劉必林 林靜遠(yuǎn) 陳新軍① 胡貫宇

(1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院 上海 201306; 2. 國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心 上海 201306; 3. 大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306; 4. 遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306 )

角質(zhì)顎是位于頭足類口球內(nèi)主切割食物功能的硬組織結(jié)構(gòu), 由上下兩片組成(劉必林等, 2009), 其主要成分為角質(zhì)纖維和蛋白質(zhì)(Hunt et al, 1981;Miserez et al, 2007)。作為頭足類少數(shù)硬組織之一, 角質(zhì)顎因其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐腐蝕以及信息儲(chǔ)存良好等特點(diǎn)而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注(劉必林等, 2014,2015)。隨著 Clarke(1964)首先在強(qiáng)壯桑椹烏賊Moroteuthis ingens的角質(zhì)顎中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)紋后, 越來(lái)越多的學(xué)者致力于利用角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)來(lái)研究頭足類的年齡和生長(zhǎng)(Perales-Raya et al, 2010, 2014a;Oosthuizen, 2004; Canali et al, 2011; Castanhari et al,2012; Cuccu et al, 2013)。然而, 研究只集中在真蛸Octopus vulgaris (Cuccu et al, 2013; Perales-Raya et al,2014b)和瑪雅蛸 O. maya (Rodríguez-Domínguez et al,2013; Bárcenas et al, 2014)這兩種蛸類身上, 關(guān)于柔魚類僅有 Mereu等(2011)和胡貫宇等(2015)對(duì)角質(zhì)顎的生長(zhǎng)紋進(jìn)行了判讀。為此, 本文以西北太平洋海域的柔魚為例, 分析柔魚類角質(zhì)顎的微結(jié)構(gòu)特征, 通過(guò)與耳石判定的日齡做比較以確定角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的日周期性, 并建立柔魚胴長(zhǎng)、體重和角質(zhì)顎喙長(zhǎng)與日齡的關(guān)系。研究結(jié)果不僅為柔魚類年齡鑒定與生長(zhǎng)估算提供新方法, 而且為我國(guó)頭足類學(xué)者開(kāi)展相關(guān)研究提供重要基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

2010年5—6月和2011年9—11月共采集柔魚樣本 35尾, 樣本實(shí)驗(yàn)室解凍后小心將耳石和角質(zhì)顎取出, 清洗其表面的黏液及其它有機(jī)物后, 分別保存于盛有 75%酒精的離心管和管口瓶中, 并貼好標(biāo)簽以備后用。與此同時(shí), 記錄樣本的胴長(zhǎng)(mantle length,ML)、體重(body weight, BW)、性別、性腺成熟度等基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù), 角質(zhì)顎喙長(zhǎng)(Upper rostrum length,URL)的測(cè)量依據(jù)劉必林等(2010)。

1.2 角質(zhì)顎

取出保存于管口瓶中的角質(zhì)顎上顎, 用帶有0.3 mm刀片的小型手持切割機(jī)沿角質(zhì)顎喙部頂端至頭蓋后緣縱向切割成兩半(圖 1), 用剪刀將其中半個(gè)角質(zhì)顎的喙部截面(Rostrum sagittal section, RSS)剪下(圖 2a); 使角質(zhì)喙部切割面朝下平放于塑料模具(圖 2b)中, 倒入調(diào)配好的冷埋樹脂溶液包埋(圖 2c),然后置常溫避光處待其硬化; 硬化后的樹脂塊切割成 2—3mm 的薄片, 并用強(qiáng)力熱熔膠粘于載玻片上(圖 2d); 先后以 240、600、1200、2000目水磨砂紙將切片研磨至中心面, 最后以 0.05μm氧化鋁劑拋光研磨面(圖 2e、f)。

圖2 角質(zhì)顎喙部切片制作流程圖Fig.2 Flow charts of upper beak RSS preparation

1.3 生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)

制作好的角質(zhì)顎切片在 Olympus顯微鏡100×和400×下, 采用控制攝像系統(tǒng)(Charged Coupled Device,CCD)分別對(duì)喙部整體和頂端的生長(zhǎng)紋進(jìn)行拍照, 然后用Photoshop 7.0圖像處理軟件對(duì)兩個(gè)倍數(shù)下所拍的圖片分別進(jìn)行拼圖處理。生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)時(shí), 先對(duì)100×下采集的圖像由喙部后端向前端, 始終沿生長(zhǎng)紋垂直的方向計(jì)數(shù)喙部背側(cè)的生長(zhǎng)紋數(shù)目, 直至喙部背側(cè)邊緣處, 再對(duì) 400×下采集的圖像繼續(xù)計(jì)數(shù), 邊緣空白處的生長(zhǎng)紋數(shù)目由臨近的生長(zhǎng)紋寬度推算而得。每個(gè)樣本分別獨(dú)立計(jì)數(shù) 3次, 采用變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)檢驗(yàn)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性, 其計(jì)算公式如下

式中 R1、R2、R3分別代表每個(gè)樣本獨(dú)立的 3次計(jì)數(shù)值, R代表3次計(jì)數(shù)的平均值。

1.4 耳石日齡鑒定

每個(gè)角質(zhì)顎對(duì)應(yīng)的耳石樣本, 依據(jù) Dawe等(1991)的方法對(duì)其進(jìn)行包埋、切割、研磨、拋光、觀察、計(jì)數(shù)等。根據(jù)柔魚類耳石生長(zhǎng)紋“一日一齡”的理論, 柔魚耳石的生長(zhǎng)紋個(gè)數(shù)即其實(shí)際日齡。

1.5 角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋日周期性驗(yàn)證

采用獨(dú)立樣本配對(duì)t檢驗(yàn)檢查角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋與日齡是否存在顯著差異, 同時(shí)對(duì)角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋數(shù)目與耳石日齡進(jìn)行線性回歸分析, 并比較擬合線性方程的斜率和相關(guān)系數(shù)是否接近1。

1.6 建立生長(zhǎng)方程

采用線性、冪函數(shù)、指數(shù)、對(duì)數(shù)、邏輯斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz等7個(gè)生長(zhǎng)模型來(lái)擬合柔魚體長(zhǎng)、體重和角質(zhì)顎喙部的生長(zhǎng), 其中赤池信息準(zhǔn)則(Akaike information criterion , AIC)值最小的為最適生長(zhǎng)模型(Arkhipkin et al, 2000)。AIC計(jì)算公式如下

式中k為模型的參數(shù)數(shù)量, n為樣本數(shù)量, RSS為剩余平方和。

2 結(jié)果

2.1 角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)

角質(zhì)顎上顎喙部截面由背側(cè)的頭蓋和腹側(cè)的脊突兩部分組成(圖 1c), 周期性的生長(zhǎng)帶明顯, 每一條生長(zhǎng)帶由明、暗兩條生長(zhǎng)紋組成。頭蓋部的生長(zhǎng)紋明顯比脊突部的生長(zhǎng)紋清晰, 兩部分的生長(zhǎng)紋交匯于內(nèi)軸成“＜”形, 生長(zhǎng)紋后端逐漸平行于脊突背緣(圖1c, 圖 2)。角質(zhì)顎的喙部頂端以及后端常有明顯的標(biāo)記輪(圖3a, b)。截面中部的生長(zhǎng)紋最寬(圖3c), 頂端生長(zhǎng)紋最窄(圖 3d), 而同一條生長(zhǎng)紋越接近內(nèi)軸的部分其寬度越寬(圖 3e), 越遠(yuǎn)離內(nèi)軸的部分其寬度越窄(圖 3f)。柔魚角質(zhì)顎喙部生長(zhǎng)紋的平均寬度為 12.4 μm。

圖3 柔魚角質(zhì)顎上顎喙部微結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Light microstructure of upper beak RSS

2.2 角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋數(shù)目與耳石日齡關(guān)系

分析結(jié)果顯示, 三次獨(dú)立計(jì)數(shù) CV值為 2.97%±1.11%, 明顯小于 5%, 因此角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)準(zhǔn)確,每個(gè)角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的形成需要1.018±0.039天。獨(dú)立樣本配對(duì)t檢驗(yàn)顯示, 角質(zhì)顎喙部生長(zhǎng)紋數(shù)目與耳石日齡無(wú)明顯差異(P=0.057＞0.05)。擬合線性方程顯示,斜率(1.0177)和相關(guān)系數(shù)R2(0.9693)均接近于1(圖4)。耳石估算日齡為 112—270 天, 角質(zhì)顎估算日齡為102—266 天, 兩者基本相當(dāng), 因此, 柔魚角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的沉積為“一日一紋”。

2.3 角質(zhì)顎日齡與柔魚胴長(zhǎng)和體重關(guān)系

根據(jù)最小AIC法(表1), 柔魚胴長(zhǎng)和體重與角質(zhì)顎日齡關(guān)系均適合用邏輯斯蒂曲線來(lái)描述, 日齡 200天以前柔魚胴長(zhǎng)和體重增長(zhǎng)較快, 200天以后增長(zhǎng)變緩(圖 5), 其關(guān)系式分別如下, 其中 ML為胴長(zhǎng), BW為體重, A為日齡。

圖4 柔魚角質(zhì)顎上顎喙部生長(zhǎng)紋數(shù)目與耳石日齡的關(guān)系Fig.4 Relationship between number of growth increments of upper beak rostrum sagittal section and statolith determined age for O. batramii

表1 線性、冪函數(shù)、指數(shù)、對(duì)數(shù)、邏輯斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz等7個(gè)生長(zhǎng)方程擬合柔魚胴長(zhǎng)-日齡、體重-日齡上顎喙長(zhǎng)-日齡參數(shù)值Tab.1 Parameters of linear, power, exponential, logarithmic,logistic, von Bertalanffy and Gompertz models fitted to ML-age, BW-age and URL-age data for O. batramii.

2.4 角質(zhì)顎日齡與喙長(zhǎng)關(guān)系

根據(jù)最小AIC法(表1), 柔魚角質(zhì)顎喙長(zhǎng)與日齡適合用邏輯斯蒂曲線來(lái)描述, 日齡200天以前角質(zhì)顎喙部生長(zhǎng)較快, 200天以后生長(zhǎng)變緩(圖6), 其關(guān)系式如下, 其中URL表示角質(zhì)顎喙長(zhǎng),A為日齡：

3 討論

圖5 柔魚胴長(zhǎng)、體重與角質(zhì)顎日齡關(guān)系Fig.5 Correlations of ML and BW to the increment-determined age for O. bartramii

圖6 角質(zhì)顎上顎喙長(zhǎng)與日齡關(guān)系Fig.6 Relationship between URL and increment determined age for O. bartrami

頭足類的角質(zhì)顎與其耳石、內(nèi)殼、眼晶體等硬組織一樣, 存在明顯的生長(zhǎng)紋結(jié)構(gòu), 角質(zhì)顎頭蓋、脊突、側(cè)壁、翼部等各部表面的生長(zhǎng)紋明顯, 肉眼可見(jiàn), 而喙部的生長(zhǎng)紋則須要切割研磨后才可見(jiàn)(劉必林等,2014)。Clarke(1964)首次詳細(xì)報(bào)道了強(qiáng)壯桑椹烏賊角質(zhì)顎中的生長(zhǎng)紋結(jié)構(gòu), Nixon(1973)和Smale等(1993)先后在其它頭足類角質(zhì)顎中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)。然而截至目前, 有關(guān)頭足類角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的研究主要集中在側(cè)壁和喙部?jī)蓚€(gè)部位, 側(cè)壁生長(zhǎng)紋是以喙頂端為中心的同心環(huán)紋(Perales-Rayaet al, 1998), 而喙部生長(zhǎng)紋則是以內(nèi)軸為對(duì)稱軸的“＜”形條紋(圖 1c)。本研究發(fā)現(xiàn), 與真蛸相似, 柔魚角質(zhì)顎喙部頂端生長(zhǎng)紋最窄(圖 3d), 中部的生長(zhǎng)紋最寬(圖 3c) (Perales-Rayaet al, 2010)。此外, 在一些柔魚角質(zhì)顎樣本的喙部頂端和后端發(fā)現(xiàn)了明顯的標(biāo)記紋, 以往的研究認(rèn)為它們的形成與頭足類特殊的生活史事件(如孵化、交配、產(chǎn)卵)以及突發(fā)事件(溫度波動(dòng)、捕食者攻擊)等密切相關(guān)(Arkhipkin, 2005; Perales-Raya et al, 2014b)。

Perales-Raya等(1998)首先提出真蛸角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的形成可能與其年齡相關(guān), 直到 2001年Hernández-López才從實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了幼體真蛸角質(zhì)顎側(cè)壁生長(zhǎng)紋具有日周期性。在此之后, Oosthuizen(2004)、Canali 等(2011)、Rodríguez-Domínguez 等(2013)、Bárcenas等(2014)和 Perales-Raya 等(2014)先后采用四環(huán)素標(biāo)記、溫度突變標(biāo)記、實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)法驗(yàn)證了真蛸和瑪雅蛸角質(zhì)顎喙部生長(zhǎng)紋的日周期性。酒井光夫等(2007)嘗試分析 5種柔魚類(莖柔魚 D.gigas、柔魚、阿根廷滑柔魚Illex. argentinus、鳶烏賊thenotheuthis oualaniensis和太平洋褶柔魚Todarodes pacificus)仔魚角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的周期性, 結(jié)果表明, 除鳶烏賊外, 其余 4種角質(zhì)顎的生長(zhǎng)紋均為“一日一紋”。然而, 本文首次驗(yàn)證了柔魚類整個(gè)生命史周期內(nèi)角質(zhì)顎生長(zhǎng)紋的日周期性, 彌補(bǔ)了前者只限于仔魚期的不足。

研究表明, 在利用硬組織鑒定頭足類的日齡時(shí),弄清第1條生長(zhǎng)紋形成的時(shí)間至關(guān)重要： 當(dāng)其形成于頭足類孵化時(shí), 則估算的日齡與實(shí)際日齡相等; 而當(dāng)其形成于孵化前, 則估算的日齡比實(shí)際日齡大, 反之則比實(shí)際日齡小(劉必林等, 2009, 2014)。此外, 計(jì)數(shù)者的經(jīng)驗(yàn)也是影響日齡鑒定準(zhǔn)確性的關(guān)鍵, 計(jì)數(shù)結(jié)果的可重復(fù)性可用作檢驗(yàn)準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。一般來(lái)說(shuō),在年齡鑒定研究中, 生長(zhǎng)紋計(jì)數(shù)的可信臨界標(biāo)準(zhǔn)為,獨(dú)立重復(fù)計(jì)數(shù) 2—3次, 幾次計(jì)數(shù)值的差異不高于10%(Jackson et al, 1997; Oosthuizen, 2004)。本文 3次獨(dú)立計(jì)數(shù)值的差異為 2.97 %±1.11%, 明顯小于10%,加之已有研究證明柔魚角質(zhì)顎的第 1生長(zhǎng)紋形成于孵化時(shí)(酒井光夫等, 2007)。因此, 本文通過(guò)角質(zhì)顎喙部估算的柔魚日齡是準(zhǔn)確的, 其結(jié)果顯示柔魚壽命小于1年, 這與耳石估算的柔魚壽命相符(Yatsu et al,1997)。最小 AIC法顯示, 柔魚胴長(zhǎng)、體重以及角質(zhì)顎喙長(zhǎng)與日齡呈顯著的邏輯斯蒂關(guān)系, 這說(shuō)明柔魚在其幼體期胴長(zhǎng)、體重以及喙長(zhǎng)生長(zhǎng)較快, 而隨著性腺不斷成熟生長(zhǎng)逐步變緩, 這符合頭足類的一般生長(zhǎng)規(guī)律(Arkhipkin, 2005)。

4 結(jié)論

過(guò)去幾十年, 盡管耳石微結(jié)構(gòu)分析被認(rèn)為是研究頭足類年齡和生長(zhǎng)的最有效方法(Jackson, 1994),然而近年來(lái), 頭足類研究者們?nèi)栽诓粩鄧L試尋找另外一些可靠的途徑(如內(nèi)殼、角質(zhì)顎、眼晶體微結(jié)構(gòu)分析)來(lái)代替耳石(Doubleday et al, 2011; Cárdenas et al, 2011; Perales-Raya et al, 2014b)。對(duì)于蛸類而言,其耳石晶體結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致生長(zhǎng)紋不清晰, 因而角質(zhì)顎微結(jié)構(gòu)分析逐步成為其年齡和生長(zhǎng)研究的最有效方法之一(Perales-Raya et al, 1998, 2010, 2014a;Hernández-López et al, 2001; Oosthuizen, 2004; Canali et al, 2011; Castanhari et al, 2012; Cuccu et al, 2013)。角質(zhì)顎個(gè)體比耳石大許多, 更容易提取、更方便研磨,而且具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐腐蝕的特點(diǎn), 常存于大型魚類、海鳥以及哺乳動(dòng)物的胃內(nèi)(Boyle et al, 2005), 更易間接獲取, 因此角質(zhì)顎的這些特點(diǎn)使其在頭足類的年齡和生長(zhǎng)中的研究前景更為廣闊。然而, 有一點(diǎn)需要注意的是, 頭足類的捕食活動(dòng)常常會(huì)造成角質(zhì)顎喙頂端一定程度的磨損。因此, 建議在利用角質(zhì)顎喙部鑒定頭足類日齡時(shí), 需要選擇那些角質(zhì)顎磨損較小的樣本, 以免過(guò)度低估實(shí)驗(yàn)樣本的實(shí)際日齡。

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