乙偶姻對解淀粉芽胞桿菌細(xì)胞生理的影響

羅秋玲1,2,3，吳靜1，鄔敏辰1

(1.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122； 2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇無錫214122；

3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

摘要：以出發(fā)菌株解淀粉芽胞桿菌FMME044和其突變株E-11為研究對象，研究在不同濃度乙偶姻脅迫下，菌株的細(xì)胞活力、細(xì)胞存活率、胞內(nèi)蛋白含量、膜電位和膜通透性的變化。結(jié)果表明：在不同乙偶姻濃度下，突變株 E-11 的細(xì)胞活力、菌體存活率、胞內(nèi)蛋白含量和膜電位均高于出發(fā)菌株 FMME044。當(dāng)乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60 和80 g/L時(shí)，與出發(fā)菌株相比，突變株 E-11 的細(xì)胞活力分別提高了7.16%、17.7%和 40.1%；存活率分別提高了9.09%、18.3%和38.2%；胞內(nèi)蛋白含量分別提高了9.63%、19.1%和31.6%；膜電位比出發(fā)菌株分別提高了 6.28%、9.14%和 27.1%。突變株 E-11 的膜通透性低于出發(fā)菌株，分別降低了6.33%、16.1%和33.1%。在抵抗外界乙偶姻情況下，乙偶姻耐受性菌株 E-11 的這些參數(shù)均高于出發(fā)菌株(膜通透性相反)。說明乙偶姻會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，但這種毒性可以通過增加菌體自身抗性而得以緩解。

關(guān)鍵詞：Bacillus amyloliquefaciens；乙偶姻；細(xì)胞生理；耐受性；毒性

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.009

收稿日期：2014-04-11

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA022108)；國家自然科學(xué)基金(31101229)；無錫市科技支持項(xiàng)目(CLE01N1111)

作者簡介：羅秋玲(1988—)，女，河南周口人，碩士研究生，研究方向：生物工程；吳靜(聯(lián)系人)，副教授，wujing@jiangnan.edu.cn；鄔敏辰(聯(lián)系人)，教授，biowmc@126.com

中圖分類號(hào)：Q935

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0049-06

Abstract：We studied the effects of acetoin on cell vitality,cell survival,cell protein content,cell of the membrane potential and membrane permeability of both the mutant E-11 and the starting strain FMME044. Under different acetoin concentrations,cell vitality,cell survival,cell protein content,cell of the membrane potential of the mutant E-11 increased than those of FMME044. When the concentration of acetoin at 40,60 and 80 g/L,compared with the starting strain FMME044,its cell vitality improved 7.16%,17.7% and 40.1%,respectively;its cell survival improved 9.09%,18.3% and 38.2%,respectively;its cell protein content improved 9.63%,19.1% and 31.6%,respectively.The membrane potential improved 6.28%,9.14% and 27.1%,respectively. Whereas the membrane potential of the mutant E-11 reduced (6.33%,16.1% and 33.1% than that of the control,respectively,when acetoin concentrations to 40,60 and 80 g/L). Furthermore,under the condition of resistance to acetoin,these parameters of the acetoin-tolerant mutant E-11 were higher than those of FMME044 (membrane permeability and vice versa). All these illustrate that the presence of acetoin could produce toxic to cells,but the toxicity could be eased by increasing bacteria tolerance to acetoin.

Keywords：Bacillus amyloliquefaciens; acetoin; cell physiology; tolerance; toxicity

Effects of acetoin on Bacillus amyloliquefaciens cell physiology

LUO Qiuling1,2,3,WU Jing1,WU Minchen1

(1.Wuxi Medical School,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Pharmaceutical Science,

Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.State Key Laboratory of

Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

乙偶姻作為一種重要的化學(xué)合成中間體，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等領(lǐng)域[1-3]，已被美國能源部指定為優(yōu)先開發(fā)的平臺(tái)化合物。目前，乙偶姻的生成方法主要包括化學(xué)法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。與化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法相比，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻具有生產(chǎn)效率高、原料來源廣泛、成本低廉等優(yōu)勢，因此，開展微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻的技術(shù)研究，具有重要意義。安全菌株，如解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)等，都是乙偶姻生產(chǎn)最常使用的發(fā)酵菌株，它們都具有發(fā)酵速度快、高產(chǎn)乙偶姻等優(yōu)良特性。然而，在發(fā)酵后期，高濃度乙偶姻的毒性影響到菌體的生長、存活和發(fā)酵能力，進(jìn)而限制了乙偶姻濃度的提高。Zhu等報(bào)道，高濃度乙偶姻的存在不但影響菌體生長，而且也會(huì)影響聚-L-谷氨酸(γ-PGA)的發(fā)酵生產(chǎn)。

目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的研究主要集中于以下四個(gè)方面：解析代謝機(jī)制[10]，調(diào)控代謝流量、抑制產(chǎn)物分解[11]，篩選高產(chǎn)菌株[12]，靜息細(xì)胞法生成高純度立體異構(gòu)體乙偶姻[13]。雖然，有文獻(xiàn)報(bào)道可以通過增加提高底物耐受性來提高乙偶姻的產(chǎn)量，但是人們卻忽略了菌株對產(chǎn)物乙偶姻的耐受性。乙偶姻作為有機(jī)溶劑對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，高濃度的乙偶姻甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡，進(jìn)而影響細(xì)胞進(jìn)一步生成乙偶姻。因此，為了更進(jìn)一步加強(qiáng)乙偶姻的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，需要了解乙偶姻抑制生理學(xué)基礎(chǔ)，分析菌株耐受乙偶姻機(jī)制，通過代謝工程手段改造解淀粉芽胞桿菌，提高其對乙偶姻的耐受能力，從而提高乙偶姻產(chǎn)量。

筆者應(yīng)用乙偶姻處理出發(fā)菌株(B.a￣m￣y￣l￣o￣l￣i￣q￣u￣e￣f￣a￣c￣i￣e￣n￣sFMME044)和耐受高濃度乙偶姻突變株E-11，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細(xì)胞活力、血球計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞存活率、分光光度計(jì)法測定細(xì)胞內(nèi)蛋白含量、熒光分光光度計(jì)檢測羅丹明123(Rh123)和二乙酸熒光素(FDA)細(xì)胞染色的熒光強(qiáng)度的變化，來探討細(xì)胞經(jīng)不同濃度乙偶姻處理細(xì)胞生長性能、膜電位和膜透性的變化，初步研究菌株耐受高濃度乙偶姻的機(jī)制，以期為選育優(yōu)良菌株和提升乙偶姻發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　菌種

解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciensFMME044)保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。耐受乙偶姻的突變株E-11是由B.amyloliquefaciensFMME044經(jīng)亞硝基胍誘變和適應(yīng)性進(jìn)化篩選獲得。

1.2　主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑和儀器

NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、二甲亞砜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、羅丹明123 (Rh123)、二乙酸熒光素(FDA)，Sigma公司；UVmini-1240型紫外-可見光分光光度計(jì)、F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；1-14DE型冷凍離心機(jī)，Sigma公司；iMARK酶標(biāo)儀，伯樂公司；XO-65D型超聲波細(xì)胞破碎儀，南京先歐儀器制造有限公司。

1.2.2主要試劑的配制

1) 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制。稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸餾水中,用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L即可。

2)配制MTT溶液。精確稱取0.5 g MTT，用蒸餾水定容至100 mL，4 ℃避光貯存于冰箱備用。

3)配制Rh123溶液。用無水乙醇配制0.19 mg/mL的Rh123溶液，4 ℃避光貯存于冰箱備用。

4)配制FDA溶液。精確稱取200 mg FDA，用丙酮定容至100 mL，4 ℃避光貯存于冰箱備用。

1.3　培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60、酵母粉10、大豆蛋白胨10、牛肉膏10、NaCl 5。

固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、酵母粉10、大豆蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂粉20。pH 7.0。

乙偶姻耐受性機(jī)制研究的培養(yǎng)基(g/L)：乙偶姻(0、40、60和80)、 葡萄糖60、酵母粉12.5、大豆蛋白胨12.5、K2HPO43、KH2PO43、MgSO4·7H2O 0.4。

1.4　實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理

從冷藏的甘油管中取0.2 mL接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。按10%的接種量將種子接入含有70 mL乙偶姻耐受性機(jī)制研究培養(yǎng)基的750 mL搖瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，然后加入乙偶姻，使培養(yǎng)基乙偶姻質(zhì)量濃度最終為0、40、60和80 g/L，6 h后取樣測指標(biāo)。

1.4.2細(xì)胞活力檢測

取經(jīng)過不同濃度乙偶姻處理的細(xì)胞，調(diào)OD600至1.0，加入96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)中。然后再加入MTT 20 μL/孔，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄各個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，之后每孔加入100 μL的二甲亞砜并振蕩搖勻10 min，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度A490(波長490 nm)[14]。

1.4.3菌體存活率的測定

用平板計(jì)數(shù)法[15]測定存活率，在無菌臺(tái)下把不同條件處理的細(xì)胞稀釋到OD600=1，取相同體積的稀釋液，5 000 r/min，離心5 min，收集菌體，用相同體積的生理鹽水重懸洗滌2次，然后懸浮于生理鹽水中。取1 mL懸浮液將細(xì)胞稀釋到10-4、10-5和10-6后，各取0.1 mL涂布于固體培養(yǎng)基平板中，37 ℃培養(yǎng)1 d，計(jì)算菌落數(shù)(每個(gè)梯度3個(gè)平行)。菌體存活率計(jì)算見式(1)。

存活率=存在乙偶姻的菌落數(shù)/對照菌落數(shù)×100%

(1)

1.4.4胞內(nèi)蛋白含量的測定

取經(jīng)過不同濃度乙偶姻處理的細(xì)胞，調(diào)OD600=1，取1 mL于離心管中，5 000 r/min離心5 min收集菌體，1 mL PBS溶液洗滌2次，清除胞外殘留蛋白，離心棄上清液，加入1 mL蒸餾水，200 W超聲破碎細(xì)胞20 min，得胞內(nèi)蛋白提取液。取20 μL蛋白提取液加入酶標(biāo)板，再在各孔加入200 μL Bradford試劑，迅速振蕩混勻1～2次。反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上測各孔的A595值[16]，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線見式(2)。

y=0.001 7x-0.013 8，R2=0.998 7

(2)

1.4.5膜電位和通透性的測定

參照文獻(xiàn)[17]測定膜電位和通透性，具體方法如下。

1)膜電位的測定。取一定體積的菌液，5 000r/min離心5 min，PBS(1×)溶液重懸洗滌2次，離心棄上清液。用PBS稀釋樣品OD600至1.0，取0.5 mL處理好的菌懸液于離心管中加入0.19 mg/mL Rh123乙醇溶液50 μL和450 μL PBS，避光反應(yīng)20 min，PBS溶液洗滌3次，離心棄上清液，加入0.5 mL PBS，使用熒光分光光度計(jì)測定。

2)膜通透性的測定。取一定體積的菌液，5 000 r/min離心5 min，PBS(1×)溶液重懸洗滌2次，離心棄上清液。用PBS稀釋樣品OD600至1.0，取1 mL處理好的菌懸液于離心管中加入2 mg/mL FDA 丙酮溶液500 mL和500 mL PBS，混勻、避光反應(yīng)30 min，然后離心棄上清液，PBS重懸液洗滌3次，離心棄上清液并加入1 mL PBS，使用熒光分光光度計(jì)測定。

2結(jié)果與討論

2.1　乙偶姻濃度對解淀粉芽胞桿菌生長性能的影響

2.1.1MTT實(shí)驗(yàn)分析乙偶姻濃度對細(xì)胞活力的影響

利用MTT方法檢測經(jīng)過乙偶姻處理的細(xì)胞活力，結(jié)果見圖1。由圖1可知： 對于突變株E-11，與未添加乙偶姻(對照)相比，乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，細(xì)胞活力分別降低了26.5%、39.9%和61.2%；對于出發(fā)菌株FMME044，與其對照組相比，乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，細(xì)胞活力分別降低了29.0%、47.2%和71.3%；當(dāng)乙偶姻為0、40、60和80 g/L時(shí)，突變株E-11的細(xì)胞活力比出發(fā)菌株FMME044提高了3.50%、7.16%、17.7%和40.1%。細(xì)胞活力是表征微生物細(xì)胞的活性或活的微生物細(xì)胞數(shù)量，能及時(shí)反映微生物細(xì)胞的生長狀況[14]，乙偶姻的存在直接影響了細(xì)胞正常生長，但這種影響程度會(huì)因菌體對乙偶姻耐受性的提高而得以緩解。

圖1　MTT分析乙偶姻濃度處理后的細(xì)胞活力變化 Fig.1　 Effects of acetoin on the changes of cell vitality by MTT assay

2.1.2乙偶姻濃度對菌體存活率的影響

單純通過測定菌體密度研究乙偶姻對菌株的影響，并不能說明菌體細(xì)胞的存活情況，因此，需要通過測定細(xì)胞的存活率來考察乙偶姻對菌株的影響。用不同濃度乙偶姻處理菌體，菌體的存活率發(fā)生變化，結(jié)果見圖2。由圖2可知：與對照相比，對于突變株E-11菌體存活率分別降低了22.3%(40 g/L)、44.3%(60 g/L)和64.9%(80 g/L)；對于出發(fā)菌株FMME044，與對照相比，菌體存活率分別降低了28.8%(40 g/L)，52.9%(60 g/L)和74.6%(80 g/L)；與出發(fā)菌株相比，突變株E-11的存活率分別提高了9.09%(40 g/L)，18.3%(60 g/L)和38.2%(80 g/L)。這些結(jié)果說明：乙偶姻的存在會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，濃度越大死亡率越高，通過提高菌株對乙偶姻耐受性可以減少菌體的死亡，從而進(jìn)一步提高菌體發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的能力。這也驗(yàn)證了在有機(jī)溶劑/水兩相系統(tǒng)中，會(huì)有少量有機(jī)溶劑吸附在細(xì)胞表面，并能通過細(xì)胞外膜滲透進(jìn)細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，對細(xì)胞膜造成破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。

圖2　 乙偶姻濃度對出發(fā)菌株FMME044和 突變菌株E-11菌體存活率的影響 Fig.2　Effects of acetoin concentrations on the cell survival rate

2.1.3乙偶姻濃度對胞內(nèi)蛋白外泄的影響

胞內(nèi)蛋白是細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及酶系的組成物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)整性對于維持細(xì)胞正常生理代謝是必不可少的。為了研究在不同濃度乙偶姻存在下胞內(nèi)蛋白外泄的情況，考察突變株和出發(fā)菌株在不同濃度乙偶姻處理下，經(jīng)過細(xì)胞破碎后，胞內(nèi)蛋白含量的變化結(jié)果見圖3。

圖3　 乙偶姻濃度對出發(fā)菌株FMME044和突變株 E-11胞內(nèi)蛋白外泄的影響 Fig.3　 Effects of acetoin concentration on the leakage of intracellular proteins

由圖3可知：胞內(nèi)蛋白含量隨著乙偶姻濃度的增加而下降。對于突變株E-11，與對照相比，乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，胞內(nèi)蛋白含量分別降低了16.4%、27.7%和42.9%；對于出發(fā)菌株FMME044，與對照組相比，乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，胞內(nèi)蛋白含量分別降低了18.5%、35.1%和53.6%；對比分析出發(fā)菌株與突變株E-11胞內(nèi)蛋白的含量，在不同乙偶姻濃度條件下，突變株E-11胞內(nèi)蛋白含量高于出發(fā)菌株，即當(dāng)乙偶姻質(zhì)量濃度為0、40、60 和80 g/L時(shí)，突變株E-11的胞內(nèi)蛋白含量分別比FMME044高6.91%、9.63%、19.1%和31.6%。這說明，經(jīng)過乙偶姻處理的菌體，細(xì)胞內(nèi)容物完整性遭到破壞，胞內(nèi)蛋白外泄，從而影響了菌體的正常生理代謝，導(dǎo)致后期發(fā)酵菌體量不斷下降、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度下降的直接原因[18]。

2.2　乙偶姻濃度對細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜可以選擇性地控制細(xì)胞內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的輸送，是維持胞內(nèi)滲透壓的結(jié)構(gòu)屏障，同時(shí)也是合成細(xì)胞壁和糖被等有關(guān)成分的重要場所。此外，細(xì)胞膜上含有與氧化磷酸化等能量代謝有關(guān)的酶系，被認(rèn)為是提供細(xì)胞所需要能量的產(chǎn)能基地，所以細(xì)胞膜是維持細(xì)胞正常生理代謝至關(guān)重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜完整性遭到破壞，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長受阻或死亡。乙偶姻，類似丁醇之類的有機(jī)溶劑一樣具有較強(qiáng)的疏水性，能夠改變細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)，因此影響生產(chǎn)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性與流動(dòng)性，從而對跨膜營養(yǎng)、離子的運(yùn)輸以及細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)甚至引起細(xì)胞死亡[19-21]。

2.2.1乙偶姻對膜電位的影響

Rh123是一種陽離子親脂性熒光染料，能通過細(xì)胞膜。由于活細(xì)胞內(nèi)外電勢不相同，存在跨膜電位，因而Rh123能特異地吸附于細(xì)胞內(nèi)膜上，Rh123的熒光強(qiáng)度降低，反應(yīng)膜電位也隨之降低或喪失[15]。所以，細(xì)胞膜經(jīng)Rh123染色后，可以使用熒光分光光度計(jì)來檢測熒光強(qiáng)度大小，探究細(xì)胞膜電位的變化，檢測結(jié)果見圖4。

圖4　 乙偶姻濃度對出發(fā)菌株FMME044和突變株 E-11 Rh123熒光強(qiáng)度的影響 Fig.4　Effects of acetoin concentration on the Rh123 intensity

由圖4可知：出發(fā)菌株與突變株E-11的Rh123熒光強(qiáng)度隨著乙偶姻濃度的增加而不斷下降，其中出發(fā)菌株熒光強(qiáng)度從100%(0 g/L)下降到46.1%(80 g/L)，即膜電位降低了53.9%；突變株熒光強(qiáng)度從100%(0 g/L)下降到58.6%(80 g/L)，即膜電位降低了41.4%。在不同乙偶姻濃度條件下，突變株E-11熒光強(qiáng)度均高于同一乙偶姻濃度時(shí)出發(fā)菌株的熒光強(qiáng)度。且隨著乙偶姻濃度的增加，兩菌的熒光強(qiáng)度之差逐漸增大，當(dāng)乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，突變株E-11的熒光強(qiáng)度(膜電位)比FMME044分別高了6.28%、9.14%和27.1%。

2.2.2乙偶姻對膜通透性的影響

FDA本身雖然不能發(fā)出熒光，但它能穿透細(xì)胞膜而被細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶分解為黃綠色熒光的熒光素分子而產(chǎn)生熒光，且由于其脂溶性生化物質(zhì)而得以保留于活細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，通透性會(huì)增加，熒光素分子便從胞漿中外漏，從而導(dǎo)致FDA熒光強(qiáng)度降低[17]。因此，可以檢測熒光強(qiáng)度的變化來反映細(xì)胞膜的完整性及通透性變化。

考察乙偶姻濃度對突變株E-11和出發(fā)菌株FMME044膜通透性的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知：無論是突變株還是出發(fā)菌株，其FDA熒光強(qiáng)度隨著乙偶姻濃度的增加而逐漸降低，且乙偶姻濃度越高，熒光強(qiáng)度變化越大。對于出發(fā)菌株，當(dāng)乙偶姻質(zhì)量濃度從0 g/L增至80 g/L，熒光強(qiáng)度從100%降為36.0%；而突變株E-11熒光強(qiáng)度則從100%下降為47.9%；比較出發(fā)菌株和突變株在不同乙偶姻濃度下的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)：隨著乙偶姻濃度的增加，突變株E-11熒光強(qiáng)度比出發(fā)菌株增加了6.33%(40 g/L)、16.1%(60 g/L)和33.1%(80 g/L)，即突變株E-11的膜通透性比出發(fā)菌株降低了6.33%、16.1%和33.1%。

圖5　 乙偶姻濃度對出發(fā)菌株FMME044和 突變株E-11 FDA熒光強(qiáng)度的影響 Fig.5　Effects of acetoin concentration on the FDA intensity

當(dāng)細(xì)胞處于乙偶姻環(huán)境脅迫時(shí)，乙偶姻能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部，從而引起細(xì)胞膜的變化，細(xì)胞膜通透性和膜電位的變化能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，因此，可以用 FDA、Rh123 對細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過熒光強(qiáng)度的變化來判別細(xì)胞膜的完整性。通過上述試驗(yàn)可知，加入乙偶姻后，F(xiàn)MME044 的膜電位與通透性變化較大，當(dāng)測定時(shí)間結(jié)束時(shí)，乙偶姻質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)，F(xiàn)MME044 膜通透性增加了 64.0%，膜電位下降了 53.9%，說明在高濃度乙偶姻脅迫下，F(xiàn)MME044細(xì)胞膜損傷較大；而 E-11 在同等條件下，膜通透性僅增加了52.1%，膜電位僅下降了41.4%，說明在乙偶姻不利環(huán)境下，E-11 細(xì)胞膜能保持較好的完整性，說明其有較好的抵抗乙偶姻沖擊的能力。另一方面，細(xì)胞膜的完整性對維持細(xì)胞的活性至關(guān)重要，當(dāng)其損傷嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起細(xì)胞的死亡。從乙偶姻耐受性而言，E-11 的性能優(yōu)于FMME044。

3結(jié)論

通過測定細(xì)胞活力、細(xì)胞存活率、胞內(nèi)蛋白含量、膜電位和膜通透性來研究不同濃度乙偶姻存在下對出發(fā)菌株和突變株E-11生理的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同乙偶姻濃度下，突變株 E-11 的細(xì)胞活力、菌體存活率和胞內(nèi)蛋白含量均高于出發(fā)菌株 FMME044；當(dāng)乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，突變株 E-11 的細(xì)胞活力比出發(fā)菌株 FMME044 分別提高了 7.16%、17.7%和 40.1%；存活率比出發(fā)菌株分別提高了9.09%、18.3%和38.2%；胞內(nèi)蛋白含量比出發(fā)菌株分別提高了9.63%、19.1%和31.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙偶姻的存在對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，降低細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率，引起菌株胞內(nèi)蛋白外泄，破壞細(xì)胞膜。當(dāng)乙偶姻質(zhì)量濃度為40、60和80 g/L時(shí)，突變株 E-11 的膜電位比出發(fā)菌株分別提高了6.28%、9.14%和27.1%；膜通透性比出發(fā)菌株分別降低了6.33%、16.1%和33.1%。這說明乙偶姻是影響膜通透性增加和膜電位降低的關(guān)鍵因素。由此可推測乙偶姻影響菌株是通過破壞細(xì)胞膜和引發(fā)胞內(nèi)物質(zhì)外泄等共同作用引起的。

本文研究結(jié)果可以指導(dǎo)通過代謝工程手段改造解淀粉芽胞桿菌，提高其對乙偶姻的耐受能力，為更進(jìn)一步加強(qiáng)乙偶姻的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度奠定了基礎(chǔ)。此外，發(fā)酵液中乙偶姻的濃度增加，還可以減少下游提取的成本和對環(huán)境的污染，利于節(jié)能與環(huán)保。

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(責(zé)任編輯荀志金)