張喜昌，趙寧寧，劉劍波，冷曉飛，王發(fā)盛

(大連海寶漁業(yè)有限公司，遼寧 大連 116045)

海帶(Saccharinajaponica)位居我國(guó)三大經(jīng)濟(jì)海藻之首，2020年全國(guó)海帶年產(chǎn)量約為165.16×104t[1]。海帶苗種生產(chǎn)目前采用兩種方法：孢子體育苗法和配子體育苗法。孢子體育苗法在海帶育苗生產(chǎn)中被普遍使用，且大大促進(jìn)了我國(guó)海帶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但孢子體采苗技術(shù)存在大量海帶藻體植株作為親本培育苗種易導(dǎo)致種質(zhì)退化、苗種培育受季節(jié)嚴(yán)格限制、育苗生產(chǎn)期較長(zhǎng)、制冷成本高等不足[2]。配子體育苗法的親本種質(zhì)單一純凈，且不受季節(jié)限制[3]，可有效避免孢子體采苗法的不足，但存在一個(gè)較大技術(shù)問(wèn)題，即配子體苗種容易受敵害生物底棲硅藻污染，導(dǎo)致苗種質(zhì)量下降。因此，目前配子體育苗法在條件易控的試驗(yàn)研究中應(yīng)用較多，在海帶育苗生產(chǎn)中應(yīng)用較少。

海帶配子體育苗分為兩個(gè)大的階段：一是配子體擴(kuò)增培養(yǎng)階段，二是配子體苗種培育階段。針對(duì)配子體擴(kuò)增培養(yǎng)條件已有較多的研究，包括光照強(qiáng)度和光照周期[4-6]、溫度[7-12]、培育水體的消毒方式[13]等，目前配子體擴(kuò)增培養(yǎng)的技術(shù)已較為成熟，可有效保障配子體育苗生產(chǎn)。而對(duì)配子體苗種培育階段的研究相對(duì)較少。張壯志等[14]研究了二次育苗對(duì)海帶配子體苗種質(zhì)量的影響，而對(duì)敵害生物底棲硅藻污染防治的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。底棲硅藻污染問(wèn)題在海帶孢子體育苗生產(chǎn)中同樣存在，但海帶種菜釋放的游孢子可以牢固黏附到苗種繩上，并逐步發(fā)育成胚孢子、配子體、幼孢子體，期間可通過(guò)涮簾、沖簾等方法防治底棲硅藻污染，底棲硅藻對(duì)海帶幼體危害不大。而在配子體育苗中，海帶配子體小段通過(guò)沉降作用附著在苗種簾上，當(dāng)受到擾動(dòng)時(shí)很容易脫落，因此從配子體潑池到幼孢子體扎根于苗種繩內(nèi)之前的這段時(shí)間，不能夠通過(guò)常規(guī)的涮簾、沖簾等方法防治底棲硅藻污染；期間底棲硅藻會(huì)在苗種簾上大量附著繁生，與海帶的配子體和幼孢子體競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)空間，甚至附著、覆蓋到海帶幼體上而使其受到危害，導(dǎo)致缺苗脫苗，影響苗種質(zhì)量。

在海帶配子體育苗生產(chǎn)中，配子體潑池大約7 d后開(kāi)始陸續(xù)發(fā)育成幼孢子體，9～10 d約90%的配子體發(fā)育成孢子體。如果在潑池前將海帶配子體于滅菌海水中進(jìn)行雌雄混合，并進(jìn)行預(yù)發(fā)育，則可使配子體潑池后迅速發(fā)育成孢子體，從而在與底棲硅藻的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，抑制底棲硅藻的生長(zhǎng)。同時(shí)海帶配子體提早發(fā)育成孢子體后，其能更快扎根苗種繩并附著牢固，繼而可以通過(guò)沖簾、涮簾的方法防治底棲硅藻。因此海帶配子體預(yù)發(fā)育技術(shù)可能可以有效解決底棲硅藻污染問(wèn)題。

海帶配子體預(yù)發(fā)育與配子體擴(kuò)增培養(yǎng)盡管都是培育配子體，但配子體擴(kuò)增培養(yǎng)的目的是讓配子體生長(zhǎng)、增加配子體生物量、雌雄單獨(dú)培養(yǎng)。而海帶配子體預(yù)發(fā)育是在配子體擴(kuò)增培養(yǎng)后，當(dāng)生物量達(dá)到生產(chǎn)需求時(shí)，再讓配子體進(jìn)行生殖發(fā)育。為進(jìn)一步提高生殖發(fā)育效果，將雌雄配子體混合培養(yǎng)。因此，配子體預(yù)發(fā)育的條件不能簡(jiǎn)單套用配子體擴(kuò)增培養(yǎng)的條件，必須進(jìn)行試驗(yàn)探索。本文研究海帶配子體預(yù)發(fā)育的適宜光照強(qiáng)度和密度條件及預(yù)發(fā)育的適宜程度，為海帶配子體預(yù)發(fā)育技術(shù)在配子體育苗生產(chǎn)中應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 海帶配子體

海帶配子體來(lái)自大連海寶漁業(yè)有限公司種質(zhì)庫(kù)，為經(jīng)過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)后約300 μm長(zhǎng)、呈絲須狀的“中寶1號(hào)”配子體。

1.2 不同光照強(qiáng)度對(duì)海帶配子體預(yù)發(fā)育的影響

用煮沸海水[15]分別配制10.0 mg·L-1NaNO3-N和2.0 mg·L-1KH2PO4-P的培養(yǎng)液。取無(wú)水鮮海帶雌、雄配子體各30.0 g，加入低溫培養(yǎng)液，在不高于15℃條件下，用組織破碎機(jī)切割至1～6細(xì)胞，雌雄混勻后，均分成12份，分別轉(zhuǎn)移到12個(gè)500 mL錐形瓶中，往錐形瓶中加培養(yǎng)液至500 mL，使每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)配子體密度為10.0 g·L-1。設(shè)置光照強(qiáng)度梯度25.0、37.5、50.0、62.5 μmol·m-2s-1，每個(gè)光照條件設(shè)置3個(gè)500 mL錐形瓶。在光周期12 L∶12 D、溫度(13±1)℃條件下充氣培養(yǎng)。每日用移液槍從每個(gè)錐形瓶中取樣至載玻片，在200倍顯微鏡下分別觀(guān)察100個(gè)雌、雄配子體發(fā)育情況。發(fā)育情況考察指標(biāo)為雌配子體發(fā)育率、排卵率和雄配子體精囊形成率，若觀(guān)察到雌配子體小段中有變粗的細(xì)胞即視為該配子體小段為發(fā)育的配子體。

1.3 不同培育密度對(duì)海帶配子體預(yù)發(fā)育的影響

取無(wú)水鮮海帶雌、雄配子體各37.5 g，按照1.2中的方法切割、混合。按照1∶2∶3∶4的比例分成4份，每份均分到3個(gè)500 mL錐形瓶中，并加培養(yǎng)液至500 mL，形成配子體密度為5.0、10.0、15.0、20.0 g·L-1四個(gè)組。在光周期12 L∶12 D、室溫(13±1)℃、光照強(qiáng)度37.5 μmol·m-2s-1條件下充氣培養(yǎng)。配子體發(fā)育情況觀(guān)察同1.2。

1.4 預(yù)發(fā)育程度對(duì)出苗的影響

取無(wú)水鮮海帶雌、雄配子體各7.5 g，按照1.2中的方法切割、混合后，均分成3份，分別轉(zhuǎn)入500 mL三角燒瓶中，加培養(yǎng)液至500 mL預(yù)發(fā)育，每瓶中配子體濃度為10.0 g·L-1。預(yù)發(fā)育條件及觀(guān)察同1.3。預(yù)發(fā)育開(kāi)始前(0 d，即未預(yù)發(fā)育的海帶配子體作為對(duì)照組)及預(yù)發(fā)育后每日從每個(gè)三角燒瓶中取樣進(jìn)行出苗測(cè)試：用移液槍取1 mL配子體液，轉(zhuǎn)移到9 cm培養(yǎng)皿中，加入15 mL培養(yǎng)液，晃勻，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在光周期12 L∶12 D、室溫(13±1)℃、光照強(qiáng)度12.5 μmol·m-2s-1條件下培養(yǎng)，每日觀(guān)察配子體發(fā)育情況和孢子體形成率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方法

雌配子體發(fā)育率=發(fā)育變粗的雌配子體小段數(shù)/雌配子體小段總數(shù)×100%

排卵率=排卵的雌配子體小段數(shù)/雌配子體小段總數(shù)×100%

精囊形成率= 出精囊的雄配子體小段數(shù)/雄配子體小段總數(shù)×100%

孢子體形成率=形成孢子體的雌配子體小段數(shù)/雌配子體小段總數(shù)×100%

用SPSS 23.0 分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并作方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照強(qiáng)度對(duì)海帶配子體生殖發(fā)育的影響

海帶配子體預(yù)發(fā)育過(guò)程中，不同光照強(qiáng)度對(duì)雌配子體生殖發(fā)育率的影響見(jiàn)表1。25.0 μmol·m-2s-1光照組預(yù)發(fā)育3 d觀(guān)察到有雌配子體變粗，進(jìn)行生殖發(fā)育，之后變粗雌配子體逐漸增多，17 d所有雌配子體均變粗。37.5 μmol·m-2s-1光照組預(yù)發(fā)育至2 d有雌配子體變粗，15 d所有雌配子體均變粗。50.0 μmol·m-2s-1和62.5 μmol·m-2s-1光照組預(yù)發(fā)育1 d即可觀(guān)察到有雌配子體變粗，之后變粗的雌配子體逐漸增多，14 d兩個(gè)光照組所有雌配子體均變粗。在25.0～62.5 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，海帶雌配子體均可發(fā)育，光照強(qiáng)度越大，雌配子體變粗越早越快，達(dá)到100.0%生殖發(fā)育的時(shí)間越短。但當(dāng)預(yù)發(fā)育1 d時(shí)，不同光照強(qiáng)度組之間雌配子體變粗比例差異不顯著，預(yù)發(fā)育2～16 d期間，光照強(qiáng)度37.5 μmol·m-2s-1以上組雌配子體變粗比例顯著高于光照強(qiáng)度25.0 μmol·m-2s-1組，但光照強(qiáng)度37.5 μmol·m-2s-1以上各組之間差異不顯著。

表1 海帶雌配子體在不同光照強(qiáng)度下發(fā)育率

不同光照強(qiáng)度對(duì)雌配子體排卵率的影響見(jiàn)表2。25.0 μmol·m-2s-1光照組預(yù)發(fā)育13 d觀(guān)察到有雌配子體排卵，之后排卵量逐漸增多；17 d雌配子體排卵比率為(26.0±4.6)%。光照強(qiáng)度37.5 μmol·m-2s-1以上各組均預(yù)發(fā)育至11 d開(kāi)始排卵；當(dāng)預(yù)發(fā)育17 d時(shí)，37.5、50.0、62.5 μmol·m-2s-1光照組排卵率分別為(53.7±2.3)%、(58.3±1.9)%、(59.3±3.8)%。在各組光照條件下預(yù)發(fā)育，雌配子體均可排卵，光照強(qiáng)度越大，雌配子體排卵越快。排卵率的顯著差異主要發(fā)生在25.0 μmol·m-2s-1組與其他高光照組之間；37.5、50.0、62.5 μmol·m-2s-1組之間排卵率偶爾有顯著差異，但16 d以后無(wú)顯著差異。

表2 不同光照強(qiáng)度下海帶雌配子體排卵率

在海帶配子體預(yù)發(fā)育過(guò)程中，不同光照強(qiáng)度對(duì)雄配子體精囊形成率的影響見(jiàn)表3。25.0 μmol·m-2s-1光照組預(yù)發(fā)育4 d觀(guān)察到有精囊，之后精囊逐漸增多；15 d所有雄配子體小段上均有精囊。37.5 μmol·m-2s-1光照組預(yù)發(fā)育至4 d觀(guān)察到有精囊，13 d所有雄配子體均發(fā)育出精囊。50.0、62.5 μmol·m-2s-1光照組預(yù)均發(fā)育3 d觀(guān)察到精囊，12 d所有雄配子體均發(fā)育出精囊。在25.0～62.5 μmol· m-2s-1光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，海帶雄配子體均可發(fā)育出精囊，光照強(qiáng)度越大，雄配子體發(fā)育出精囊越早越快，精囊形成率達(dá)到100.0%的時(shí)間越短。精囊形成率的顯著差異主要發(fā)生在25.0 μmol·m-2s-1與其他高光照組之間；37.5、50.0、62.5 μmol·m-2s-1預(yù)發(fā)育組之間精囊形成率偶爾有顯著差異，但9 d以后差異均不顯著。

表3 不同光照強(qiáng)度下海帶雄配子體精囊形成率

續(xù)表3

在25.0～62.5 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度范圍內(nèi)進(jìn)行海帶雌雄配子體混合預(yù)發(fā)育，雌配子體均可變粗，進(jìn)行生殖發(fā)育，并排卵，雌配子體均可形成卵囊。光照越強(qiáng)，雌配子體變粗越早越快，排卵越早，雄配子體形成精囊的時(shí)間越早，但62.5 μmol·m-2s-1組有個(gè)別細(xì)胞色素減少、顏色變淺。整體而言，37.5 μmol·m-2s-1光照組與25.0 μmol·m-2s-1光照組的發(fā)育差別遠(yuǎn)大于37.5 μmol·m-2s-1組分別與50 μmol·m-2s-1組、62.5 μmol·m-2s-1組的發(fā)育差異。對(duì)于海帶配子體預(yù)發(fā)育實(shí)際生產(chǎn)操作而言，光照強(qiáng)度越高，操作難度越大，因此光照強(qiáng)度37.5 μmol·m-2s-1是海帶配子體預(yù)發(fā)育的最適宜光照條件。

2.2 不同培育密度對(duì)海帶配子體預(yù)發(fā)育的影響

在海帶配子體預(yù)發(fā)育試驗(yàn)中，不同培育密度對(duì)雌配子體發(fā)育率的影響見(jiàn)表4。 5.0、10.0 g·L-1密度組的海帶雌配子體在2 d時(shí)均發(fā)現(xiàn)有少量變粗發(fā)育，之后逐漸增多，5.0 g·L-1密度組在14 d時(shí)雌配子體發(fā)育率達(dá)到100.0%，10.0 g·L-1密度組16 d達(dá)到100.0%。15.0 g·L-1密度組在3 d時(shí)發(fā)現(xiàn)有雌配子體變粗，進(jìn)行生殖發(fā)育，在13 d時(shí)39.3%雌配子體變粗發(fā)育，而且之后基本維持不變，其余的雌配子體進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)，不進(jìn)行生殖發(fā)育。20.0 g·L-1密度組在7 d時(shí)有(1.0±0.6)%變粗，之后緩慢增多，15 d時(shí)有(14.7±0.3)%雌配子體變粗發(fā)育，隨后基本維持不變，其余的進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)，不進(jìn)行生殖發(fā)育。

預(yù)發(fā)育培養(yǎng)的配子體密度越小，雌配子體生殖發(fā)育越早越快，預(yù)發(fā)育效果越好。當(dāng)配子體密度10.0 g·L-1以下可以完全生殖發(fā)育，配子體密度達(dá)到15.0 g·L-1及以上時(shí)，雌配子體不能完全進(jìn)行生殖發(fā)育。在17 d的預(yù)發(fā)育試驗(yàn)中，4個(gè)密度組之間雌配子體發(fā)育率均存在顯著差異，但10.0 g·L-1密度組與5.0 g·L-1密度組雌配子體生殖發(fā)育率有7 d差異顯著，與15.0 g·L-1和20.0 g·L-1密度組雌配子體生殖發(fā)育率均有15 d差異顯著。

表4 不同培育密度下海帶雌配子體發(fā)育率

續(xù)表4

在海帶配子體預(yù)發(fā)育過(guò)程中，不同培育密度對(duì)雌配子體排卵率的影響見(jiàn)表5。5.0 g·L-1密度組的海帶雌配子體在預(yù)發(fā)育9 d時(shí)開(kāi)始排卵，之后排卵率逐漸增大，17 d時(shí)達(dá)到95.7%。10.0 g·L-1密度組的海帶雌配子體在預(yù)發(fā)育11 d時(shí)開(kāi)始排卵，之后排卵率逐漸增大，17 d達(dá)到51.3%。15.0 g·L-1密度組的海帶雌配子體在預(yù)發(fā)育17 d開(kāi)始排卵，排卵率為0.3%。20.0 g·L-1密度組的海帶雌配子體在本試驗(yàn)的預(yù)發(fā)育時(shí)間內(nèi)，沒(méi)有排卵。配子體密度越小，雌配子體發(fā)育越好，越容易排卵，當(dāng)配子體達(dá)到15.0 g·L-1及以上時(shí)，雌配子體發(fā)育不理想，不容易排卵。雌配子體開(kāi)始排卵后，5.0 g·L-1密度組排卵率均顯著高于其余各組。10.0 g·L-1密度組13 d之后的排卵率均顯著高于15.0 g·L-1和20.0 g·L-1組。

表5 不同培育密度下海帶雌配子體排卵率

在海帶配子體預(yù)發(fā)育過(guò)程中，不同培育密度對(duì)雄配子體精囊形成率的影響見(jiàn)表6。5.0 g·L-1密度組的海帶雄配子體在預(yù)發(fā)育3 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)精囊，之后精囊形成率迅速提高，12 d達(dá)到100.0%。10.0 g·L-1密度組在預(yù)發(fā)育4 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)精囊，之后精囊形成率迅速增長(zhǎng)，13 d達(dá)到100.0%。15.0 g·L-1密度組在預(yù)發(fā)育5 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)精囊，之后精囊形成率呈較慢增長(zhǎng)，17 d達(dá)到86.7%，少量雄配子體進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)，配子體加長(zhǎng)，未進(jìn)入生殖發(fā)育過(guò)程。20.0 g·L-1密度組在預(yù)發(fā)育8 d時(shí)才開(kāi)始出現(xiàn)精囊，之后精囊緩慢增多，17 d達(dá)到27.7%，大部分雄配子體進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)。配子體密度越小，雄配子體發(fā)育越好，越容易形成精囊，當(dāng)配子體達(dá)到15.0 g·L-1及以上時(shí)，部分雄配子體進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)，不形成精囊。

在17 d的預(yù)發(fā)育過(guò)程中，10.0 g·L-1密度組與5.0 g·L-1密度組的精囊形成率只有4 d差異顯著，預(yù)發(fā)育9 d后，精囊形成率差異均不顯著；而10.0 g·L-1密度組在出現(xiàn)精囊后，其精囊形成率與15.0 g·L-1密度組和20.0 g·L-1密度組均存在顯著差異。

表6 不同培育密度下海帶雄配子體精囊形成率

在培育密度達(dá)到15.0 g·L-1及以上條件下預(yù)發(fā)育，海帶雌雄配子體容易進(jìn)入絲狀體生長(zhǎng)狀態(tài)，但發(fā)育效果不理想。在5.0、10.0 g·L-1密度下預(yù)發(fā)育，雌雄配子體均能進(jìn)行正常生殖發(fā)育，但10.0 g·L-1組發(fā)育速度略慢于5.0 g·L-1。預(yù)發(fā)育時(shí)，配子體密度越大，單位體積培養(yǎng)液可預(yù)發(fā)育的配子體越多，生產(chǎn)效率越高，因此10.0 g·L-1密度為海帶配子體預(yù)發(fā)育的適宜密度。

2.3 預(yù)發(fā)育程度對(duì)出苗的影響

在光照強(qiáng)度37.5 μmol· m-2s-1、光周期12 L∶12 D、室溫(13±1)℃、密度10.0 g·L-1條件下進(jìn)行海帶配子體預(yù)發(fā)育，于不同預(yù)發(fā)育時(shí)間取樣進(jìn)行出苗測(cè)試(表7)。預(yù)發(fā)育0 d，其出苗率達(dá)到90.0%以上的培育時(shí)間為9 d。隨著預(yù)發(fā)育時(shí)間增加，出苗率達(dá)到90.0%以上的時(shí)間越短，預(yù)發(fā)育10～14 d各組的出苗率達(dá)到90%以上所需的培育時(shí)間最短，只要5 d。預(yù)發(fā)育12 d的配子體，培育5 d的出苗率最高，達(dá)到96.7%(圖1)。預(yù)發(fā)育時(shí)間超過(guò)16 d后，出苗率達(dá)到90.0%以上的時(shí)間逐漸增加；預(yù)發(fā)育21 d組的出苗率最大只有90.0%，而且需要8 d培育時(shí)間。預(yù)發(fā)育22 d以后，最大出苗率均達(dá)不到90.0%。后續(xù)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，預(yù)發(fā)育26 d以后，雌、雄配子體顏色均變淺，最大出苗率只有(18.5±7.3)%，且苗體顏色淺、部分透明。預(yù)發(fā)育28 d之后，雌、雄配子體部分發(fā)白，變成空腔死亡，只發(fā)育出少量幼苗，且陸續(xù)發(fā)白死亡。因此海帶配子體預(yù)發(fā)育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，預(yù)發(fā)育的最適宜時(shí)間為11～12 d，比未預(yù)發(fā)育配子體提早4 d達(dá)到90.0%以上出苗率。

表7 預(yù)發(fā)育時(shí)間對(duì)出苗效果的影響

3 討論

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)海帶配子體發(fā)育的影響

陳書(shū)秀等[4]研究了籠目海帶(KjellmaniellacrassifoliaMiyabe)配子體發(fā)育與光照強(qiáng)度的關(guān)系，認(rèn)為光照強(qiáng)度對(duì)籠目海帶配子體的發(fā)育有顯著的影響，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照強(qiáng)度為20～40 μmol·m-2s-1。Lüning K[16]研究表明，當(dāng)海帶配子體在充足光照下會(huì)進(jìn)入生殖發(fā)育，在低光下則維持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。Lee J A[17]研究表明，當(dāng)光照強(qiáng)度為80 μmol·m- 2s-1時(shí)，皺海帶(Laminariareligiosa) 配子體的繁殖率達(dá)到最大。楊迎霞等[5]研究結(jié)果表明，在56.3 μmol·m- 2s-1光照強(qiáng)度下，充氣懸浮培養(yǎng)的海帶配子體克隆可較快生長(zhǎng)發(fā)育，但尚書(shū)[18]認(rèn)為，在56.3 μmol·m- 2s-1光照強(qiáng)度下低密度(0.1 g·L-1)培養(yǎng)海帶配子體，容易造成細(xì)胞色素淡化。本研究結(jié)果表明，在光照強(qiáng)度25.0 ～ 62.5 μmol·m-2s-1范圍內(nèi)，培育密度為10.0 g·L-1的海帶配子體，光照越強(qiáng)，發(fā)育越快，37.5 μmol·m-2s-1光照條件預(yù)發(fā)育效果顯著優(yōu)于25.0 μmol·m-2s-1，與50.0～62.5 μmol·m-2s-1光照條件的培育效果差異不顯著。62.5 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度會(huì)使個(gè)別配子體顏色變淡。育苗生產(chǎn)中擴(kuò)增培養(yǎng)配子體時(shí)，一般利用多層培養(yǎng)架，每層培養(yǎng)架擺放2排培養(yǎng)瓶，上方設(shè)置2～3排日光燈管作為光源。預(yù)留出充氣管的操作空間后，錐形瓶液面位置的光照強(qiáng)度可達(dá)到40 μmol·m-2s-1左右。若需要較低的光照強(qiáng)度，可以遮蔽部分日光燈管。但若要提高光照強(qiáng)度，則需要改換更大功率的日光燈管，同時(shí)日光燈管釋放的熱量也會(huì)增多，不利于控溫操作。因此考慮到實(shí)際生產(chǎn)中可行性和經(jīng)濟(jì)適用性，37.5 μmol·m-2s-1可作為海帶配子體預(yù)發(fā)育的理想光照強(qiáng)度。

3.2 培育密度對(duì)海帶配子體發(fā)育的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，配子體密度越小，雌配子體發(fā)育率、排卵率、雄配子體精囊形成率越高。當(dāng)培育密度達(dá)到15.0 g·L-1及以上時(shí)，配子體不易進(jìn)行生殖發(fā)育，而容易進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)，達(dá)不到預(yù)發(fā)育的效果。高密度培養(yǎng)影響海帶配子體預(yù)發(fā)育的原因可能有2個(gè)方面：一是高密度培養(yǎng)限制了配子體受光時(shí)間和受光量。本研究中，海帶配子體是在錐形瓶中充氣翻騰培養(yǎng)，培育密度大，會(huì)使單位配子體光照強(qiáng)度不足，受光時(shí)間變短，影響甚至抑制生殖發(fā)育。而該受光時(shí)間和受光量可能正是海帶配子體進(jìn)行絲狀體生長(zhǎng)的適宜條件，因此配子體進(jìn)入生長(zhǎng)過(guò)程，而非生殖發(fā)育過(guò)程。海帶配子體生殖發(fā)育和絲狀體生長(zhǎng)的條件應(yīng)該存在明顯差異，但機(jī)理有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。二是在高密度培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液中海帶配子體生殖發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)成分，比如鐵離子[19-20]等可能不足，限制了預(yù)發(fā)育效果。

3.3 預(yù)發(fā)育時(shí)間對(duì)海帶配子體出苗的影響

本研究中，在37.5 μmol·m-2s-1、光周期12 L∶12 D、室溫(13±1)℃、密度10.0 g·L-1條件下預(yù)發(fā)育12 d的海帶配子體，出苗培育5 d，出苗率達(dá)到(96.7±0.9)%，比未預(yù)發(fā)育的配子體提早4 d達(dá)到90.0%以上的出苗率。但預(yù)發(fā)育時(shí)間太長(zhǎng)，預(yù)發(fā)育效果會(huì)降低甚至失敗。過(guò)度預(yù)發(fā)育導(dǎo)致預(yù)發(fā)育失敗的原因可能是雌雄配子體發(fā)育到一定程度后，在相對(duì)較小的空間內(nèi)繼續(xù)發(fā)育致使環(huán)境條件不能滿(mǎn)足需求，同時(shí)其代謝物可能也會(huì)對(duì)配子體造成傷害，最終導(dǎo)致雌雄配子體和后續(xù)形成的幼苗死亡。因此進(jìn)行海帶配子體預(yù)發(fā)育需要嚴(yán)格控制預(yù)發(fā)育的程度，以保證配子體和苗種的質(zhì)量。

3.4 配子體預(yù)發(fā)育狀態(tài)指標(biāo)的選擇

本研究以雌配子體發(fā)育率、排卵率、精囊形成率為考察指標(biāo)，觀(guān)察海帶配子體預(yù)發(fā)育的狀態(tài)和效果。其中雌配子體排卵率和雄配子體精囊形成率是常用的觀(guān)察指標(biāo)，用這兩個(gè)指標(biāo)表述配子體發(fā)育的結(jié)果。而配子體的發(fā)育過(guò)程用雌配子體發(fā)育率來(lái)考察。配子體開(kāi)始發(fā)育以雌配子體變粗作為標(biāo)志，若觀(guān)察到雌配子體小段中有變粗的細(xì)胞即視為該配子體小段為發(fā)育的配子體。本研究中以配子體發(fā)育率考察配子體的發(fā)育過(guò)程，屬首次使用。當(dāng)雌配子體變粗時(shí)，配子體形態(tài)發(fā)生變化，可以通過(guò)顯微鏡分辨出來(lái)。不同配子體在發(fā)育之前的粗細(xì)不完全一致，變粗之后的粗細(xì)也不都是一個(gè)規(guī)格，因此難以用量化的粗細(xì)變化作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，只能做定性考察。 雄配子體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞也有一定程度的變化，但不如雌配子體變粗更易于觀(guān)察。更科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐渥芋w發(fā)育過(guò)程的觀(guān)察指標(biāo)有待在今后的研究中進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

4 結(jié)論

海帶配子體預(yù)發(fā)育的適宜光照強(qiáng)度為37.5 μmol·m-2s-1、適宜密度為10.0 g·L-1、適宜預(yù)發(fā)育時(shí)間為11～12 d。