王闖 王紹欣 董平栓 汪硯雨 王可 李轉珍 魏麗娟 陳士芳 孟雅麗閆鵬 劉向勇 程建新 王麗平 段娜娜

基礎研究

中華小豬急性心肌梗死心肌病理觀察

王闖 王紹欣 董平栓 汪硯雨 王可 李轉珍 魏麗娟 陳士芳 孟雅麗閆鵬 劉向勇 程建新 王麗平 段娜娜

目的 探討腫瘤壞死因子-alpha（TNF-α）在中華小豬急性心肌梗死（AMI）梗死心肌中的動態(tài)表達，為AMI血運重建及心肌梗死后干預提供實驗依據(jù)。方法 7頭實驗性中華小豬全麻后Seldinger法穿刺右側股動脈，行冠脈造影后經(jīng)微導管注入明膠海綿封堵鈍緣支（OM支），建立AMI模型后，分別取第1、3、5、7、10、14、17天行免疫組化檢測心肌組織中TNF-α表達情況。結果 免疫組化顯示，正常豬心肌未見TNF-α表達。AMI后第3天壞死心肌中開始出現(xiàn)TNF-α表達，第5、7天表達逐漸升高，第10天達高峰，第14天開始下降,第17天進一步下降。結論 冠脈造影顯示，明膠海綿封堵OM支后其遠端血流消失，AMI模型成功建立。AMI后第10天壞死心肌中TNF-α表達最為明顯，與壞死心肌的炎癥及修復過程密切相關。

急性心肌梗死； 腫瘤壞死因子-alpha； 中華小豬； 動物模型

急性心肌梗死（AMI）是一種發(fā)病迅速、死亡率和致殘率極高的心臟疾病，其發(fā)病與劇烈的炎癥反應密切相關。腫瘤壞死因子-alpha（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）在炎癥反應中發(fā)揮關鍵的作用，但AMI后梗死心肌局部TNF-α的表達情況與炎癥和心肌修復的關系目前國內(nèi)外尚未達成共識。通過建立AMI動物模型，觀察AMI后不同時期TNF-α的動態(tài)變化，有可能為解決此問題提供實驗參考。中華小豬因其心臟在解剖結構、心臟血管分布等方面與人類相似，封堵其冠脈造成的缺血性心臟病發(fā)病過程與人類高度相似，一直是人類心血管疾病模型制備的優(yōu)選動物。研究顯示，AMI后梗死心肌周圍會發(fā)生劇烈的炎癥反應，炎癥反應的程度會影響心肌的修復過程，對患者預后至關重要。TNF-α是一個多向性的細胞因子，對心肌缺血極度敏感，可調(diào)節(jié)心肌細胞的存活和凋亡，觸發(fā)其他細胞的炎癥反應。傳統(tǒng)的研究方法以抽血觀察TNF-α的動態(tài)變化居多，對于動態(tài)觀察梗死心肌中TNF-α的變化過程鮮有報道。本研究使用明膠海綿封堵鈍緣支建立中華小豬AMI模型，直觀、連續(xù)、動態(tài)地觀察AMI后梗死心肌中TNF-α的表達情況，探討AMI后TNF-α的干預治療與TNF-α在梗死心肌中表達情況的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 中華小豬由泰州泰和生物技術有限公司提供，8只，體重13～18 kg，全部經(jīng)防疫檢驗合格，檢疫證號3205197447，許可證號SCXK（蘇）2011-0002。同種同窩雄性。排除體質(zhì)不良、進食不佳、近期患病的豬。

1.2 實驗材料 ⑴麻醉藥品：地西泮注射液（哈藥集團三精制藥股份有限公司）、氯胺酮（江蘇恒潤醫(yī)藥股份有限公司）、利多卡因（江蘇藥業(yè)集團新鄭股份有限公司）。⑵造影劑：碘普羅胺（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司）。⑶HE染色試劑：二甲苯（天津市永大化學試劑有限公司）、無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司）、甲醛（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）、TNF-α檢測試劑盒（美國ABCAM公司，貨號AB1793）。⑷血管封堵材料：明膠海綿（廣州市彥達貿(mào)易有限公司）。⑸除顫儀（日本光電工業(yè)株式會社TEC-5521C）。⑹數(shù)字減影血管造影即DSA（PHLIPSMML19）。⑺心電監(jiān)護儀（Philips Medizin Systeme Boebligen Gmbh German M8001A)。⑻吸痰機（魚躍醫(yī)療TE-A）。⑼電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司202-1型）、載玻片（海倫 規(guī)格：25.0 mm×7.5 mm 厚度：1～1.2 mm）及蓋玻片（鹽城市信泰醫(yī)療器械廠0.13～0.17 mm）。⑽包埋機（LEIKE湖北襄樊徠克電子儀器廠PPDB/21）。⑾冷臺機（LEIKE湖北襄樊徠克電子儀器廠PPDB/21）及切片機（LEICA RM2235）。⑿數(shù)碼電子顯微鏡（NIKON ECLIPSE 80i）。⒀造影介入材料：6F動脈鞘管、6FJR、微導管、指引導絲、J型導絲等（臨床使用過的廢舊材料，均經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒）。⒁備用藥品：肝素（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司）、腎上腺素（天津藥業(yè)集團）、多巴胺（上海禾豐制藥有限公司）、尼可剎米（天津藥業(yè)集團）、阿托品（福仁藥業(yè)集團信陽有限公司）、氯化鉀（北京益民藥業(yè)有限公司）、硝酸甘油（北京益民藥業(yè)有限公司）、地塞米松針（開封制藥有限公司）等。

1.3 AMI模型建立方法 小豬禁食12 h，禁水8 h，肌內(nèi)注射氯胺酮10 mg/kg誘導麻醉。將實驗豬清洗干凈后四肢固定于特定木板上，然后放置于導管床上，以3 L/min流量給氧，胸部及四肢備皮，心電持續(xù)監(jiān)護，用套管針于耳緣大靜脈建立靜脈通道，靜脈緩慢推注1 ml安定及10 mg氯胺酮。術中小豬一直保持麻醉狀態(tài)，除顫儀及吸痰機備用。

采用Seldinger法穿刺右股動脈建立動物模型。具體步驟：①碘伏常規(guī)消毒，鋪無菌巾。②觸及右側股動脈搏動最強處，利多卡因局部麻醉，穿刺成功后可見鮮紅色動脈血自針尾噴出，送入導引導絲，沿引導絲送入6 F動脈鞘管，隨即彈丸式注入肝素1000 U。術中每30 min可追加肝素2000 U。③在J型導絲引導下將Guiding導管送入升主動脈根部，行左右冠狀動脈多體位造影。心電監(jiān)護示：竇性心律，160～200 次/min，血壓 160/130 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。將Runthrough遠端，微導管送入OM支近端，撤出導絲，將明膠海綿混懸液（明膠海綿溶于造影劑碘普羅胺內(nèi)）經(jīng)微導管推入，造影顯示OM支遠端血流消失，撤出微導管，監(jiān)測各項生命體征及氧飽和度。④術畢，拔出6 F動脈鞘管，置入人用鎖骨下靜脈套管，封閉股動脈創(chuàng)口，肝素封管后，將其固定于術區(qū)，貼膜覆蓋。實驗結束后，將動物送回飼養(yǎng)中心，單豬飼養(yǎng)，避免感染。

1.4 梗死心肌病理切片的制作 分別取AMI后第 1、3、5、7、10、14、17 天小豬和對照豬整體心臟，經(jīng)4%的甲醛固定后于左室側壁分別切取4塊梗死心肌及1塊正常心肌，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，行TNF-α免疫組化檢測。TNF-α免疫組化檢測一抗為小鼠抗豬單克隆抗體，二抗為通用型二抗兔抗鼠免疫組化試劑盒。①3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。③蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×3次，檸檬酸加熱抗原修復。③10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，棄去血清；滴加一抗工作液（稀釋1∶200），37℃孵育，4℃過夜。④PBS沖洗5 min×3次。⑤滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育15 min。⑥PBS沖洗5 min×3次。⑦滴加適量的堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min。⑧PBS沖洗5 min×3次。⑨顯色劑顯色（DAB顯色）6 min。⑩自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片，于40×倍電子數(shù)碼顯微鏡下觀察并攝片。

1.5 主要觀察指標 AMI后不同天數(shù)梗死心肌中TNF-α的動態(tài)變化。

1.6 設計、實施、評估者 實驗由通訊作者設計，實施由第一作者及其他作者負責，評估由河南科技大學一附院病理科、河南科技大學新區(qū)醫(yī)院實驗室及河南科技大學醫(yī)學院生物教研室負責。

2 結果

2.1 中華小豬AMI前后冠脈造影情況 7頭中華小豬均成功進行了冠脈造影術及明膠海綿封堵術。中華小豬冠脈走形與人類冠脈類似，明膠海綿封堵OM支后顯示遠端血流消失，AMI模型成功建立。見圖1。

2.2 TNF-α的表達情況 為研究AMI后不同時期梗死心肌中TNF-α的表達情況，對中華小豬AMI后第 1、3、5、7、10、14 天的梗死心?。▓D 2）免疫組化檢測顯示：正常未梗死心肌中未見TNF-α的表達（圖2A）；AMI后第1天梗死心肌中幾乎未見TNF-α的表達（圖2B）；梗死后第3天開始出現(xiàn)TNF-α的表達（圖2C）；梗死后第5、7天TNF-α的表達繼續(xù)增加（圖2D、E），于第10天達高峰（圖2F）；梗死后第 14、17天逐漸下降（圖 2G、H）。

3 討論

TNF-α是一種具有廣泛生物學效應的細胞因子，屬于腫瘤壞死因子及其受體（tumor necrosis factor/receptor，TNF/TNFR）超家族的一員，與一些病理過程如急性炎癥反應、自身免疫性疾病等密切相關。炎癥反應在AMI中發(fā)揮關鍵作用，血液和心肌中TNF-α升高見于心肌梗死等疾病中。而TNF-α是炎癥反應強有力的觸發(fā)者，多種類型的細胞如淋巴細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞等均能產(chǎn)生TNF-α。心肌細胞缺血時亦能分泌TNF-α[1]，但在心肌損傷后主要由單核-巨噬細胞分泌[2]。研究發(fā)現(xiàn)，血液中TNF-α濃度在AMI后1 h顯著升高[3]，于24 h內(nèi)達高峰[4]，隨后開始下降，7 d后逐漸恢復正常。

國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，AMI后心肌中TNF-α在梗死后數(shù)天內(nèi)大量增加，引起心肌嚴重的炎癥反應，心肌細胞凋亡、肥大，心臟重塑，最終導致射血分數(shù)減小，梗死面積擴大，心肌收縮功能障礙及致命性心律失常和心臟破裂等一系列嚴重并發(fā)癥。AMI心肌壞死的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子密切相關。TNF-α在AMI早期血液中即有較高濃度，隨后遷移至心肌高度表達，對心肌壞死的進展及修復有重要影響。但動態(tài)觀察壞死心肌中TNF-α的表達，國內(nèi)外鮮有報道。本研究系統(tǒng)觀察了AMI后第1、3、5、7、10、14、17 天梗死心肌中 TNF-α 的表達情況，AMI后第1天梗死心肌中幾乎未見TNF-α的表達，第3天開始出現(xiàn)TNF-α的表達，第5、7天繼續(xù)增多，梗死后第10天表達顯著增強，隨后開始下降。梗死后第5～17天可見大量肉芽組織和纖維瘢痕組織，梗死區(qū)域逐漸被其完全取代，可見許多新生的毛細血管、成纖維細胞和淋巴細胞。這充分說明AMI后心肌中的炎癥發(fā)生發(fā)展及動態(tài)演變過程，而TNF-α可能起到一定作用。

Sun等[5]通過結扎實驗鼠左前降支冠狀動脈建立心肌梗死模型的研究發(fā)現(xiàn)，梗死心肌局部TNF-α的升高，通過誘發(fā)過度的炎癥反應、基質(zhì)和膠原蛋白的降解，提高基質(zhì)金屬蛋白酶的活性和增加細胞凋亡，促進急性心臟破裂和慢性左心室功能障礙。有學者[6]用TNF-α雜合體轉基因實驗鼠培育的表達TNF-α的后代模型研究發(fā)現(xiàn)，轉基因小鼠心肌過度表達的TNF-α引起心室擴大、射血分數(shù)降低、房性或室性心律失常，并降低實驗鼠的存活率。也有學者[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過堵塞大鼠左前降支冠狀動脈血管，30 min內(nèi)即發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)有TNF-α基因和蛋白表達。以上研究均說明，TNF-α能明顯促進心肌壞死的發(fā)生和發(fā)展，延緩心肌的修復進程。

研究已證實，AMI是一個急性炎癥過程，那么抑制這種炎癥過程能否減輕心肌細胞的炎癥反應、促進心肌較快修復，是目前研究的熱點問題，國內(nèi)外研究者正在進行一系列的研究和探討。Sugano等[8]通過結扎雄性大鼠左冠狀動脈建立的AMI模型的研究發(fā)現(xiàn)，AMI后早期釋放的TNF-α促進心肌損傷和誘發(fā)心肌細胞凋亡，用TNF-α拮抗劑即可溶性TNF-α1型受體（sTNFR1）表達的質(zhì)粒DNA心肌內(nèi)直接注射治療，可以降低心肌中TNF-α的生物活性和減少心肌細胞凋亡。Skyschally等[9]通過用豬冠狀動脈內(nèi)注入微滴建立的冠狀動脈微栓塞模型發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅能導致心肌舒縮功能障礙，而且延遲對心肌梗死的保護作用；用TNF-α抗體冠脈內(nèi)灌注能顯著減小心肌梗死面積。有學者用狗為載體研究心臟舒縮功能時發(fā)現(xiàn)，將含人類活性TNF-α重組體（rhTNF-α）的溶液注入成年雜種狗體內(nèi)，24 h后狗心臟收縮和舒張功能明顯減退[10]。Yokoyama等[11]通過使用成年貓心臟和分離的心肌細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α對成年貓的心室和分離的心肌細胞具有負性肌力作用，而清除TNF-α可以完全逆轉這種作用，進一步用TNF-α抗體中和治療，可以預防TNF-α對分離心肌細胞的負性肌力作用。

不同動物實驗表明，清除或中和TNF-α均能顯著減輕心肌壞死，加速修復過程。TNF-α單克隆抗體治療可顯著縮小心肌梗死面積，減少血液脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)物，減弱有害的心臟重塑，抑制對急性損傷失調(diào)的免疫反應[12,13]。TNF-α轉換酶介導單核-巨噬細胞中TNF-α的成熟在AMI的不良預后中發(fā)揮重要作用，而抑制TNF-α轉換酶也許是減少AMI后相關細胞產(chǎn)生TNF-α的可能靶點[14]。探索性心肌內(nèi)應用TNF-α抗體以抑制異常的免疫反應，逆轉一系列不利的心臟重塑過程，不失為未來研究的重點。

AMI后抑制TNF-α所誘發(fā)的一系列不利的效應可能具有廣闊的研究前景，為未來AMI患者的治療和預后帶來新的希望。但本研究樣本數(shù)較少，尚需大樣本的研究予以驗證。

（本文圖片第863頁）

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Pathological observation of Chinese small porcine AMI

WANG Chuang，WANG Shao-xin，DONG Ping-shuan，et al.Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

Objective To observe the dynamic expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）in myocardial tissue in which Chinese small porcine survive different days and to provide experimental basis of revascularization and intervention after AMI.Methods The obtuse marginal（OM）branch of 8 Chinese small porcines were blocked by gelatin sponge via microcatheter under general anesthesia through Seldinger right femoral artery puncture after coronary angiography.After AMI model were established successfully，the animals were sacrificed after 1，3，5，7，10，14，17 days respectively use immunohistochemical staining to test the expression of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）in the cardiac muscles.Results Immunohistochemistry showed there was no TNF-α in normal myocardial tissue，TNF-α was started to express in the necrotic myocardial tissue on 3 day after AMI，increased gradually on 5-7 day post-AMI，peaked on 10 day and started to decrease on 14 day，decreased further on 17 day.Conclusion Coronary angiography showed that the remote flow disappeared after the OM branches were blocked by gelatin sponge，the model of AMI was establish successfully.The necrotic myocardial tissue was repaired preliminarily and revascularization was safe relatively.The expression of TNF-α in the necrotic areas peaked on 10 day post-AMI and were associated with the inflammation and reparative processes of the necrotic cardiac muscles.

Acute myocardial infarction； Tumor necrosis factor alpha； Chinese small porcine； The model of animal

WANG Shao-xin，E-mail：WSXdoctor@163.com

洛陽市科技支撐項目資助（項目編號：1101047A）

471003 河南省洛陽市，河南科技大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

王紹欣，E-mail：WSXdoctor@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．09．022

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）09-0850-04

2016-03-02）