溶酶體膜蛋白Sidt2對血糖代謝的影響

王李卓1,2，章堯1，2，余翠2,3，熊錢穎2,3，譚鳳彪1，2，蔣雪2，陸曉華4，夏禮斌3，陸美琴3，陳月平3，張斌華3，凌烈峰1，高家林2,3

(1．皖南醫(yī)學院生物化學教研室，安徽蕪湖241002;2．皖南醫(yī)學院活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽蕪湖241002;3．皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽蕪湖241001；4．皖南醫(yī)學院機能實驗中心，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：通過模式動物研究溶酶體膜蛋白Sidt2與糖代謝的關(guān)系。方法：利用LoxP-Flox-LoxP系統(tǒng)，通過基因重組及打靶技術(shù)獲得Sidt2剔除小鼠模型。檢測成年小鼠的空腹血糖及葡萄糖耐量，評估Sidt2基因剔除對小鼠糖代謝的影響。同時通過HE染色觀察Sidt2-/-小鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果：通過對Sidt2剔除模型小鼠的Sidt2 mRNA及蛋白水平鑒定，確定Sidt2基因剔除小鼠模型成功構(gòu)建。對小鼠末梢血糖檢測發(fā)現(xiàn)，Sidt2-/-成年小鼠表現(xiàn)出空腹血糖增高及糖耐量受損的糖尿病表現(xiàn)。對Sidt2-/-小鼠胰島形態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，其胰島出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，胰島空泡變性及部分細胞出現(xiàn)肥大等病理改變。結(jié)論：溶酶體膜蛋白Sidt2與糖代謝密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】溶酶體膜蛋白；Sidt2；糖代謝；糖尿病

【文獻標識碼】【中圖號】R 587.1A

DOI【】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.06.002

文章編號：1002-0217(2015)06-0522-04

基金項目：安徽省高等學校自然科學研究

收稿日期：2015-07-03

作者簡介：劉磊(1978-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，(電話)13625528388，(電子信箱)bbmcll@163.com；

通訊作者楊麗娟，女，講師，碩士，(電子信箱)@163.com，.

Effects of lysosomal membrane proteins Sidt2 on glucose metabolismWANGLizhuo,ZHANGYao,YUCui,XIONGQianyin,TANFengbiao,JIANGXue,LUXiaohua,XIALibin,LUMeiqin,CHENYueping,ZHANGBinhua,LINGLiefeng,GAOJialin

Department of Biochemistry，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China

Abstract【】Objective：To discover the relationship between lysosome membrane protein Sidt2 and glucose metabolism through model animal.Methods:Sidt2 knockout mouse models were obtained by using LoxP-Flox-LoxP system,which based on the technologies of genetic recombination and gene targeting.By Fasting glucose and glucose tolerance test,the effects of Sidt2 deficiency on glucose metabolism were observed in Sidt2-/- mice.Furtherly,we analyzed the morphology change in Sidt2-/- mice islets,by hematoxylineosin staining.Results:Sidt2 knockout mice were produced successfully and verified by the analyzing the mRNA and protein expression of Sidt2.By peripheral blood glucose detecting,adult Sidt2-/- mice showed increased fasting glucose and impaired glucose tolerance.The pathology changes including disorder structure itself,islet cavity change and hypertrophic islet cells were also shown in Sidt2-/- deficiency mice at 12 months age,whereas the cotemporary controls showed normal islets.Conclusion:Lysosomal membrane protein Sidt2 is closely related to the glucose metabolism.

【Key words】 lysosome membrane proteins;Sidt2;glucose metabolism;diabetes mellitus

傳統(tǒng)觀點一直認為溶酶體只是細胞的垃圾處理廠，參與細胞對老舊物質(zhì)的消化和處理，并將處理后產(chǎn)物重新輸出,為細胞新陳代謝所用[1- 2]。后來隨著對溶酶體認識的深入，我們發(fā)現(xiàn)溶酶體的作用遠不止如此，其還參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細胞外膜的修復(fù)，參與凋亡、自噬的調(diào)控[3]。但對于溶酶體與糖尿病及胰島β細胞的關(guān)系，一直少有人研究。Sidt2(SID1 transmembrane family,member 2)是我們前期新發(fā)現(xiàn)的溶酶體膜蛋白[4]，對其功能一直不清楚[5]。通過模式動物模型的建立，可以很好地去研究某個蛋白質(zhì)或基因的功能。本研究我們通過條件性基因剔除技術(shù)，建立了Sidt2基因剔除小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)作為溶酶體膜蛋白，Sidt2與血糖代謝密切相關(guān)。

1材料與方法

1.1實驗動物實驗所用129Sv小鼠購自上海斯萊德動物中心；Cre小鼠購自南京大學模式動物研究所。所有動物實驗均得到皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院動物倫理委員會的批準。

1.2Sidt2剔除小鼠模型制備小鼠Sidt2基因由小鼠基因文庫得到。其背景資料如下：Sidt2 Ensembl Gene ID:ENSMUSG00000034908，http://www.ensembl.org/index.html。利用pBR322質(zhì)粒構(gòu)建Sidt2-ABRLFn-pBR322打靶載體。打靶載體融合進可被Cre酶識別的LoxP-Flox-LoxP系統(tǒng)(Flox區(qū)為Sidt2基因2號外顯子)，經(jīng)酶切分析和測序正確無誤后，將Not Ⅰ線性化的載體電轉(zhuǎn)化入小鼠胚胎干細胞(ES，CJ17)。挑選經(jīng)G418和Ganciclivor篩選的陽性克隆并經(jīng)鑒定后，通過囊胚腔顯微注射操作制備嵌合體小鼠(由上海南方模式動物中心協(xié)助完成)。嵌合雄鼠通過進一步繁育得到雜合子小鼠，并通過與Cre小鼠交配可得到Sidt2基因2號外顯子缺失的雜合Sidt2-/+小鼠，子代進一步繁育可得Sidt2-/-純合子小鼠，用于后續(xù)實驗，鑒定至少用到2對引物。

1.3RNA和蛋白水平檢測Sidt2基因mRNA水平檢測，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)檢測，方法參見文獻[4]。引物序列:上游引物，5′-ATGTGGTGGTGGTAGTGAAG-3′;下游引物，5′-AGATACACCACCACCATCAC- 3′，退火溫度56°。Sidt2蛋白水平檢測，利用特異性抗Sidt2的多克隆抗體(Abcam)進行western blotting免疫印跡檢測，方法參見文獻[4]。

1.4胰島HE染色 采用病理學常規(guī)石蠟切片，同齡同窩出生野生小鼠為對照，染色方法參照常規(guī)HE染色步驟，具體參見文獻[6]。

1.5小鼠末梢血糖監(jiān)測及葡萄糖耐量實驗空腹血糖檢測：小鼠第1晚10點后禁食，第2天上午8點，采用美國強生(穩(wěn)豪型)血糖儀檢測小鼠鼠尾末梢血糖?？崭箷r間參照前述。IPGTT(經(jīng)腹注射的葡萄糖耐量實驗)在小鼠空腹10～12 h時進行，按1.5 g/kg，根據(jù)體質(zhì)量給予腹腔注射葡萄糖，并分別在注射后0 min、30 min、60及120 min時間段檢測鼠尾末梢血糖。

1.6統(tǒng)計學分析所有計量資料用均數(shù)±標準差表示。各組不同時點比較采用F檢驗，兩組間同一時點數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P<0.05表示統(tǒng)計學有差異。

2結(jié)果

2.1Sidt2基因剔除小鼠模型構(gòu)建小鼠Sidt2基因(Ensembl Gene ID:ENSMUSG00000034908),定位于染色體9A5.2區(qū)帶，在哺乳動物中高度保守，有26個外顯子，分別編碼853,832個氨基酸殘基的多重跨膜蛋白質(zhì)，其中2號外顯子為兩種可變剪切所共有。所以本模型以2號外顯子為剔除對象，利用同源重組及基因打靶技術(shù)，在2號外顯子兩端插入可被Cre酶特異性識別的LoxP序列圖(圖1A)，得到雜合子后，利用Sidt2Flox/-小鼠與Cre小鼠交配，得到2號外顯子缺失的Sidt2-/+雜合子小鼠，雜合子小鼠之間雌雄相互交配可得到Sidt2-/-純合子剔除小鼠。當2號外顯子缺失后，會造成移碼突變而阻止Sidt2蛋白的翻譯，達到基因敲除的目的。本研究通過前面的技術(shù)成功構(gòu)建了Sidt2Flox/-模型小鼠(圖1B)，并進一步通過Cre酶作用得到了Sidt2-/+小鼠(圖1B)，在此基礎(chǔ)上進一步利用Sidt2-/+小鼠互交得到子代Sidt2-/-小鼠(圖1C)。經(jīng)RNA(圖1D)和蛋白質(zhì)(圖1E)水平驗證，Sidt2基因剔除小鼠模型成功建立。

A.打靶載體構(gòu)建策略；B.Sidt2Flox/- 及Sidt2+/-尾基因型鑒定；

C.純合子Sidt2-/-小鼠尾基因鑒定；D.RNA水平驗證；E.蛋白質(zhì)水平驗證

圖1Sidt2基因剔除小鼠模型建立及鑒定

Fig 1Generation and verification of Sidt2 conditional knockout mice

2.2Sidt2剔除后對小鼠糖代謝的影響Sidt2基因剔除小鼠獲得后，我們進行了一系列的表型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2剔除小鼠的一個重要特點是對糖代謝的影響。我們通過末梢血糖檢測，發(fā)現(xiàn)在3月齡左右成年小鼠表現(xiàn)出明顯的空腹血糖增高和葡萄糖耐量減低，在雄性Sidt2-/-小鼠，其空腹血糖為(6.06±0.93)mmol/L,而對照組Sidt2+/+小鼠為(4.90±0.48)mmol/L，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-3.023，P<0.05)，見圖2。同樣通過經(jīng)腹腔注射葡萄糖負荷實驗檢測表明，在雄性Sidt2-/-小鼠糖負荷后0 min、30 min、60及120 min 血糖分別為(5.82±1.0) mmol/L、(16.9±3.13) mmol/L、(13.2±2.27) mmol/L及(9.8±1.32) mmol/L(F=35.75,P<0.001)，較對照的Sidt2+/+小鼠組的(4.68±0.76) mmol/L、(12.1±2.28) mmol/L、(9.0±1.47)mmol/L及(6.3±1.38) mmol/L(F=30.96,P<0.001)血糖水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，或P<0.01)，見表1。

表1兩組小鼠IPGTT糖負荷結(jié)果比較(mmol/L，n=7)

Tab 1The analysis of IPGTT in Sidt2-/- and Sidt2+/+ mice(mmol/L，n=7)

組別0min30min60min120minF值P值實驗組5.82±1.016.9±3.1313.2±2.279.8±1.3235.750.000對照組4.68±0.7612.1±2.289.0±1.476.3±1.3830.960.000t值2.403.274.104.90P值0.0340.0070.0010.000

與sidt2+/+比較，*P<0.05，**P<0.01，n=7

圖2Sidt2剔除小鼠的空腹末梢血糖分析(3月齡小鼠)

Fig 2The analysis of fasting peripheral blood glucose in Sidt2 deficiency mice(three months age)

2.3Sidt2基因剔除后胰島形態(tài)變化Sidt2基因剔除后，是否會對小鼠胰島形態(tài)產(chǎn)生影響。為此我們從2月齡開始分別檢測了不同年齡Sidt2-/-小鼠胰島的形態(tài)變化，有趣的是，在早期3～6月齡Sidt2-/-小鼠，胰島形態(tài)主要表現(xiàn)出肥大(結(jié)果另文待發(fā)表)，而對更年長的12月齡以上的小鼠胰島觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-小鼠胰島表現(xiàn)出形狀欠規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂。在Sidt2-/-小鼠胰島，可見外分泌腺向胰島內(nèi)入侵增加，胰島細胞排列紊亂，透明變性增加(三角箭頭示，圖3B-1)，并可見肥大的細胞(圖3A-1，箭頭示)，具體見圖3A-1、3B-1。而野生同齡對照組小鼠則未發(fā)現(xiàn)上述改變(圖3A-2、3B-2)。

3討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，糖尿病的發(fā)病率正逐年提高，據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計，截止到2013年，全球已確診糖尿病人數(shù)超過3億人[7]，糖尿病已成為僅次于腫瘤、心腦血管疾病之后，嚴重威脅人類健康的第三大類疾病。目前對糖尿病的治療，仍停留在控制血糖，控制癥狀的三級治療水平[8]，而且治療效果有時并不理想。因此如果想在糖尿病的治療領(lǐng)域有所突破，必須要深入了解糖尿病發(fā)病機制，從而有可能為我們對糖尿病提出更為有效精準的分型，以利于我們的精準化、個體化治療，提高糖尿病的綜合治療效果。

A.小鼠胰島HE染色(1為Sidt2-/-小鼠，2為 Sidt2+/+小鼠，×200)；B.為局部放大的圖片(× 400)

圖3小鼠胰島形態(tài)學檢測

Fig 3Morphological detection of mice islet

可喜的是，目前對糖尿病發(fā)病機制的研究已經(jīng)取得了一定的進展，其機制的研究已經(jīng)深入到分子和基因水平?，F(xiàn)在，對部分類型糖尿病的發(fā)病機制已經(jīng)較為清楚，比如線粒體基因突變糖尿病[9-10]，成人發(fā)病型糖尿病(maturity onset diabetes in young，MODY)[11]，但是對于2型糖尿病和1型糖尿病，其發(fā)病機制仍未弄清。目前認為胰島素抵抗和胰島素受體及受體后效應(yīng)的缺陷可能是2型糖尿病的發(fā)病主因。而受體前的研究卻較少引人關(guān)注，這部分其實包含了一個廣闊的信號鏈，如胰島素的合成，胰島素分泌顆粒(分泌小泡)的包裝，分泌小泡與膜的融合，胞吐等環(huán)節(jié)，上述環(huán)節(jié)的變化也會直接影響到胰島素分泌并導(dǎo)致血糖代謝紊亂。此外胰島細胞自身的凋亡、自噬也開始引起學界的關(guān)注，但仍缺乏系統(tǒng)性的闡述。

溶酶體作為細胞的亞細胞器，對細胞的代謝尤為重要。傳統(tǒng)的觀念認為，溶酶體只是細胞處理廢棄物的一個垃圾場，對其作用的重要性有所忽略[1]。其實越來越多的研究表明溶酶體不僅參與細胞代謝廢物的處置，也參與到細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜的修復(fù)以及參與物質(zhì)的交換。同樣，溶酶體在糖尿病中的作用，以及在胰島β細胞功能中的作用也一直被忽視。在形態(tài)上，溶酶體與胰島分泌小泡(胰島素分泌顆粒)有著極高的相似性，比如他們都是單層膜包繞，都需要酸性的pH值環(huán)境才能發(fā)揮作用。在發(fā)生上，兩者也都是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出膜形成，更為重要的是，它們都在細胞內(nèi)參與了物質(zhì)的運輸。而在糖尿病的發(fā)病機制研究中，溶酶體與胰島素分泌小泡的這種相似性卻很少引起關(guān)注，溶酶體及溶酶體相關(guān)膜蛋白與糖尿病的關(guān)系也被學界長期忽視。事實上，已有研究表明，有溶酶體相關(guān)蛋白的功能障礙會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)糖尿病[12-13]，這無疑提醒了我們這兩者之間可能存在的特殊關(guān)系。

Sidt2是我們前期新發(fā)現(xiàn)的溶酶體膜蛋白，但對于其功能一直不清楚[4]。本研究中，基于條件性基因剔除技術(shù)[14-15]，我們通過基因打靶及同源重組獲得了Sidt2Flox/-小鼠，并通過與Cre小鼠繁育得到了Sidt2+/-雜合子小鼠，進一步通過子代繁育出Sidt2-/-小鼠模型，并通過基因及蛋白質(zhì)水平驗證表明Sidt2剔除模型成功建立。利用該模式小鼠，我們發(fā)現(xiàn)Sidt2對血糖代謝尤為重要，在成年Sidt2-/-小鼠(3月齡左右)，其血糖代謝明顯受到影響，其空腹血糖及糖負荷后血糖較同齡對照組小鼠明顯增高(圖2、表1)。形態(tài)影響功能，既然Sidt2-/-小鼠糖代謝表現(xiàn)出異常，那么其胰島是否有形態(tài)學的變化呢，我們對此也做了觀察，在早期3～6月齡，剔除小鼠胰島表現(xiàn)出肥大(結(jié)果另文待發(fā)表)，而在12月齡以后，則表現(xiàn)出胰島細胞的排列紊亂，空泡變性增多，以及部分肥大的胰島細胞(圖3)，這也正好解釋了Sidt2-/-小鼠血糖升高的原因。因此，通過本研究，我們可以看出作為一個新發(fā)現(xiàn)的溶酶體膜蛋白，Sidt2與糖代謝密切相關(guān)。而溶酶體及相關(guān)膜蛋白與糖尿病及胰島細胞的關(guān)系更需要我們進一步深入發(fā)掘，這將為我們對糖尿病的發(fā)病機制研究增加新的內(nèi)容和活力，有利于從發(fā)病機制對糖尿病進行精準的分型并指導(dǎo)治療。

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