唐弘碩 袁夢(mèng)琪 楊 雷 王 影①

(1. 天津市第五十四中學(xué) 天津 300000; 2. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003)

近年來, 隨著海水富營養(yǎng)化的加劇, 赤潮頻發(fā)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類生活造成了嚴(yán)重影響。海洋卡盾藻(Chattonella marina)是一種隸屬于針胞藻綱(Raphidophyceae)、卡盾藻屬(Chattonella)的魚毒性赤潮藻種, 可引起單相型有毒赤潮(安鑫龍等, 2010)。近年來, 該藻藻華在我國沿海頻發(fā), 對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害。青島大扁藻(Platymonas helgolandica var.tsingtaoensis)是屬于綠藻綱(Chlorophyceae)、扁藻屬(Platymonas)的餌料微藻, 被廣泛用作貝類、海參等海產(chǎn)品的育苗開口餌料(湛江水產(chǎn)專科學(xué)校, 1980), 為廣溫廣鹽特性的我國近岸廣布種(張德瑞等, 1964)。卡盾藻產(chǎn)生的毒素可能是它抑制其他藻生長而成為赤潮優(yōu)勢(shì)種的原因(Marshall et al, 1999); 研究發(fā)現(xiàn),海洋卡盾藻無細(xì)胞濾液能顯著抑制赤潮藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)和東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的種群增長(楊翠云等, 2011); 也有研究表明, 餌料藻亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)的藻液、細(xì)胞內(nèi)含物和培養(yǎng)濾液均可抑制赤潮藻米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)的生長(馬龍, 2008), 但赤潮藻對(duì)于餌料微藻影響的研究目前仍較少。

化感作用(Allelopathy), 又稱他感作用或相生相克, 指真菌、細(xì)菌、藻類等生物通過產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物對(duì)生物和農(nóng)業(yè)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響, 在陸地、淡水和海水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在, 包括促進(jìn)和抑制兩方面的作用(Legrand et al, 2003)。藻類化感作用是指藻類能夠通過分泌物質(zhì)影響自身或周圍其他藻類、微生物或高等植物的生長, 或致使其改變營養(yǎng)鹽離子的聚集和作用(Inderjit et al, 1994)。微藻之間的種間關(guān)系主要包括種間競爭和互利共生等, 微藻干擾性競爭機(jī)制主要通過分泌化感物質(zhì)實(shí)現(xiàn), 化感作用已成為微藻群落結(jié)構(gòu)變化和赤潮演替中最重要的因素之一(王悠等, 2006; 郝雯瑾等, 2008; 洪喻等, 2014)。因此,推斷海洋卡盾藻通過化感作用對(duì)青島大扁藻產(chǎn)生危害, 然而目前關(guān)于赤潮微藻與餌料微藻間化感作用的研究報(bào)道尚不多見(馬龍, 2008; 潘遠(yuǎn)健, 2015)。

人類活動(dòng)使臭氧層侵蝕不斷加劇, 到達(dá)地面的紫外線中UV-B輻射(280—320nm)不斷增強(qiáng), 微藻作為在海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者, UV-B對(duì)其影響將威脅海洋碳庫和整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)。研究表明,UV-B輻射能顯著抑制海洋微藻的生長(蔡恒江等,2005b), 且影響海洋微藻的形態(tài)、光合作用、生物量和有機(jī)物含量等(Tevini et al, 1989)。UV-B輻射增強(qiáng)可改變兩種微藻間的競爭能力(張培玉等, 2007; 謝志浩等, 2011), 也可以加強(qiáng)微藻與大型海藻相互間的種群生長抑制作用, 影響大藻對(duì)微藻的化感效應(yīng), 例如高劑量 UV-B輻射(3.0J/m2)使小珊瑚藻(Corallina pilulifera)對(duì)赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)的化感效應(yīng)明顯減弱(蔡恒江, 2004; 張培玉, 2005; 周立明, 2008)。

本實(shí)驗(yàn)選取赤潮微藻海洋卡盾藻和餌料微藻青島大扁藻作為實(shí)驗(yàn)材料, 研究海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長競爭關(guān)系, 探討海洋卡盾藻對(duì)青島大扁藻可能的致毒機(jī)制與危害方式, 為探討赤潮微藻與餌料微藻的相互作用機(jī)制及評(píng)價(jià)赤潮微藻對(duì)海洋初級(jí)生產(chǎn)者的危害奠定基礎(chǔ)。另外, 通過研究UV-B輻射增強(qiáng)對(duì)兩種藻間相互作用的影響, 為評(píng)價(jià)臭氧層破壞對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)尤其是近岸養(yǎng)殖水域的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用的青島大扁藻藻種取自中國海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 海洋卡盾藻藻種取自中國科學(xué)院海洋研究所。

1.2 培養(yǎng)方法

兩種藻均無菌培養(yǎng)于添加 f/2培養(yǎng)鹽(Guillard,1975)的滅菌海水中, 培養(yǎng)溫度為(20±1)°C, 光照強(qiáng)度為 70μmol/(m2·s), 光暗比為 L∶D=12h∶12h, 放置于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng), 每日定時(shí)搖晃三角瓶 6次, 防止微藻貼壁生長, 每日向三角瓶中補(bǔ)充 f/2培養(yǎng)鹽以避免營養(yǎng)鹽的限制。實(shí)驗(yàn)開始前, 將兩種藻在指數(shù)生長期接種, 并連續(xù)培養(yǎng) 3—4個(gè)周期, 使藻細(xì)胞實(shí)現(xiàn)同步生長。

天然海水取自青島魯迅公園附近海域, 經(jīng)脫脂棉和 300目篩絹粗濾, 再使用 0.45μm醋酸纖維濾膜抽濾除去顆粒物質(zhì), 使用高壓蒸汽滅菌鍋在121°C滅菌20min, 冷卻到室溫后用于藻類培養(yǎng), pH為7.9±0.1,鹽度為31—33。

1.3 UV-B輻射體系

UV-B輻射體系所用燈管外壁用乙酸纖維素薄膜(0.12mm)全部包被, 去除280nm的短波輻射, 使用紫外輻射強(qiáng)度儀(北京師范大學(xué)光電儀器廠)進(jìn)行輻射強(qiáng)度測(cè)定。整個(gè)體系正式實(shí)驗(yàn)前連續(xù)照射 72h, 用于減少薄膜使用過程中過濾作用的不穩(wěn)定性, 且薄膜每周更換一次以防老化。實(shí)驗(yàn)中輻射強(qiáng)度設(shè)置為1.25μW/cm2, 設(shè)置輻射劑量為0的日光燈管對(duì)照組和2.16J/m2的 UV-B處理組, 通過對(duì)輻射時(shí)間的控制達(dá)到輻射劑量。

1.4 研究方法

1.4.1 海洋卡盾藻和青島大扁藻的相互作用關(guān)系研究 (1) 不同初始密度的海洋卡盾藻和青島大扁藻單培養(yǎng)： 取生長狀況良好、處于指數(shù)生長期的海洋卡盾藻藻液和青島大扁藻藻液各1mL用Lugol’s試劑固定。海洋卡盾藻因密度較低且藻體較大, 使用藻類計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù), 青島大扁藻因藻細(xì)胞密度較高, 將藻液稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù), 計(jì)算藻細(xì)胞密度后分別將不同體積的兩種藻液接種于100mL滅菌三角瓶中, 使初始接種密度分別為200、600、1800cell/mL。

(2) 不同初始生物量比的海洋卡盾藻和青島大扁藻共培養(yǎng)： 海洋卡盾藻(Cm)與青島大扁藻(Ph)的細(xì)胞體積比約為 3∶1, 因此共培養(yǎng)體系中設(shè)定兩種藻的初始接種比例為 Cm∶Ph=1∶3、1∶1、3∶1。青島大扁藻的初始接種密度保持為600cell/mL, 改變了海洋卡盾藻的初始密度, 分別為 200、600、1800cell/mL,實(shí)驗(yàn)周期共為30d, 每隔2d計(jì)數(shù)一次藻細(xì)胞密度。

(3) 海洋卡盾藻去藻過濾液對(duì)青島大扁藻生長的影響： 將海洋卡盾藻藻液的細(xì)胞密度調(diào)整至3600cell/mL, 經(jīng) 0.22μm 玻璃纖維素濾膜過濾, 收集濾液作為母液, 用 f/2營養(yǎng)鹽重新加富, 采用一次性添加的方式, 分別將 5.56、16.67和 50mL母液加入100mL滅菌三角瓶中, 以添加f/2營養(yǎng)鹽的滅菌海水作為對(duì)照, 將生長于指數(shù)生長期的青島大扁藻同時(shí)接種于不同實(shí)驗(yàn)組中, 接種密度均為 600cell/mL, 最后用已添加f/2營養(yǎng)鹽的滅菌海水定容至100mL, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行, 恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d,隔天計(jì)數(shù)一次藻細(xì)胞密度。

(4) 海洋卡盾藻藻細(xì)胞裂解液對(duì)青島大扁藻生長的影響： 將海洋卡盾藻藻液在 4°C 4000r/min條件下離心4min, 棄去上清, 用滅菌海水沖洗兩遍, 加入滅菌海水將藻細(xì)胞密度調(diào)整至 3600cell/mL, 然后將藻液加入 10mL無菌離心管中, 插入冰盒內(nèi), 使用超細(xì)勻漿機(jī)(FLUKO F6-10)勻漿破碎細(xì)胞后獲得藻細(xì)胞裂解液, 4°C 4000r/min離心5min, 收集上清液作為母液, 用 f/2營養(yǎng)鹽重新加富, 分別將 5.56、16.67和50mL母液加入100mL滅菌三角瓶中, 以添加f/2營養(yǎng)鹽的滅菌海水作為對(duì)照, 青島大扁藻的初始接種密度均為 600cell/mL, 最后用添加 f/2營養(yǎng)鹽的滅菌海水定容至100mL, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行, 恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10d, 隔天計(jì)數(shù)青島大扁藻藻細(xì)胞密度。

1.4.2 海洋卡盾藻和青島大扁藻的相互作用對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng) (1) UV-B輻射對(duì)單培養(yǎng)海洋卡盾藻和青島大扁藻生長的影響： 兩種微藻均設(shè)置初始密度為 200、600、1800cell/mL的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 以2.16J/m2UV-B輻射劑量為處理組, 以日光燈管照射為對(duì)照組。為了防止微藻的自遮蔽作用, 將藻液倒于直徑90mm、高18mm的培養(yǎng)皿中, 置于UV-B燈管正下方 20cm處進(jìn)行照射, 每日定時(shí)輻照處理 1次,輻射結(jié)束將藻液重新轉(zhuǎn)移回 100mL三角瓶, 放置在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng), 實(shí)驗(yàn)周期為4d(96h), 計(jì)數(shù)96h時(shí)的藻細(xì)胞密度。

(2) UV-B輻射對(duì)共培養(yǎng)海洋卡盾藻和青島大扁藻生長的影響： 共培養(yǎng)體系中設(shè)定海洋卡盾藻與青島大扁藻初始接種比例為Cm∶Ph=1∶3、1∶1、3∶1。青島大扁藻的初始接種密度保持為600cell/mL, 改變了海洋卡盾藻的初始細(xì)胞密度, 分別為 200、600、1800cell/mL, 以 2.16J/m2UV-B輻射劑量為處理組,以日光燈管照射為對(duì)照組, 每日定時(shí)輻照處理 1次,輻照方法與上相同, 計(jì)數(shù)96h時(shí)的藻細(xì)胞密度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進(jìn)行分析, 采用t檢驗(yàn)分析兩組間數(shù)據(jù)的差異顯著性, P＜0.05代表差異顯著,P＜0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單培養(yǎng)條件下海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長

單培養(yǎng)條件下, 不同初始密度的2種藻的生長曲線如圖1所示。結(jié)果顯示, 初始接種密度會(huì)影響2種藻的生長, 隨著初始接種密度的提高2種藻進(jìn)入指數(shù)生長期和靜止期的時(shí)間提前。海洋卡盾藻初始密度為1800cell/mL時(shí), 16d起海洋卡盾藻的細(xì)胞密度可達(dá)到赤潮密度(＞3×105cell/mL)(王朝暉等, 2010), 26d 時(shí)藻細(xì)胞密度已呈下降趨勢(shì), 進(jìn)入衰亡期。最終所達(dá)到的最大藻細(xì)胞密度也隨初始接種密度的升高而相應(yīng)提高, 海洋卡盾藻初始密度為200cell/mL時(shí)所能達(dá)到的最大藻細(xì)胞密度為 2.0×104cell/mL, 而初始密度為1800cell/mL時(shí)最大藻細(xì)胞密度可達(dá)到6.4×104cell/mL。

2.2 共培養(yǎng)條件下海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長

圖1 不同初始密度下單培養(yǎng)海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長曲線Fig.1 The growth curves of C. marina and P. helgolandica at different initial cell densities

圖2反映了不同初始生物量比下, 共培養(yǎng)海洋卡盾藻和青島大扁藻的種群增長情況。與單培養(yǎng)相比,青島大扁藻生長緩慢(圖2b), 均在14d之后才進(jìn)入指數(shù)生長期, 且青島大扁藻所能達(dá)到的最大種群密度隨著海洋卡盾藻初始密度的增加而降低, 分別為71.13×104、44.44×104、43.06×104cell/mL, 只有單培養(yǎng)時(shí)的89.05%、55.63%和53.91%, 22d之后, 初始生物量比 Cm：Ph=1：3實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度顯著高于其他兩組(P＜0.05)。初始生物量比為 Cm：Ph=1∶1(Ph=600cell/mL)時(shí), 8d之后, 除了 16d, 青島大扁藻的生長均受到海洋卡盾藻的顯著抑制(P＜0.05)。初始生物量比 Cm∶Ph=3∶1(Ph=600cell/mL)時(shí), 除了 6d,青島大扁藻的生長均受到海洋卡盾藻的極顯著抑制(P＜0.01)。由此可見, 共培養(yǎng)條件下, 海洋卡盾藻在2個(gè)高濃度下對(duì)青島大扁藻的生長產(chǎn)生顯著抑制作用(P＜0.05)。

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi), 海洋卡盾藻的藻細(xì)胞密度隨其初始密度的升高而升高(圖2a), 初始生物量比 Cm∶Ph=3∶1(Cm=1800cell/mL)的實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度顯著高于其他兩組(P＜0.05), 所能達(dá)到的最大種群密度也隨初始密度而增大。初始生物量比Cm∶Ph= 1∶3時(shí)(Cm=200cell/mL), 10d之后, 除了 16d,其生長受到青島大扁藻的顯著抑制(P＜0.05), 整個(gè)生長周期未呈現(xiàn)出明顯的生長曲線, 生長受到顯著影響, 所能達(dá)到的最大種群密度為 0.65×104cell/mL, 僅為單培養(yǎng)時(shí)的 32.5%。初始生物量比 Cm∶Ph=3∶1時(shí), 14d之后, 除了28d, 海洋卡盾藻的生長受到青島大扁藻的顯著抑制(P＜0.05), 海洋卡盾藻的生長曲線在8d之前呈指數(shù)增長, 8d到20d未呈現(xiàn)指數(shù)增長曲線, 20d之后到達(dá)平臺(tái)期, 所能達(dá)到的最大種群密度為4.39× 104cell/mL, 僅為單培養(yǎng)時(shí)的68.6%, 可見青島大扁藻也對(duì)海洋卡盾藻的生長產(chǎn)生了影響。

圖2 共培養(yǎng)條件下不同初始生物量比的海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長曲線Fig.2 The growth curves of C. marina and P. helgolandica in co-culture at different initial biomass ratios

2.3 海洋卡盾藻去藻過濾液和藻細(xì)胞裂解液對(duì)青島大扁藻生長的影響

圖3a為添加海洋卡盾藻去藻過濾液的青島大扁藻的生長曲線, 與對(duì)照組相比, 除了 2d的低濃度組外, 3個(gè)添加海洋卡盾藻去藻過濾液的處理組中青島大扁藻的生長均受到顯著抑制(P＜0.05), 對(duì)照組與添加 5.56、16.67和 50mL去藻過濾液的處理組在 10d時(shí)的比生長速率分別為0.309、0.284、0.273、0.247?？梢娞砑訛V液體積越大, 青島大扁藻受抑制效果越明顯, 濾液濃度最高的實(shí)驗(yàn)組在10d時(shí)青島大扁藻藻細(xì)胞密度比對(duì)照組低46.27%。

海洋卡盾藻藻細(xì)胞裂解液對(duì)青島大扁藻生長的影響與去藻過濾液類似(圖3b)。與對(duì)照組相比, 除了6d、10d的低濃度組和2d的中濃度組外, 3個(gè)添加海洋卡盾藻藻細(xì)胞裂解液的處理組中青島大扁藻的生長均受到顯著抑制(P＜0.05), 對(duì)照組與添加 5.56、16.67和50mL裂解液的處理組在10d時(shí)的比生長速率分別為 0.303、0.289、0.258、0.211。高濃度抑制效果更明顯, 添加裂解液比例最高的實(shí)驗(yàn)組中的青島大扁藻在10d時(shí)的藻細(xì)胞密度比對(duì)照組低60.12%,可見海洋卡盾藻藻細(xì)胞裂解液對(duì)青島大扁藻生長的抑制作用比去藻過濾液更顯著。

2.4 海洋卡盾藻和青島大扁藻間化感作用對(duì) UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng)

從圖4可以看出, 單培養(yǎng)條件下, 2.16J/m2UV-B輻射處理96h后, 海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長均受到抑制。UV-B輻射組藻細(xì)胞密度一直低于日光燈對(duì)照組, 且初始密度高的海洋卡盾藻和青島大扁藻實(shí)驗(yàn)組比初始密度低的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性,200cell/mL的海洋卡盾藻實(shí)驗(yàn)組和青島大扁藻實(shí)驗(yàn)組96h內(nèi)的生長均受到極顯著抑制(P＜0.01)。

共培養(yǎng)條件下(圖5), 經(jīng)過UV-B燈管輻射處理的兩種藻的生長亦均受到抑制。處理組藻細(xì)胞密度一直低于對(duì)照組, 其中1∶1實(shí)驗(yàn)組和3∶1實(shí)驗(yàn)組的海洋卡盾藻96h內(nèi)受到顯著抑制(P＜0.05), 1∶3實(shí)驗(yàn)組和1∶1實(shí)驗(yàn)組的青島大扁藻 96h內(nèi)受到顯著抑制(P＜0.05),96h時(shí), 1∶3、1∶1、3∶1實(shí)驗(yàn)組青島大扁藻的細(xì)胞密度只有對(duì)照組的 50.49%、40.11%、87.27%, 而單培養(yǎng)UV-B處理?xiàng)l件下, 96h時(shí)600cell/mL青島大扁藻實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度為對(duì)照組的 82.33%, 可見 1∶3和 1∶1實(shí)驗(yàn)組中, 海洋卡盾藻對(duì)青島大扁藻化感作用產(chǎn)生的影響較UV-B輻射明顯, 而3∶1實(shí)驗(yàn)組中,UV-B輻射處理下, 添加海洋卡盾藻共培養(yǎng)與青島大扁藻單培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異不大, 以上結(jié)果表明： UV-B輻射使海洋卡盾藻對(duì)青島大扁藻的化感作用減弱。

3 討論

3.1 影響海洋卡盾藻化感物質(zhì)產(chǎn)生和作用的因素

圖5 共培養(yǎng)海洋卡盾藻和青島大扁藻種群生長對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng)Fig.5 Effect of UV-B radiation on the growth of C. marina and P. helgolandica in the co-culture

藻類產(chǎn)生的化感物質(zhì)屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物, 包括肽聚糖、長鏈脂肪酸、有機(jī)酸和生物堿等(禚鵬基等,2007)。影響化感物質(zhì)產(chǎn)生和作用的因素包括營養(yǎng)鹽限制、光照、pH、生長時(shí)期、細(xì)胞濃度、種間相互影響等, 例如營養(yǎng)鹽水平不只影響化感物質(zhì)的產(chǎn)生,還會(huì)影響化感物質(zhì)對(duì)于目標(biāo)微藻的作用(禚鵬基等,2007); 生長時(shí)期方面亞歷山大藻屬(Alexandrium)在平臺(tái)期的化感作用比指數(shù)生長期要強(qiáng)(Arzul et al,1999), 而多鱗金色藻(Chrysochromulina polylepis)與之相反(Schmidt et al, 2001); 細(xì)胞濃度方面作用藻和目標(biāo)藻的細(xì)胞濃度高低都會(huì)對(duì)化感作用產(chǎn)生影響,產(chǎn)生化感物質(zhì)的作用藻的藻細(xì)胞密度越高, 產(chǎn)生的化感物質(zhì)濃度越高, 化感作用越明顯(Skovgaard et al,2003; Tillmann, 2003), 也有研究表明目標(biāo)藻濃度升高會(huì)使化感作用減弱(Tillmann, 2003), 因此本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中人為控制了營養(yǎng)鹽、光照、pH、生長時(shí)期和細(xì)胞濃度這5個(gè)因素排除其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

不同處理的海洋卡盾藻與青島大扁藻共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)體系中, 控制各實(shí)驗(yàn)組的光照、pH、營養(yǎng)鹽等資源競爭因素相同, 使用處于同一生長時(shí)期的微藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 且整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系使用無菌海水, 可以排除天然海水中細(xì)菌對(duì)微藻生長的影響。結(jié)果證明海洋卡盾藻藻液、去藻過濾液和藻細(xì)胞裂解液均能顯著抑制青島大扁藻的生長, 化感物質(zhì)的產(chǎn)生是海洋卡盾藻抑制青島大扁藻生長的主要原因, 且隨著海洋卡盾藻初始密度的升高, 共培養(yǎng)體系中存在的化感物質(zhì)增加,海洋卡盾藻對(duì)青島大扁藻的化感作用增強(qiáng), 有關(guān)海洋卡盾藻對(duì)有害赤潮藻鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum)化感作用的最新研究也表明, 海洋卡盾藻化感物質(zhì)的產(chǎn)生量與初始細(xì)胞密度成正比(Fernández-Herrera et al, 2016)。

3.2 海洋卡盾藻與青島大扁藻間化感作用的作用方式和途徑

化感作用主要通過2種途徑進(jìn)行, 一種是細(xì)胞間直接接觸抑制, 一種是通過分泌次生物質(zhì)產(chǎn)生抑制作用。實(shí)驗(yàn)方法上, 共培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生化感物質(zhì)的藻可以與目標(biāo)藻生活在同樣的理化條件下, 減少除化感作用外其他因素的影響, 同時(shí)可降低去藻過濾液母液制備過程中光合細(xì)菌可能對(duì)化感物質(zhì)產(chǎn)生的影響(Granéli et al, 2006)。

使用去藻過濾液可以研究分泌到水體中的化感物質(zhì), 不僅可避免藻細(xì)胞接觸的影響, 還可以消除兩種藻間營養(yǎng)鹽競爭帶來的干擾, 缺點(diǎn)是有些化感物質(zhì)不穩(wěn)定、易分解; 使用藻細(xì)胞裂解液可以研究藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的化感物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)種群的影響。本研究使用了去藻過濾液和藻細(xì)胞裂解液兩種方法研究兩種微藻間的化感作用從而判斷兩種作用方式中哪種起主要作用。

已有實(shí)驗(yàn)研究表明, 化感物質(zhì)可通過細(xì)胞間直接接觸傳遞至目標(biāo)細(xì)胞, 當(dāng)存在細(xì)胞接觸時(shí)化感作用一般更顯著, 例如赤潮異彎藻對(duì)其他微藻種群的抑制作用主要通過細(xì)胞間直接接觸實(shí)現(xiàn), 起抑制作用的部位位于細(xì)胞表面(Gross, 1999; Uchida et al,1999; Fernández-Herrera et al, 2016; 蔡恒江等, 2005a)。本實(shí)驗(yàn)亦證明海洋卡盾藻藻液和藻細(xì)胞裂解液對(duì)青島大扁藻生長的抑制作用比去藻過濾液顯著, 海洋卡盾藻釋放的可溶性化感物質(zhì)具有活性, 但海洋卡盾藻對(duì)青島大扁藻的化感作用主要通過細(xì)胞直接接觸實(shí)現(xiàn), 通過胞外物質(zhì)傳遞產(chǎn)生的化感作用不如前者顯著。這與鐘恢明等(2011)研究中肋骨條藻(Skeletonema costatum)與海洋原甲藻(Prorocentrum micans)種間關(guān)系的結(jié)果類似, 種間干擾可不需要介質(zhì)由細(xì)胞間直接接觸完成。雖然也有研究用去藻過濾液培養(yǎng)目標(biāo)藻并產(chǎn)生化感作用, 證明細(xì)胞間的直接接觸不是必需的, 但是有些藻分泌的化感物質(zhì)不穩(wěn)定、具半衰期, 不能充滿培養(yǎng)液, 化感作用因作用范圍有限需要靠細(xì)胞傳遞才能實(shí)現(xiàn)作用, 因此有些藻只能通過細(xì)胞接觸在細(xì)胞周圍產(chǎn)生化感作用(Gentien,2006)。但也有研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同, 徐艷紅等(2012)的研究表明海洋卡盾藻藻液和藻濾液對(duì)鹵蟲(Artemia sinica)均有毒性作用, 藻液對(duì)鹵蟲的毒性作用雖高于濾液, 但兩者之間的差距不明顯, 說明藻細(xì)胞胞內(nèi)合成并分泌于細(xì)胞表面或釋放到水體的有毒物質(zhì)可能是鹵蟲死亡的主要原因。

微藻化感作用會(huì)對(duì)目標(biāo)藻種的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)能力、細(xì)胞分裂、離子水分吸收、水分子平衡、新陳代謝、光合作用、呼吸作用、酶活性、信息傳遞和基因表達(dá)等各方面產(chǎn)生影響(Fernández-Herrera et al,2016; 冀曉青等, 2011), 引起目標(biāo)藻細(xì)胞消散、麻痹、生長抑制, 甚至死亡, 作用途徑包括： 對(duì)光合系統(tǒng)產(chǎn)生影響; 酶水解破壞細(xì)胞表面的細(xì)胞膜離子通道; 使細(xì)胞失去活動(dòng)能力; 產(chǎn)生具有潛在生長抑制作用的胞外產(chǎn)物; 藻體直接接觸影響等(禚鵬基等, 2007)。例如： 實(shí)球藻(Pandorina morum)濾液會(huì)抑制球團(tuán)藻(Volvox globator)的光合作用(Harris, 1970); 海洋卡盾藻可通過接觸信號(hào)引起鏈狀裸甲藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變, 例如失去鞭毛和運(yùn)動(dòng)能力、腫脹、失去帶和溝、細(xì)胞核突出、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞溶解等, 同時(shí)誘發(fā)暫時(shí)性孢囊, 化感物質(zhì)可抑制鏈狀裸甲藻生長并使其生活史發(fā)生變化(Fernández-Herrera et al, 2016)。赤潮微藻對(duì)餌料微藻的化感作用也需要更多深入研究以從機(jī)理方面進(jìn)行進(jìn)一步解釋。

3.3 海洋卡盾藻和青島大扁藻之間的化感作用對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)中, 單培養(yǎng)條件下, 2.16J/m2輻射劑量能極顯著抑制海洋卡盾藻和青島大扁藻的生長(P＜0.01),與蔡恒江等(2005b)的研究結(jié)果類似, 但有關(guān)UV-B輻射對(duì)微藻間化感作用影響的實(shí)驗(yàn)研究仍不多見, 有研究發(fā)現(xiàn)高劑量UV-B輻射(3.0J/m2)能使小珊瑚藻化感物質(zhì)的合成量或活性顯著降低, 低劑量UV-B輻射(0.9J/m2)使小珊瑚藻中化感物質(zhì)的合成量或活性顯著升高, 且UV-B作用并沒有使小珊瑚藻細(xì)胞間直接接觸的作用方式改變(周立明, 2008)。本實(shí)驗(yàn)中, 共培養(yǎng)條件下, 添加的 2.16J/m2UV-B輻射能通過影響海洋卡盾藻的生長抑制其對(duì)青島大扁藻的化感作用。

先前的研究表明, UV-B輻射具有較高能量, 能夠改變芳香族氨基酸的結(jié)構(gòu), 進(jìn)而改變陸生植物體內(nèi)多種蛋白質(zhì)的合成過程與功能(Sinha et al, 1998)。蔡恒江等(2005b)的研究證明, UV-B對(duì)海洋藻類具有相似的作用, 經(jīng)過 UV-B處理后, 海洋卡盾藻體內(nèi)化感物質(zhì)的合成和代謝可能已受到影響。趙妍等(2009)的研究表明, 高劑量 UV-B輻射(3.0J/m2)可能使小珊瑚藻體內(nèi)化感物質(zhì)的合成與代謝受阻, 而低劑量的UV-B輻射(0.9J/m2)則誘導(dǎo)和促進(jìn)化感物質(zhì)的合成。Jordan等(1992)通過探索指出, UV-B輻射能降低葉綠體內(nèi)與光合作用有關(guān)的編碼蛋白 mRNA的含量, 海洋卡盾藻化感物質(zhì)產(chǎn)生受UV-B輻射影響的作用機(jī)制可能與此類似。本實(shí)驗(yàn)中, UV-B輻射可能已致使海洋卡盾藻體內(nèi)化感物質(zhì)的合成與代謝受阻, 但其具體作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

(1) 海洋卡盾藻藻液、去藻過濾液和藻細(xì)胞裂解液均能顯著抑制青島大扁藻的生長, 其中細(xì)胞裂解液的抑制作用比去藻過濾液強(qiáng), 海洋卡盾藻對(duì)青島大扁藻產(chǎn)生化感作用, 兩種藻間通過細(xì)胞間直接接觸傳遞的化感物質(zhì)比通過介質(zhì)傳遞的多;

(2) 2.16J/m2UV-B輻射處理后, 兩種藻的生長均受到抑制, UV-B輻射會(huì)通過影響海洋卡盾藻的生長減弱其對(duì)青島大扁藻的化感作用。

馬 龍, 2008. 利用經(jīng)濟(jì)微藻的競爭作用防治米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)赤潮的初步研究. 青島： 中國海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文, 82—87

王 悠, 俞志明, 宋秀賢等, 2006. 大型海藻與赤潮微藻以及赤潮微藻之間的相互作用研究. 環(huán)境科學(xué), 27(2)：274—280

王朝暉, 袁美玲, 駱育敏等, 2010. 海洋卡盾藻與中肋骨條藻和錐狀斯氏藻種間競爭研究. 水生生物學(xué)報(bào), 34(2)：336—344

安鑫龍, 么 強(qiáng), 李雪梅, 2010. 赤潮微藻海洋卡盾藻研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 38(32)： 18281, 18283

楊翠云, 趙娜娜, 夏傳海等, 2011. 海洋卡盾藻無細(xì)胞濾液對(duì)赤潮微藻的作用及其與微藻的共培養(yǎng). 海洋環(huán)境科學(xué),30(6)： 798—803

張培玉, 唐學(xué)璽, 董雙林等, 2007. 塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)種間競爭及UV-B輻射脅迫對(duì)其影響. 海洋與湖沼, 38(2)： 187—192

張培玉, 唐學(xué)璽, 蔡恒江等, 2005. UV-B輻射增強(qiáng)對(duì)海洋大型藻與微型藻種群生長關(guān)系的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 25(12)：3335—3342

張德瑞, 鄭寶福, 唐志潔, 1964. 青島產(chǎn)扁藻及其形態(tài)變異.植物學(xué)報(bào), 12(1)： 109—118

周立明, 2008. 小珊瑚藻對(duì) 3種赤潮微藻的克生效應(yīng)對(duì) UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng)研究. 青島： 中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文,73—84

趙 妍, 于慶云, 周 斌等, 2009. 小珊瑚藻對(duì)赤潮異彎藻的克生效應(yīng)及其對(duì) UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng). 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),20(10)： 2558—2562

郝雯瑾, 王 悠, 唐學(xué)璽, 2008. 兩種海洋微藻——強(qiáng)壯前溝藻與青島大扁藻之間的相互作用研究. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 47(z1)： 98—105

鐘恢明, 張 健, 劉力章, 2011. 實(shí)驗(yàn)條件下原甲藻與中肋骨條藻種間相互作用研究. 江西科學(xué), 29(5)： 593—596, 677

洪 喻, 許 可, 2014. 微藻間競爭機(jī)制研究進(jìn)展. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 37(5)： 75—81

徐艷紅, 江 濤, 沈萍萍, 2012. 海洋卡盾藻對(duì)鹵蟲的急性毒性效應(yīng). 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 33(5)： 510—515

湛江水產(chǎn)專科學(xué)校, 1980. 海洋餌料生物培養(yǎng). 北京： 農(nóng)業(yè)出版社, 40—43

謝志浩, 俞泓伶, 曹魯妍, 2011. UV-B輻射對(duì)強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)和等鞭金藻(Isochrysis galbana)種間競爭的影響. 海洋與湖沼, 42(6)： 857—862

蔡恒江, 2004. UV-B輻射對(duì)大型-微型海藻相互作用的影響.青島： 中國海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文, 21—38

蔡恒江, 唐學(xué)璽, 張培玉等, 2005a. 不同起始密度對(duì)3種赤潮微藻種間競爭的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 25(6)： 1331—1336

蔡恒江, 唐學(xué)璽, 張培玉等, 2005b. uv-b輻射對(duì)青島大扁藻生長及其某些生理特性的影響. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 23(4)：460—465

禚鵬基, 趙衛(wèi)紅, 2007. 海洋微藻之間的化感作用研究進(jìn)展.海洋科學(xué)集刊, (48)： 114—126

潘遠(yuǎn)健, 金 剛, 代建國等, 2015. 杜氏鹽藻與 4種海洋微藻間的化感作用. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 14(3)： 47—53

冀曉青, 韓笑天, 白 潔, 2011. 微藻化感作用及化感物質(zhì)在赤潮演替中的作用. 海洋科學(xué), 35(2)： 92—98

Arzul G, Seguel M, Guzman L et al, 1999. Comparison of allelopathic properties in three toxic Alexandrium species.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,232(2)： 285—295

Fernández-Herrera L J, Band-Schmidt C J, López-Cortés D J et al,2016. Allelopathic effect of Chattonella marina var. marina(Raphidophyceae) on Gymnodinium catenatum (Dinophycea).Harmful Algae, 51： 1—9

Gentien P, 2006. Allelopathy in Karenia mikimotoi： a case study.In： Abstracts, 12th International Conference on Harmful Algae. Copenhagen, Denmark, 49

Granéli E, Hansen P J, 2006. Allelopathy in harmful algae： a mechanism to compete for resources. In： Granéli E, Turner J T eds. Ecology of Harmful Algae. Berlin, Heidelberg：Springer Press, 189—201

Gross E, 1999. Allelopathy in benthic and littoral areas： case studies on allelochemicals from benthic cyanobacteria and submersed macrophytes. In： Inderjit KM, Dakshini M, Foy CL eds. Principles and Practices in Plant Ecology：Allelochemical Interactions. Boca Raton： CRC Press LLC,179—199

Guillard R R L, 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In： Smith W L, Chanley M H eds.Culture of Marine Invertebrate Animals. New York, USA：Springer Press, 29—60

Harris D O, 1970. Growth inhibitors produced by the green algae(Volvocaceae). Archiv für Mikrobiologie, 76(1)： 47—50

Inderjit, Dakshini K M M, 1994. Algal allelopathy. The Botanical Review, 60(2)： 182—196

Jordan B R, He J, Chow W S et al, 1992. Changes in mRNA levels and polypeptide subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase in response to supplementary ultraviolet-B radiation. Plant, Cell & Environment, 15(1)：91—98

Legrand C, Rengefors K, Fistarol G O et al, 2003. Allelopathy in phytoplankton-biochemical, ecological and evolutionary aspects. Phycologia, 42(4)： 406—419

Marshall J A, Hallegraeff G M, 1999. Comparative ecophysiology of the harmful alga Chattonella marina(Raphidophyceae) form South Australian and Japanese waters. Journal of Plankton Research, 21(10)： 1809—1822

Schmidt L E, Hansen P J, 2001. Allelopathy in the prymnesiophyte Chrysochromulina polylepis： effect of cell concentration, growth phase and pH. Inter-Research Marine Ecology Progress Series, 216： 67—81

Sinha R P, Hader D P, 1998. Effects of ultravjolet-B radiation in three rice field cyanobacteria. Journal of Plant Physiology,153(5—6)： 763—769

Skovgaard A, Hansen P J, 2003. Food uptake in the harmful alga Prymnesium parvum mediated by excreted toxins.Limnology and Oceanography, 48(3)： 1161—1166

Tevini M, Teramura A H, 1989. UV-B effects on terrestrial plants.Photochemistry and Photobiology, 50(4)： 479—487

Tillmann U, 2003. Kill and eat your predator： a winning strategy of the planktonic flagellate Prymnesium parvum. Inter-Research Aquatic Microbial Ecology, 32(1)： 73—84

Uchida T, Toda S, Matsuyama Y et al, 1999. Interactions between the red tide dinoflagellates Heterocapsa circularisquama and Gymnodinium mikimotoi in laboratory culture. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 241(2)：285—299