李大鵬 鄧海臨 李 慧 詹冬梅

(1. 山東省海洋生物研究院 青島 266104; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002;3. 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 溫州 325000)

氮是細胞中蛋白質(zhì)的主要組成成分, 是藻類生長繁殖必需的主要營養(yǎng)元素之一。氮在海水中的形態(tài)較多, 包括無機氮(NO3-、NO2-、NH4+)和有機氮(PON、DON), 此外還存在氣態(tài)的N2、N2O、NH3, 其中NO3--N和 NH4+-N是海藻生長繁殖所利用的主要氮源。海藻對NO3--N和NH4+-N的吸收也各不相同。NH4+-N的吸收在正常條件下大于 NO3--N的吸收, 這是因為藻類吸收NO3--N消耗較多的能量(Raven, 1984), NO3--N在結(jié)合入氨基酸之前必須被還原成NH4+-N (Lobban et al,1994)。因此對潮間帶藻類來說, 在冬天光照不足的情況下, 藻類傾向于吸收NH4+-N; 而在夏天光照充足時,同時吸收NO3--N和NH4+-N (Phillips et al, 2003)。

在裙帶菜人工育苗過程中, 多采用半封閉的循環(huán)流動海水或靜水培養(yǎng), 水量有限, 主要營養(yǎng)鹽類含量低, 不能滿足裙帶菜配子體生長的需要。為了促進配子體正常生長, 均采用在自然海水中添加肥料的辦法, 加以補充。裙帶菜單倍體育苗技術(shù)作為新興的育苗生產(chǎn)技術(shù), 其潛在的應(yīng)用前景和技術(shù)上的優(yōu)勢,越來越受到人們的重視(Kaas et al, 1989; Pang et al,1997), 單倍體的快速豐富培養(yǎng)是這項技術(shù)實施的重要前提。本文通過在不同濃度NO3--N和NH4+-N下培養(yǎng)裙帶菜配子體, 測定各自的生長狀況, 從而找出配子體豐富培養(yǎng)合適的氮源及濃度。同時測定其對NO3--N和 NH4+-N的吸收速率, 揭示裙帶菜配子體材料在豐富培養(yǎng)過程中對氮離子的吸收規(guī)律, 最大程度的調(diào)整豐富培養(yǎng)技術(shù)方法, 使氮的供給適時的滿足配子體生長的需要。以期為裙帶菜的人工育苗和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 裙帶菜配子體的預(yù)培養(yǎng) 裙帶菜配子體由中國科學(xué)院海洋研究所海藻種質(zhì)庫提供。雌雄配子體按1 ： 1比例混合。經(jīng)豐富培養(yǎng)后的配子體經(jīng)組織搗碎機搗碎, 使其呈 4—8細胞狀態(tài), 用消毒海水反復(fù)沖洗, 加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 1d后, 更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 每日在顯微鏡下鏡檢, 大約 2—3d后發(fā)出新枝后方可使用(李大鵬等, 2006)。

1.1.2 裙帶菜配子體饑餓處理 取上述處理的配子體培養(yǎng)于5L的三角瓶中, 加入無氮的PES培養(yǎng)液培養(yǎng)4d, 使配子體處于氮饑餓狀態(tài), 避免自身排出的氮影響實驗結(jié)果。培養(yǎng)條件為： 溫度23℃, 光強60μE/(m2·s), 光周期 12h ： 12 h, 充氣培養(yǎng)。

1.1.3 裙帶菜配子體快速培養(yǎng)的最適氮源及濃度設(shè)置一系列氮濃度梯度(5、10、20、30μmol/L), 不同氮源(NO3--N和NH4+-N)的PES培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件同上,培養(yǎng)密度為1g/L。加入配子體后隔天分析一次, 實驗進行 8d, 以配子體的鮮重增加量作為生長速度的指標(biāo), 并鏡檢比較不同氮源及氮濃度下配子體的生長狀態(tài)。

1.1.4 氮的吸收與配子體鮮重增長的關(guān)系 氮的初始濃度為 30μmol/L, 加入配子體后 1h取樣分析,以后隔天分析一次, 每天定時測定穿透光強的變化,以消光值的變化作為生長速度的指標(biāo)。

1.1.5 NO3--N和NH4+-N的吸收規(guī)律及兩者之間的相互影響 設(shè)置不同濃度氮源, NO3--N濃度分別為5、10、20、25、30μmol/L, NH4+-N 濃度為 30、25、20、10、5μmol/L, 每組設(shè)3個重復(fù)。

表1 實驗組NO-3-N和NH+4-N不同濃度配置(μmol/L)Tab.1 Concentration setting for NO-3-N and NH+4-N in the experiment

1.2 實驗方法

稱取 0.75g(鮮重)饑餓處理的裙帶菜配子體放入盛有750mL上述實驗組培養(yǎng)液的1L三角燒瓶中培養(yǎng),實驗條件： 溫度23, ℃光強60μE/(m2·s), 光周期12h ：12h, 充氣培養(yǎng)。實驗分別用紫外分光光度法和次溴酸鹽氧化法測定水樣中的NO3--N和NH4+-N濃度, 后每小時測一次, 共測4h, 每個水樣測3次。

1.2.1 配子體鮮重測定 培養(yǎng)結(jié)束后用篩絹將藻過濾出, 在天平上測量藻重, 以便在不同氮濃度梯度之間進行比較。

1.2.2 配子體鮮重平均日增長率的計算

1.2.3 氮吸收速率的計算

吸收速率的計算公式如下

式中,R為吸收速率(μmol/(g·h));Ci和Cf分別為實驗前后培養(yǎng)液中NO3--N和NH4+-N的濃度(μmol/L);V為培養(yǎng)液體積(L);t為取樣時間間隔(h);W為配子體重量(g)。

1.2.4 NO3--N濃度的測定 NO3--N的測定采用紫外分光光度法, 此方法的原理是硝酸鹽在紫外光區(qū)220nm處會出現(xiàn)一個特征吸收峰, 通過測定其吸光度,利用制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)公式, 可以得到硝酸鹽在水樣中的濃度(Colloset al, 1999)。具體步驟如下：

1) 取25mL具塞比色管, 蒸餾水潤洗2次, 加入預(yù)處理后的水樣10mL;

2) 將比色皿用蒸餾水潤洗2—3次后, 水樣倒入比色皿中, 體積超過比色皿的2/3, 潤洗2—3次。濾紙吸干比色皿外壁的水, 用擦鏡紙將比色皿光滑的兩外壁擦干凈, 放入紫外可見分光光度計中測定溶液在220nm和275nm光波處的吸光度值。每次測完一個樣后, 均應(yīng)用蒸餾水潤洗和水樣潤洗 2—3次后才能測樣;

3) 根據(jù) NO3--N 標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 1), 計算出樣品中NO3--N的濃度。

圖1 硝態(tài)氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of NO-3-N

1.2.5 NH4+-N濃度的測定 次溴酸鈉法測 NH4+-N濃度的原理為： 在堿性條件下, 次溴酸鈉將水樣中的氨定量氧化為亞硝酸鹽, 亞硝酸鹽在酸性條件下, 與磺胺進行重氮化反應(yīng), 生成的物質(zhì)再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色偶氮染料, 在 543nm波長測定吸光值, 對照標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計算出 NH4+-N濃度(GB/T 12763.4-2007海洋調(diào)查規(guī)范)。

具體步驟如下：

1) 抽取待測水樣 10mL(如果濃度超過本方法的測定范圍, 則采用稀釋的方法, 將其濃度調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)姆秶?, 加入50mL具塞磨口錐形瓶中;

2) 加入 1mL的次溴酸鈉溶液, 混勻, 放置30min;

3) 加入1mL 2g/L的磺胺溶液, 混勻, 放置5min;

4) 加入 0.2mL 1.0g/L的鹽酸蔡乙二胺溶液, 混勻, 放置15min;

5) 選543nm波長, 測定吸光值;

6) 對照 NH4+-N的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 2), 計算出待測液的氨態(tài)氮濃度。

2 結(jié)果與討論

從表2可以看出, 在氮濃度為30μmol/L下, 配子體生長速度最快, 無論是硝態(tài)氮或氨態(tài)氮, 兩者相差不大, 平均日生長率分別為 24.39%和 25.03%。但是由于配子體生長迅速, 培養(yǎng) 9d之后, 配子體出現(xiàn)了纏繞聚團現(xiàn)象, 對后面的生長有一定的影響。觀察各個濃度下硝態(tài)氮培養(yǎng)的配子體與氨態(tài)氮培養(yǎng)的配子體形態(tài)個體并無差異, 生長狀況也相似, 這說明裙帶菜配子體能同時吸收利用硝態(tài)氮和氨態(tài)氮, 進行生理代謝, 進行快速擴增。

圖2 氨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of NH4+-N

表2 氨態(tài)氮硝態(tài)氮濃度對裙帶菜配子體培養(yǎng)的影響Tab.2 Effect of concentration of NH+4-N and NO-3-N on U. pinnatifida gametophyte culture

圖3 NO-3-N 5μmol/L; NH+4-N 25μmol/L

裙帶菜配子體培養(yǎng)液中硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的濃度隨著時間的推移, 濃度逐漸降低(圖3—圖8); 并且裙帶菜配子體在前4h內(nèi)吸收氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的速率也各不相同(圖 9—圖 14)?？偟膩碚f, 裙帶菜配子體在第一個小時內(nèi)氮吸收速率高于其它任何時間段。另外在六組樣品中, 最高吸收速率為 24.3μmol/(g·h), 對硝態(tài)氮的平均吸收速率為 1.04—6.51μmol/(g·h), 對氨態(tài)氮的平均吸收速率為0.69—6.61μmol/(g·h)。

圖 4 NO-3-N 10μmol/L; NH+4-N 20μmol/L

圖3—6 在不同的NO-3-N和NH+4-N濃度組合下, 培養(yǎng)液中兩種氮源濃度隨時間的變化Fig.3—6 Temporal change in concentration of two nitrogen sources of NO-3-N and NH+4-N

圖7—8 在 30μmol/L的NO-3-N和NH+4-N濃度下, 培養(yǎng)液中兩種氮源濃度隨時間的變化Fig.7—8 Temporal change in concentration at 30μmol/L of two nitrogen sources of NO-3-N and NH+4-N

在本研究中, 并沒有發(fā)現(xiàn)裙帶菜對硝態(tài)氮的吸收抑制氨態(tài)氮的吸收, 或者氨態(tài)氮的吸收抑制硝態(tài)氮的吸收。裙帶菜配子體同時吸收氨態(tài)氮和硝態(tài)氮。并且第一小時內(nèi)的吸收速率隨著氮濃度的增加而加快(圖 15)。

圖 9 NO3--N 5μmol/L; NH4+-N 25μmol/L

3 討論

圖 10 NO3--N 10μmol/L; NH4+-N 20μmol/L

圖9—12 在不同的NO-3-N和NH+4-N濃度組合下, 裙帶菜配子體對兩種氮源的吸收速率隨時間的變化Fig.9—12 Temporal change of ammonium and nitrate uptake rates in Undaria pinnatifida gametophyte in combination of different concentrations of NO-3-N and NH+4-N

圖 13—14 在 30μmol/L的 NO-3-N和NH+4-N濃度下, 裙帶菜配子體對兩種氮源的吸收速率隨時間的變化Fig.13—14 Temporal change of ammonium and nitrate uptake rates in Undaria pinnatifida gametophyte at 30μmol/L concentration of NO-3-N and NH+4-N

圖15 相同氮濃度下, 氨態(tài)氮吸收速率與硝態(tài)氮吸收速率比較Tab.15 Com-parison in absorption rate between NH+4-N and NO3-N at a same nitrogen concentration

氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要成分, 占蛋白質(zhì)含量的16%—18%, 而在海藻的細胞質(zhì)、細胞核及酶中都含有蛋白質(zhì), 因此, 氮也是細胞質(zhì)、細胞核和酶的重要組成成分。此外, 核酸、輔酶、磷脂、葉綠素等化合物中都含有氮, 同時某些植物激素、維生素和生物堿等也含有氮。由此可見, 氮在海藻生命活動中占有首要的地位。由于氮元素是裙帶菜配子體細胞生長、繁殖的必要元素, 氮的存在形式和濃度對裙帶菜配子體的生長產(chǎn)生一定的影響。

研究結(jié)果顯示, 無論是硝態(tài)氮還是氨態(tài)氮, 只要濃度滿足裙帶菜配子體的需求, 都能促使其生長良好, 這與有些藻類不同。鄧祥元(2009)的研究顯示,氨態(tài)氮對海帶配子體的生長具有抑制作用, 究其原因, 可能由于氨態(tài)氮是一種抑制氮素固定的含氮化合物, 影響海帶配子體的生長。但是在實驗室培養(yǎng)海帶孢子體時, 孢子體又可以吸收氨態(tài)氮, 維持其正常生長, 濃度為 30μmol/L的氮就能使裙帶菜配子體快速擴增, 其日生長率達到25%左右。這樣看來, 無論是硝態(tài)氮還是氨態(tài)氮都可以用于裙帶菜配子體快速擴增的氮源。

研究發(fā)現(xiàn), 裙帶菜配子體同時吸收氨態(tài)氮和硝態(tài)氮, 并且對兩種氮的吸收速率基本相同(圖 15), 氨態(tài)氮的吸收速率略微高一些。這與海囊藻相似,Harrison等(1986)發(fā)現(xiàn)海囊藻能夠同時利用氨態(tài)氮和硝態(tài)氮, 氮的吸收速率也基本相同。一種巴西海藻Laminaria abyssalis的配子體, 能夠同時吸收硝態(tài)氮和氨態(tài)氮, 但是對氨態(tài)氮的吸收速率快于硝態(tài)氮(dā Costa Braga et al, 1996)。Thomas等(1987)和 Harrison(1986)的研究顯示, 同時吸收氨態(tài)氮和硝態(tài)氮有助于單位時間內(nèi)獲取更大量的氮源。

總之, 氮吸收速率與培養(yǎng)液中氮的濃度在一定范圍內(nèi)呈一定的線性關(guān)系(圖15)。在培養(yǎng)的第一小時內(nèi)氮濃度迅速下降, 最大吸收速率分別為24.3μmol/(g·h)和 20.73μmol/(g·h), 推測這是主要是因為藻體經(jīng)過饑餓處理, 一接觸氮源主動運輸和擴散運動的共同進行的結(jié)果。

我們的研究并沒有發(fā)現(xiàn)氨態(tài)氮的吸收抑制硝態(tài)氮的吸收, 或者硝態(tài)氮的吸收抑制氨態(tài)氮吸收。這與Harlin等(1978)在Laminaria longicruris的研究結(jié)果相似, 與L. greonlandica中的情況不同, 它對硝態(tài)氮的吸收受到氨態(tài)氮抑制(Harrison et al, 1986)。同樣,Hanisak等(1978)的研究也發(fā)現(xiàn), 在綠色大型海藻刺松藻中硝態(tài)氮的吸收受到10倍濃度氨態(tài)氮的抑制。

我們對裙帶菜配子體氨態(tài)氮硝態(tài)氮的吸收做了研究, 結(jié)果顯示裙帶菜配子體對兩種氮源的吸收沒有選擇性, 同時吸收兩種氮源, 氨態(tài)氮的吸收略微快于硝態(tài)氮, 與先前其它藻類研究結(jié)果類似(Lobban et al, 1994)。30μmol/L的氮源既可以很好地滿足配子體快速擴增的營養(yǎng)需求, 需要注意的是過高濃度的氮對配子體具有毒害作用。這可能是因為氨氧化磷酸化和光合磷酸化的解偶聯(lián)劑能一直進行光合作用, 而且當(dāng)細胞內(nèi)銨離子大量積累時還會造成 NADH的大量消耗, 使能量供應(yīng)受阻, 進而中斷三羧酸循環(huán), 最終導(dǎo)致配子體變白死亡。在其它海藻中也發(fā)現(xiàn)了銨離子抑制生長和光合作用的現(xiàn)象。Thomas等(1980)研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)銨離子濃度大于 0.1mmol/L時, 溝鞭藻(dinoflagellates)的生長和光合作用受到明顯的抑制;另外, Bates等(1993)報道, 當(dāng)銨離子濃度大于0.11mmol/L時, 將會嚴(yán)重影響硅藻Nitzschia pungens的生長和光合作用; 更有甚者, 當(dāng)銨離子作為唯一氮源, 濃度在 3—220μmol/L時, 即可使一些藻類在幾周的時間內(nèi)死亡(Touchette et al, 2000)。此外, 配子體經(jīng)多次分裂后, 形成多分枝的絲狀體。如果培養(yǎng)液中這樣的絲狀體過多, 它們之間就會相互纏繞, 彼此爭奪養(yǎng)分, 遮擋光線。在實驗過程中, 當(dāng)克隆被培養(yǎng)至第 15天左右時, 消光值有明顯的下降。這是由于藻絲相互纏繞造成穿透光強的增高。在進行藻體代謝產(chǎn)物對裙帶菜雄配子體生長的影響的實驗時也發(fā)現(xiàn),克隆密度高的情況下, 生長速度會有所下降。因此在培養(yǎng)時應(yīng)該注意及時分瓶擴養(yǎng)。

鄧祥元, 2009. 轉(zhuǎn)基因海帶配子體的制備與高效增值. 青島：中國科學(xué)院海洋研究所碩士學(xué)位論文, 98—105

李大鵬, 李文茹, 2006. 裙帶菜配子體發(fā)育過程的研究. 海洋與湖沼, 37(S)： 237—242

Bates S S, Worms J, Smith J C, 1993. Effects of ammonium and nitrate on growth and domoic acid production by Nitzschia pungens in batch culture. Can J Fish Aquat Sci, 50(6)：1248—1254

Collos Y, Mornet F, Sciandra A et al, 1999. An optical method for the rapid measurement of micromolar concentrations of nitrate in marine phytoplankton cultures. J Appl Phycol,11(2)： 179—184

dā Costa Braga A, Yoneshigue-Valentine Y, 1996. Nitrogen and phosphorus uptake by the Brazilian kelp Laminaria abyssalis (Phaeophyta) in culture. Hydrobiologia, 326—327(1)： 445—450

Hanisak M D, Harlin M M, 1978. Uptake of inorganic nitrogen by Codium fragile subsp. tomentosoides (Chlorophyta). J Phycol, 14(4)： 450—454

Harlin M M, Craigie J S, 1978. Nitrate uptake by Laminaria longicruris (Phaeophyceae). J Phycol, 14(4)： 464—467

Harrison P J, Druehl L D, Lloyd K E et al, 1986. Nitrogen uptake kinetics in three year-classes of Laminaria groenlandica(Laminariales： Phaeophyta). Mar Biol, 93(1)： 29—35

Kaas R, Perez R, 1989. Study of the intensive culture of Undaria on the coast of Brittany. outdoor seaweed cultivation. In：The Proceedings of the Second Workshop of COST 48 Subgroup. Brussels： European Economic Community, 1：31—33

Lobban C S, Harrison P J, 1994. Seaweed Ecology and Physiology. Cambridge, London： Cambridge University Press, 163—209

Pang S J, Hu X Y, Wu C Y et al, 1997. Intraspecific crossings of Undaria pinnatifida (Harv.) Sur.-a possible time-saving way of strain selection. China J Oceanol Limnol, 15(3)：227—235

Phillips J C, Hurd C L, 2003. Nitrogen ecophysiology of intertidal seaweeds from New Zealand： N uptake, storage and utilisation in relation to shore position and season. Mar Ecol Prog Ser, 264： 31—48

Raven J A, 1984. Energetics and Transport in Aquatic Plants.New York： AR Liss, 587

Thomas T E, Harrison P J, 1987. Rapid ammonium uptake and nitrogen interactions in five intertidal seaweeds grown under field conditions. J Exp Mar Biol Ecol, 107(1)： 1—8

Thomas W H, Hastings J, Fujita M, 1980. Ammonium input to the sea via large sewage outfalls-Part 2： effects of ammonium on growth and photosynthesis of southern California phytoplankton cultures. Mar Environ Res, 3(4)：291—296

Touchette B W, Burkholder J M, 2000. Review of nitrogen and phosphorus metabolism in seagrasses. J Exp Mar Biol Ecol,250(1—2)： 133—167