劉淑雅 俞志明 宋秀賢 曹西華

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

有害藻華在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā), 破壞生態(tài)平衡, 造成魚類、貝類或鳥類大量死亡, 甚至危害人類健康(Sellner et al, 2003), 已經(jīng)成為嚴(yán)重的海洋災(zāi)害,其預(yù)防及治理受到廣泛關(guān)注。粘土礦物絮凝法因來源豐富、成本較低和沒有二次污染, 被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的藻華治理方法之一(Anderson, 1997)。但由于粘土礦物溶膠性差, 自身絮凝速度太快導(dǎo)致去除有害微藻效率較低, 在實(shí)際應(yīng)用中需要大量噴灑, 存在淤渣大量沉積的問題(俞志明等, 1993)。為了提高絮凝效率, 俞志明等(1994, 1995a, b)提出了粘土改性方法, 通過增加粘土顆粒與微藻細(xì)胞間的靜電吸引作用及在粘土顆粒與生物之間形成“橋聯(lián)作用”, 顯著增強(qiáng)了粘土的除藻能力, 得到了廣泛地推廣與應(yīng)用。在現(xiàn)場應(yīng)用中發(fā)現(xiàn), 改性粘土不僅能夠絮凝沉降大量的藻華生物, 而且殘余部分微藻也未能在短時間內(nèi)增殖、再次形成藻華, 說明改性粘土對未被絮凝的微藻也有抑制作用, 但其作用機(jī)制尚不清楚。

微藻生理生化性質(zhì)的變化可以表征不同環(huán)境變化對細(xì)胞的影響。例如, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)是藻細(xì)胞生長過程中的正常產(chǎn)物, 通常情況下它的產(chǎn)生與消除在細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控下處于動態(tài)平衡中。但逆境脅迫將導(dǎo)致細(xì)胞積累過多的 ROS,可使膜脂過氧化、蛋白質(zhì)損傷、DNA鏈斷裂(蔡以瀅等, 1999)。ROS也可作為信號傳遞分子(Dat et al,2000), 激發(fā)細(xì)胞的防御系統(tǒng), 其中抗氧化酶是細(xì)胞抵御過氧化傷害的重要防御體系?？寡趸赶到y(tǒng)是微藻在環(huán)境脅迫下一個重要的生理生化指標(biāo), 對細(xì)胞消除ROS具有重要作用。有研究表明, 紫外輻射(Leeet al, 2009)、強(qiáng)光(卿人韋等, 2003)、病原體(蔡以瀅等,1999)、化學(xué)物質(zhì)(Mei et al, 2014; Martins et al, 2015)及重金屬(Pinto et al, 2003)等逆境脅迫因子能夠激發(fā)海洋微藻的抗氧化酶防御系統(tǒng), 甚至損害該系統(tǒng)?？寡趸富钚缘奶岣哂兄谇宄?xì)胞內(nèi)積累的自由基,從而使細(xì)胞在一定程度上忍耐逆境脅迫, 因此可以用來指示微藻細(xì)胞損傷的程度。本文以小球藻(Chlorella vulgaris)為模式藻(Huang et al, 2009; Wang et al, 2010), 研究改性粘土絮凝法對其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)等抗氧化酶活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響, 從生理生化角度探討改性粘土方法對殘留微藻的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用藻種為小球藻(Chlorella vulgaris),由中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(藻種編號： HN-CX), 分離自海南海域。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)海水取自青島膠州灣海域, 經(jīng) 0.45μm混合纖維膜過濾后121°C高溫滅菌30min。采用血球計(jì)數(shù)板法測定微藻細(xì)胞生長情況, 選取指數(shù)生長期的藻液用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所使用的粘土為江蘇吳縣高嶺土, 其理化參數(shù)見 Liu等人(2016)的報道, 所使用的改性劑為無機(jī)改性劑聚合氯化鋁(poly aluminum chloride, PAC),改性粘土的制備方法參照相關(guān)文獻(xiàn)(俞志明等, 1994)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將小球藻于(20±1)°C, L1培養(yǎng)液(每1L過濾滅菌海水中加入 1mL 75g/L NaNO3; 1mL 5g/L NaH2PO4·H2O; 1mL的L1微量金屬元素和0.5mL的維他命)中培養(yǎng), 光照強(qiáng)度為 72μmol photons/(m2·s),光暗比12h∶12h。小球藻呈現(xiàn)自然指數(shù)增長狀態(tài), 在第 10天達(dá)到(10.00±0.07)×106cell/mL, 將藻液轉(zhuǎn)移至6個5L三角瓶中培養(yǎng), 分為三組： 改性粘土組、原土組(未改性粘土)和對照組, 每組 2個平行樣。為了研究改性粘土絮凝法對未被去除部分微藻細(xì)胞的生長影響, 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)去除率達(dá) 50%左右時分離上層藻液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在加入 0.15g/L改性粘土和 1.5g/L原土?xí)r, 去除率分別達(dá)到 56%和51%。所以, 本文中各實(shí)驗(yàn)組分別為 0.15g/L改性粘土組、1.5g/L原土組和不加入任何粘土的對照組。向改性粘土組和原土組分別加入粘土3h后(Wang et al,2011), 取上層未被去除的微藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng), 測定細(xì)胞生長率和生理生化參數(shù)。

1.3 去除效率、細(xì)胞增長率、透光率和生理生化參數(shù)的測定

1.3.1 去除效率(Removal efficiency, RE)的測定加入改性粘土或原土 3h后, 使用血球計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞密度, 去除效率的計(jì)算公式如下

1.3.2 細(xì)胞增長率(μ)測定 計(jì)算公式如下

式中： N為細(xì)胞密度, t為時間, 在本文中時間間隔取1天。

1.3.3 透光率(T)測定 小球藻加入改性粘土(或原土)后利用分光光度計(jì)對藻液進(jìn)行全波長(200—700nm)掃描, 確定最大吸收波長為380nm。各實(shí)驗(yàn)組加入改性粘土和原土后分別取樣測定不同時刻下的T380, 以此來表示水體的透光率T。

1.3.4 提取酶液 將藻液離心(9500r/min, 5min)收集, 保存于-80°C冰箱。樣品加入1mL磷酸緩沖溶液(pH=7.8)于玻璃研磨器中研磨3min, 再用超聲波破碎儀破碎 10min, 離心(4°C, 5000r/min, 10min)收集上清液, 即為粗酶液, 低溫保存。

1.3.5 生理生化參數(shù)測定 可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán) G-250法(王學(xué)奎, 2006)。SOD、CAT、APX、GSH-PX和MDA采用南京建成生物工程研究所的相應(yīng)試劑盒測定。

2 結(jié)果和討論

2.1 改性粘土絮凝法對小球藻生長的影響

改性粘土組和原土組小球藻呈現(xiàn)出相似生長趨勢(圖 1), 細(xì)胞密度先下降后增長, 改性粘土組細(xì)胞密度略低于原土組。兩個實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過11天左右的生長, 細(xì)胞密度恢復(fù)到粘土處理前, 第 11—22天改性粘土組和原土組平均細(xì)胞增長率分別為 0.0800/d和0.0771/d, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)前相同細(xì)胞密度區(qū)間(第 5—10天)的平均增長率(0.200/d), 說明粘土處理抑制了這部分小球藻的生長(圖 1b—c), 這與以往粘土對尖刺擬菱形藻(Pseudonitzschia pungens f. multiseries)(俞志明, 1998)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)(孫曉霞, 2001; Lu et al, 2015a)和赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)(孫曉霞, 2001)等生長的抑制作用研究結(jié)果一致。

圖1 改性粘土絮凝法對小球藻生長的影響Fig. 1 Effect of modified clay flocculation on the growth of Chlorella vulgaris

為了進(jìn)一步探討改性粘土絮凝法對水體殘留小球藻生長的抑制作用機(jī)制, 我們分別研究了水體中殘留微藻的可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性以及MDA含量對粘土加入的響應(yīng)與變化特點(diǎn)。

2.2 改性粘土絮凝法對小球藻可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白大多是參與細(xì)胞代謝的各種酶類,將粘土作為外源刺激, 其含量變化可作為了解藻細(xì)胞在此脅迫下的一個抗逆性指標(biāo)。兩個實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白含量變化相類似, 均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(圖2)。王麗媛等人(2012)研究了磁性殼聚糖-稀土-粘土復(fù)合樹脂(MCRC)對赤潮異彎藻的作用, 其可溶性蛋白含量表現(xiàn)出了相似的變化趨勢。

圖2 改性粘土絮凝法對小球藻可溶性蛋白含量的影響Fig. 2 Effect of modified clay flocculation on soluble protein content of Chlorella vulgaris

兩個實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白含量均高于對照組, 改性粘土組可溶性蛋白含量在第 1天達(dá)到最大值(0.486±0.061)×10-8mg/cell, 是對照組的 3.93倍。原土組可溶性蛋白含量在第 3天呈現(xiàn)出最大值(0.286±0.007)×10-8mg/cell, 是對照組的 1.69倍。有研究表明重金屬、低溫等逆境條件可引起可溶性蛋白含量增加, 谷巍等(2001)認(rèn)為可溶性蛋白提高, 是植物抵抗毒害的解毒機(jī)制, 可增加細(xì)胞滲透能力和功能蛋白含量, 維持細(xì)胞代謝平衡。本實(shí)驗(yàn)中粘土絮凝對小球藻造成逆境脅迫, 激發(fā)了藻細(xì)胞的防御系統(tǒng), 這可能是導(dǎo)致可溶性蛋白含量上升的主要因素。

2.3 改性粘土絮凝法對小球藻SOD活性的影響

SOD是細(xì)胞抵抗過氧化傷害的第一道防線, 廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中(陳鴻鵬等,2007)。添加改性粘土或原土后, 這兩組的小球藻SOD活性相較于對照組明顯提高, 而且變化趨勢相類似, 先上升后下降, 均在 3h達(dá)到最大值(圖3)。有研究表明 SOD 是自然界唯一可以消除 O2-·的酶(Gechev et al, 2006), 本文中兩個實(shí)驗(yàn)組SOD活性顯著增強(qiáng), 說明添加改性粘土或原土破壞了微藻細(xì)胞代謝平衡, 致使細(xì)胞積累較多O2-·, 從而誘導(dǎo)SOD表達(dá)。歧化O2-·的作用機(jī)理(Mallick et al, 2000)如下：

由此產(chǎn)生的H2O2可再由CAT和APX等酶進(jìn)一步作用分解。在整個實(shí)驗(yàn)過程中, 改性粘土組 SOD活性明顯高于原土組, 特別是在加入粘土 3h時, 為原土組的1.96倍(圖3), 這說明同樣去除效果下少量的改性粘土對殘余微藻細(xì)胞產(chǎn)生的脅迫壓力較大,積累較多O2-·。

圖3 改性粘土絮凝法對SOD活性的影響Fig. 3 Effect of modified clay flocculation on SOD activity of Chlorella vulgaris

2.4 改性粘土絮凝法對小球藻 CAT、APX和GSH-PX活性的影響

作為細(xì)胞內(nèi)消除 ROS的第二道防線(王詠梅,2005), CAT、APX和GSH-PX均能催化分解H2O2。其中CAT與H2O2具有較高的親和力, 能夠清除脂肪酸氧化、光呼吸、線粒體電子傳遞中產(chǎn)生的H2O2, 是H2O2的主要清除劑(陳金峰等, 2008)。由于葉綠體中沒有CAT和GSH-PX等酶, 因此APX是清除葉綠體中產(chǎn)生的 H2O2的關(guān)鍵酶(沈文飚等, 1997)。GSH-PX也是細(xì)胞內(nèi)重要的活性氧消除劑, 主要分布在線粒體和細(xì)胞液中, 阻止ROS對細(xì)胞的進(jìn)一步傷害(苗雨晨等, 2005; 王詠梅, 2005)。

改性粘土組的CAT、APX和GSH-PX變化趨勢類似(圖4), 經(jīng)粘土絮凝處理, 各酶活性顯著增強(qiáng), 均在加入粘土1天后達(dá)到最大值, 分別是對照組的1.27倍、1.94倍和6.65倍, 實(shí)驗(yàn)后期各酶活性有所下降并穩(wěn)定到較高水平。

原土組相對應(yīng)的各種酶活表現(xiàn)出不同的變化趨勢。CAT活性相對于對照組沒有明顯變化(圖 4a)。APX活性隨著處理后時間的延長先略有下降后迅速增強(qiáng), 在第1天時達(dá)到最大, 實(shí)驗(yàn)后期APX活性下降并保持在較穩(wěn)定水平(圖 4b)。與其它酶活不同的是,原土組GSH-PX活性高于改性粘土組, 其活性迅速增強(qiáng), 保持在較高水平至第3天(圖4c)。

圖4 改性粘土絮凝法對小球藻CAT、APX和GSH-PX活性的影響Fig. 4 Effect of modified clay flocculation on CAT, APX and GSH-PX activity of Chlorella vulgaris

兩個實(shí)驗(yàn)組中CAT、APX和GSH-PX活性變化幅度各不相同。研究表明 H2O2含量較高時, 才能激發(fā)CAT活性, 若含量較低, 則需要APX等抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)來消除(Gechev et al, 2006)。原土組CAT和 APX活性均低于改性粘土組相應(yīng)活性, 尤其CAT活性相比于對照組沒有明顯的提高, 但GSH-PX活性卻高于改性粘土組?？赡苁怯捎谠两M對微藻細(xì)胞脅迫產(chǎn)生的H2O2含量較低, 未能引起CAT活性提高, 為了消除這部分 H2O2, 則需要 APX和 GSH-PX的共同作用。由此說明CAT、APX和GSH-PX作為細(xì)胞內(nèi)酶體防御 ROS的第二道防線, 在消除細(xì)胞內(nèi)H2O2時互相補(bǔ)充、共同作用。

抗氧化酶在清除細(xì)胞 ROS方面具有十分重要的作用, 其活性變化能夠反映該藻受到逆境脅迫的程度及自身的抗逆能力。侯秀富等(2013)研究表明, 不同粒徑的水體懸浮顆粒物對斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的抗氧化酶產(chǎn)生影響, 尤其是0—75μm粒徑組顆粒物對該藻的影響較大, 該粒徑與本研究所使用的粘土粒徑(Liu et al, 2016)相近, 因此小球藻抗氧化酶活系統(tǒng)對粘土的響應(yīng)可能與水體懸浮顆粒物相類似。

2.5 改性粘土絮凝法對小球藻MDA含量的影響

MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一, 其含量變化可以反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷程度, 并且 MDA對細(xì)胞也有毒害作用(劉家忠等, 1999)。改性粘土組和原土組小球藻MDA含量變化呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(圖5), 隨著粘土處理后時間的延長, MDA含量迅速增大, 在1天后達(dá)到最大值, 分別是對照組的2.77倍(改性粘土組)和 2.44倍(原土組), 這表明處理組小球藻細(xì)胞脂質(zhì)受到過氧化傷害, 同時MDA含量的增加加重了細(xì)胞膜的傷害程度, 可能是由于粘土絮凝對小球藻形成的逆境導(dǎo)致氧化脅迫, 這與抗氧化酶活性變化相吻合, 并且原土改性后增強(qiáng)了其對微藻細(xì)胞的氧化損傷。在實(shí)驗(yàn)后期, 該藻MDA含量有所下降, 可能是由于抗氧化系統(tǒng)的作用逐步消除細(xì)胞內(nèi)ROS所致。

圖5 改性粘土絮凝法對小球藻MDA含量的影響Fig. 5 Effect of modified clay flocculation on MDA content of Chlorella vulgaris

綜合分析本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 水體中殘留的小球藻對粘土絮凝法的生理生化響應(yīng)主要由于兩部分因素： 一方面這些殘留在水體中的微藻細(xì)胞盡管沒有與粘土顆粒發(fā)生有效絮凝作用, 沉降于水底, 但是絮凝期間會與粘土顆粒發(fā)生一系列碰撞作用(俞志明等, 1995a, b), 這些看似無效的碰撞仍能對細(xì)胞表面產(chǎn)生一定的影響, 干擾小球藻的正常代謝, 從而抑制細(xì)胞的正常生長; 另一方面, 在粘土絮凝過程中, 微藻細(xì)胞生長環(huán)境(比如光照、營養(yǎng)鹽等)發(fā)生較大變化, 粘土顆粒會在一定程度上削弱水體的光照強(qiáng)度, 直接影響小球藻的光合作用。孫曉霞(2001)研究發(fā)現(xiàn), 隨著粘土濃度的增大, 對塔瑪亞歷山大藻和赤潮異彎藻光合作用的抑制增強(qiáng), 而葉綠體是植物產(chǎn)生ROS的主要場所(Asada, 2006), 由此可以推測粘土顆粒的“遮蔭效應(yīng)”可以使細(xì)胞 ROS積累(俞志明等, 1995a, b), 從而導(dǎo)致抗氧化酶活性和MDA含量等參數(shù)的增加。本研究得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 經(jīng)粘土處理后透光率迅速下降, 改性粘土和原土組透光率分別是對照組的75%和25%。在3h時, 改性粘土組的透光率恢復(fù)至與對照組相同, 但原土組透光率仍比較低, 僅為對照組的54%, 表明粘土顆粒削弱了水體光照強(qiáng)度, 并且由于原土組粘土顆粒較多, 對水體光照強(qiáng)度影響較大, 這可能是原土組抗氧化酶活性和MDA含量提高的重要原因。

王小冬等(2012)研究發(fā)現(xiàn), 營養(yǎng)鹽限制能夠顯著提高赤潮異彎藻和海洋卡盾藻(Chattonella marina)的抗氧化酶活性。粘土能夠吸附水體中磷酸鹽(俞志明等, 1995a, b), 改變水體氮磷比例, 形成營養(yǎng)鹽限制,因此可能會對該藻產(chǎn)生氧化傷害, 激發(fā)抗氧化酶活性提高。本研究中改性粘土對小球藻產(chǎn)生較大氧化脅迫, 可能與改性劑 PAC的協(xié)同作用相關(guān)。本課題組Lu等(2015b)研究發(fā)現(xiàn)PAC改性粘土不僅可以去除大部分總磷, 也可清除總氮, 改變化學(xué)計(jì)量值, 對細(xì)胞產(chǎn)生較大營養(yǎng)鹽限制, 導(dǎo)致改性粘土組抗氧化酶活性和MDA含量要高于原土組。

3 結(jié)論

改性粘土方法治理赤潮災(zāi)害的主要原理是絮凝藻細(xì)胞至海底, 導(dǎo)致其死亡、分解。除此之外, 該方法對未被絮凝的藻細(xì)胞有什么影響一直未被關(guān)注。本文以小球藻為模式生物, 考察了改性粘土絮凝后水體中殘余小球藻的生長率、生理生化性質(zhì)變化等, 發(fā)現(xiàn)赤潮水體經(jīng)改性粘土治理后, 殘余小球藻的生長受到了明顯抑制。進(jìn)一步考察了其生理生化性質(zhì), 發(fā)現(xiàn)絮凝作用導(dǎo)致殘余藻細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生變化, SOD、CAT、APX和GSH-PX活性增強(qiáng), MDA含量上升等。這些變化可能與改性粘土絮凝過程中的物理撞擊、改性粘土顆粒的“遮蔭效應(yīng)”和營養(yǎng)鹽環(huán)境改變等因素有關(guān), 從而導(dǎo)致殘留細(xì)胞的生長受到了影響, 難以再次爆發(fā)形成赤潮。上述結(jié)果進(jìn)一步深化了對改性粘土方法治理有害藻華機(jī)制的認(rèn)識。

王小冬, 王 艷, 2012. 赤潮異彎藻和海洋卡盾藻抗氧化酶活性對氮磷比失衡的響應(yīng). 海洋環(huán)境科學(xué), 31(3)： 337—340

王麗媛, 張 莉, 汪東風(fēng), 2012. 磁性殼聚糖-稀土-粘土復(fù)合樹脂對赤潮異灣藻的抑制作用. 海洋環(huán)境科學(xué), 31(6)：808—812

王詠梅, 2005. 自由基與谷胱甘肽過氧化物酶. 解放軍藥學(xué)學(xué)報, 21(5)： 369—371

王學(xué)奎, 2006. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)(第二版). 北京：高等教育出版社,190—192

劉家忠, 龔 明, 1999. 植物抗氧化系統(tǒng)研究進(jìn)展. 云南師范大學(xué)學(xué)報, 19(6)： 1—11

孫曉霞, 2001. 粘土礦物及無機(jī)絮凝劑對有害赤潮的治理研究.青島： 中國科學(xué)院海洋研究所博士學(xué)位論文, 38—50

谷 巍, 施國新, 杜開和等, 2001. 汞、鎘復(fù)合污染對輪葉狐尾藻的毒害影響. 南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版), 24(3)： 75—79

沈文飚, 黃麗琴, 徐朗萊, 1997. 植物抗壞血酸過氧化物酶.生命的化學(xué), 17(5)： 24—26

陳金峰, 王宮南, 程素滿, 2008. 過氧化氫酶在植物脅迫響應(yīng)中的功能研究進(jìn)展. 西北植物學(xué)報, 28(1)： 188—193

陳鴻鵬, 譚曉風(fēng), 2007. 超氧化物歧化酶(SOD)研究綜述. 經(jīng)濟(jì)林研究, 25(1)： 59—65

苗雨晨, 白 玲, 苗 琛等, 2005. 植物谷胱甘肽過氧化物酶研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報, 22(3)： 350—356

侯秀富, 郭沛涌, 張華想等, 2013. 水體懸浮顆粒物對斜生柵藻生理生化及光合活性的影響. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 33(5)：1446—1457

俞志明, 1998. 粘土礦物對尖刺擬菱形藻多列型生長和藻毒素產(chǎn)生的影響. 海洋與湖沼, 29(1)： 47—52

俞志明, 馬錫年, 謝 陽. 1995a. 粘土礦物對海水中主要營養(yǎng)鹽的吸附研究. 海洋與湖沼, 26(2)： 208—214

俞志明, 鄒景忠, 馬錫年, 1994. 一種提高粘土礦物去除赤潮生物能力的新方法. 海洋與湖沼, 25(2)： 226—232

俞志明, 鄒景忠, 馬錫年等, 1993. 治理赤潮的化學(xué)方法. 海洋與湖沼, 24(3)： 314—318

俞志明, 鄒景忠, 馬錫年等, 1995b. 粘土礦物去除赤潮生物的動力學(xué)研究. 海洋與湖沼, 26(1)： 1—6

卿人韋, 葉華勛, 李 揚(yáng)等, 2003. 在高強(qiáng)度光照脅迫下極大螺旋藻兩種抗氧化酶活力變化的研究. 四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 40(3)： 565—569

蔡以瀅, 陳 珈, 1999. 植物防御反應(yīng)中活性氧的產(chǎn)生和作用.植物學(xué)通報, 16(2)： 107—112

Anderson D M, 1997. Turning back the harmful red tide. Nature,388(6642)： 513—514

Asada K, 2006. Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions. Plant Physiology,141(2)： 391—396

Dat J, Vandenabeele S, Vranová E et al, 2000. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cellular and Molecular Life Sciences, 57(5)： 779—795

Gechev T S, Van Breusegem F, Stone J M et al, 2006. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. BioEssays, 28(11)：1091—1101

Huang Z Y, Li L P, Huang G L et al, 2009. Growth-inhibitory and metal-binding proteins in Chlorella vulgaris exposed to cadmium or zinc. Aquatic Toxicology, 91(1)： 54—61

Liu Y, Cao X H, Yu Z M et al, 2016. Flocculation of harmful algal cells using modified clay： effects of the properties of the clay suspension. Journal of Applied Phycology, 28(3)：1623—1633

Lee T M, Shiu C T, 2009. Implications of mycosporine-like amino acid and antioxidant defenses in UV-B radiation tolerance for the algae species Ptercladiella capillacea and Gelidium amansii. Marine Environmental Research, 67(1)：8—16

Lu G Y, Song X X, Yu Z M et al, 2015a. Environmental effects of modified clay flocculation on Alexandrium tamarense and paralytic shellfish poisoning toxins (PSTs). Chemosphere,127： 188—194

Lu G Y, Song X X, Yu Z M et al, 2015b. Effects of modified clay flocculation on major nutrients and diatom aggregation during Skeletonema costatum blooms in the laboratory.Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 33(4)：1007—1019

Mallick N, Mohn F H, 2000. Reactive oxygen species： response of algal cells. Journal of Plant Physiology, 157(2)： 183—193 Martins P L G, Marques L G, Colepicolo P, 2015. Antioxidant enzymes are induced by phenol in the marine microalga Lingulodinium polyedrum. Ecotoxicology and Environmental Safety, 116： 84—89

Mei X Q, Zheng K, Wang L D et al, 2014. Studies on the effects on growth and antioxidant responses of two marine microalgal species to uniconazole. Journal of Ocean University of China, 13(5)： 877—882

Pinto E, Sigaud-kutner T C S, Leit?o M A S et al, 2003. Heavy metal-induced oxidative stress in algae. Journal of Phycology, 39(6)： 1008—1018

Sellner K G, Doucette G J, Kirkpatrick G J, 2003. Harmful algal blooms： causes, impacts and detection. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 30(7)： 383—406

Wang D F, Li H Y, Wang L Y et al, 2010. Effects of chitosan-RE3+-bentonite on growth of Chlorella vulgaris.Journal of Rare Earths, 28(S1)： 149—153

Wang H L, Yu Z M, Cao X H et al, 2011. Fractal dimensions of flocs between clay particles and HAB organisms. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 29(3)： 656—663