為1：62.5。④結論EGRF對氟康唑抗白念珠菌有明顯的增強作用。

[關鍵詞]金蓮花藥渣氟康唑發(fā)酵物白色念珠菌

[中圖分類號]R 29[文獻標識碼]A

【基金項目】唐山市“十二五”重點科技支撐項目(編號：10130203-3)。

【作者簡介】姬建秀(1981-)，女，主治醫(yī)師。研究方向：陰道炎的藥物治療。

【通訊作者】韓淑英。

白念珠菌為人體常見條件致病菌，由白念珠菌引起的感染仍是目前最常見的機會性真菌感染[1]。臨床對念珠菌感染主要應用氟康唑(fluconazole，FLC)治療，但隨著氟康唑的大量應用，逐漸出現了氟康唑的耐藥菌株，導致其療效降低或無效[2,3]。因此，尋找降低白念珠菌的抗藥性藥物及能增加FLC療效的藥物或方法非常必要。相關學者前期研究發(fā)現，金蓮花藥渣發(fā)酵提取物能增加小鼠免疫功能并具有抗真菌作用[4~6]。本研究應用金蓮花藥渣發(fā)酵物觀察了體外抗白念珠菌的作用，并考察了與氟康唑聯合應用對其作用的影響，報告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1受試藥物。金蓮花藥渣發(fā)酵提取物(extraction of globeflower residue fermentation, EGRF)制備：將金蓮花藥渣[河北(唐山)百善藥業(yè)有限公司生產金蓮花膠囊后的殘渣]干燥、粉碎后，按一定比例加入增殖活化的安琪酵母菌，并給予酵母菌生長所需營養(yǎng)成分。在37℃培養(yǎng)72h后，加入無水乙醇使乙醇濃度達70%。70℃水浴提取2次，2h/次，收到過濾，合并提取液，回收乙醇，將回收乙醇后的提取液70℃水浴干燥，即得金蓮花藥渣發(fā)酵提取物(EGRF)。

1.1.2主要藥品、試劑。安琪酵母菌(來源于新疆伊寧市安琪酵母有限公司)；氟康唑氯化鈉注射液(批號：1109184A，安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司)；沙氏培養(yǎng)基(SDA 培養(yǎng)基)(北京博星生物技術有限責任公司，批號：20110826)；營養(yǎng)肉湯:(北京博星生物技術有限責任公司，批號：20100730)。

1.1.3實驗菌株。白色念珠菌臨床新分離菌株，由河北省唐山市開灤總醫(yī)院檢驗科提供，放4℃冰箱保存。白色念珠菌的臨床分離菌株經2次沙堡氏培養(yǎng)基活化(培養(yǎng)溫度為37℃)，挑取新培養(yǎng)24h的白色念珠菌菌落混懸于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)液中，震蕩使之充分混勻，應用血細胞計數板調節(jié)濃度至107cfu/mL(cfu:菌落形成單位)，現配現用。

1.1.4實驗儀器。SFG-02.500型電熱鼓風干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)， 血細胞計數板(上海達明試驗儀器有限公司)，FA2104N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)，顯微鏡(常州銳品精密儀器有限公司)，生物安全柜(Thermo scientific)，高壓滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，PYX-DH280型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海璽恒實業(yè)有限公司)。

1.2方法

1.2.1受試藥物配制。金蓮花藥渣發(fā)酵提取物(EGRF)：取金蓮花藥渣發(fā)酵提取物于乳缽中充分研磨后稱100mg，溶解于10mL營養(yǎng)肉湯中，得濃度10mg/mL的藥液，安全柜下用0.45μm微孔濾膜過濾，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；氟康唑與EGRF混合液：取上述EGRF液與氟康唑氯化鈉原液(2mg/mL)按1:1混合(臨用前配制)。

1.2.2菌懸液的制備。將平板上培養(yǎng)24h的活化白念珠菌挑取菌落混懸于營養(yǎng)肉湯中，震蕩使之充分混勻，應用血細胞計數板調節(jié)菌懸液濃度至100萬個/mL。

1.2.3MIC和MBC的測定。每一藥液挑選10支,無菌中號試管編號1～10，先無菌加入1.0mL肉湯至第1～9管內；藥液采用2倍連續(xù)稀釋法，加1.0mL供試藥液至第1管，將第1管混合后取1.0mL至第2管，依次至第8管，再從第8管取1.0mL丟去；第9管加入供試藥液1.0mL，不加菌作陰性對照，第10管只加菌液；第1～8管分別加入已準備好的1mL經稀釋(含菌量約100萬個/mL)的新鮮菌液，置37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h后觀察有無細菌生長，并記錄。肉眼觀察有無混濁，混濁為生長陽性，澄清為陰性。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無菌生長者，即為受試藥的MIC。將各藥物試管搖勻后用加樣器取10μL放到沙堡氏瓊脂平皿上，用白金耳劃線接種，培養(yǎng)48小時后觀察有否菌落生長。沙堡氏瓊脂平板上無菌生長，其含藥濃度最低的1管，即為最低殺菌濃度(MBC)。

2結果

表1顯示，白色念珠菌對照管明顯混濁，有大量念珠菌落生長；不加菌的陰性對照清亮透明，無菌生長。隨著各管藥濃度的降低，對白色念珠菌的抑殺作用也降低。氟康唑和EGRF單獨應用對白念珠菌的MIC為0.125 mg/mL和1.25mg/mL，MBC為0.25 mg/mL和2.5 mg/mL；而二者聯合應用的MIC和MBC分別為(0.004+0.020)mg/mL和(0.008+0.040)mg/mL，氟康唑聯合用藥與單用藥的效價比MIC和MBC均為1：31.25；EGRF聯合用藥與單用藥的效價比MIC和MBC均為1：62.5，見表1。

表1　EGRF對氟康唑抗白念珠菌MIC、MBC的影響(mg/mL)

注：MIC： -無混濁，+略混濁，2+較混濁，3+明顯混濁;MBC：-：無菌落；+：1～10個菌落；2+：21~30菌落；3+：多于31個菌落

3討論

念珠菌感染可引起皮膚、黏膜、指甲及深部組織念珠菌病，臨床主要應用唑類抗真菌藥，如氟康唑、咪康唑、酮康唑、伊曲康唑等[7]。隨著唑類抗真菌藥廣泛長期應用，白念珠菌抗藥性日趨嚴重，給念珠菌病的治療帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。聯合用藥可以減少藥物用量，增強藥效，降低藥物不良反應，同時可避免耐藥性的發(fā)生[8]。實驗結果顯示：氟康唑和EGRF單獨應用對白念珠菌的MIC為0.125mg/mL和1.25mg/mL，MBC為0.25mg/mL和2.5mg/mL；而二者聯合應用的MIC和MBC分別為(0.004+0.020)mg/mL和(0.008+0.040)mg/mL，氟康唑聯合用藥與單用藥的效價比MIC和MBC均為1：31.25，表明氟康唑與EGRF聯合應用，達到同等效應時氟康唑用量降低了31倍；EGRF聯合用藥與單用藥的效價比MIC和MBC均為1：62.5，達到同等效應時EGRF用量降低了62倍。研究結果表明，兩者聯合應用對白念珠菌的抑殺作用均明顯強于各自單獨應用，二者具有協同和增強作用。

金蓮花(Trollius chinensis Bunge)是毛茛科植物，屬藥食兩用品種，有著悠久的藥用史。金蓮花含豐富的黃酮類成分，具有抗細菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[9~11]。臨床主要用于感冒、發(fā)熱、扁桃體炎、咽炎、尿路感染等的治療[12]，但有關金蓮花抗真菌作用未見文獻報道。前期研究發(fā)現，金蓮花藥渣及發(fā)酵提取物可增強正常小鼠及免疫功能低下小鼠抗應激反應能力和免疫功能，并具有抗真菌作用(授權國家發(fā)明專利)[4,5]。本研究表明，金蓮花藥渣中某些成分，經過酵母菌代謝、轉化后產生了新的活性成分，這些新的化合物中的某些成分可能對真菌有抑制或殺滅作用，并能夠增加氟康唑的抗菌活性，從而產生新的藥理作用，具體是什么活性成分值得深入研究。我國每年有大量中藥渣產生，多數被廢棄掉，不僅污染環(huán)境，而且中藥資源浪費很大。因此，如何將中藥渣充分利用，變廢為寶，意義深遠。

參考文獻

[1]Magaldi S，Mata S，Hartung C，et al.In vitro susceptibility of 137 Candida sp isolates from HIV positive patients to several antifungal drugs[J].Mycopathologia，2000，149(2):63-70

[2]Marchetti O,Bille J,Fluekiger U,et al.Fungal Infection Network of Switzerland.Epidemiology of candidemia in Swiss tertiary care hospitals:secular trends[J].Clin Infeet Dis,2004, 38(3):311-320

[3]Wllite TC,Marr KA,Bowden RA.Clinical,cellular,and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance[J].Clin Microbiol Rev,1998,11(2):392-402

[4]敖楊,高華君,劉文濤,等.金蓮花藥渣水提物對小鼠抗應激反應及免疫能力的影響[J].河北聯合大學學報(醫(yī)學版),2012,14(6):768-770

[5]高華君,劉文濤,王珊,等.金蓮花藥渣發(fā)酵物微量元素測定及發(fā)酵時間的影響[J].河北聯合大學學報(醫(yī)學版),2014,,16(1):59-60

[6]馮會紅,李萌萌,牛云鋒,等. 金蓮花水提液對免疫抑制小鼠應激反應和免疫器官的影響[J].河北聯合大學學報(醫(yī)學版),2011,13(6):740-741

[7]羅勝田,梁志琴,于紹華,等.念珠菌性陰道炎的治療[J].中國傷殘醫(yī)學,2013, 21(9):456-457

[8]賈蕊莉,張靜濤,樊曉君,等.甲硝唑、制霉菌素聯合陰道臭氧灌洗治療陰道炎療效觀察[J]. 陜西醫(yī)學雜志,2013,42(7):900-901

[9]譚安菊,周雯,陳慧,等.金蓮花藥材高效液相色譜指紋圖譜研究[J].貴陽醫(yī)學院學報, 2013, 38(5):489-492

[10]劉平,陳光暉,鄧淑華,等.金蓮花總黃酮抗菌作用的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013, 19(6):207-210

[11]楊靜偉,張貴君,吳明,等.中藥金蓮花藥效組分抗炎鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國藥物評價,2013, 30(4):210-213

[12]郭筠芳,趙章.金蓮花軟膠囊治療急性咽炎122例臨床觀察[J].湖北中醫(yī)雜志,2012, 34(4): 49

(2015-06-25收稿)(王一伊編輯)