陳 漪 王曉杰, 冉皓宇 林 昱,

(1. 上海海洋大學省部共建水產(chǎn)種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306; 2. 上海海洋大學國際海洋研究中心上海 201306; 3. 上海海洋大學海洋生物系統(tǒng)與神經(jīng)科學研究所 上海 201306)

海水青 鳉 魚(Oryzias melastigma)隸屬輻鰭亞綱(Actinopterygii)、頜針魚目(Beloniformes)、 怪頜 鳉 科(Adrianichthyidae)、青鳉屬(Oryzias), 原產(chǎn)于印度沿岸(Abraham, 2013)。 由于海水青 鳉 魚具有個體小、性別容易區(qū)分、世代周期短、產(chǎn)卵率高、鹽度適應范圍廣等特點, 目前已被推薦為“一種理想的海洋模式魚種”(Kong et al, 2008; Bo et al, 2011; Dong et al,2014)。由于對污染物干預敏感, 海水青鳉越來越廣泛用于海洋生態(tài)毒理學研究, 其胚胎已被國際生命科學學會健康和環(huán)境科學研究所認定為毒理學研究的重要工具(Dong et al, 2014)。

在基因組學中, 淡 水日本青 鳉 (O. latipes)全基因組序列已經(jīng)解析, 而 海水青 鳉 魚 與日本青 鳉 在系統(tǒng)發(fā)育上非常相近, 因 此海洋青 鳉 魚基因信息也可較方便地獲得, 目前已開發(fā)出相關基因芯片(陳瑤等,2010)。 海水青 鳉 魚的分子生物學基礎數(shù)據(jù)正逐步完備, 目前已鑒定了一批器官特異性表達的分子標記物(如腦部、眼部、心臟、胸鰭、胰腺、肝臟、肌肉和神經(jīng)等器官和系統(tǒng))。Lau 等(2014)利用小RNA深度測序技術, 研究低氧脅迫對 O. Melastigma雌雄成魚的miRNAs影響。利用全胚胎免疫組化法篩選出的17 種 斑馬魚抗體可與海水青 鳉 魚發(fā)生特異性的免疫反應(Chen et al, 2011)。這些抗體與神經(jīng)、心臟和腦部等器官的發(fā)育關系密切, 為蛋白質水平的毒性研究提供了基礎。此外, 針 對日本青 鳉 的解剖學和生理學等方面的研究已比較完善和系統(tǒng)(Huang et al, 2011),這也為海水青鳉魚的相關研究提供了參考資料。

魚類發(fā)育的早期階段對污染物最為敏感, 因此,胚胎毒性分析是廣泛應用的毒性檢測方法, 并認為是傳統(tǒng)的魚類毒性實驗的替代方法(Brannen et al,2010; Embry et al, 2010)。斑馬魚(Danio rerio), 黑頭呆魚(Pimephales promelas)和 日本青 鳉 魚已被認為是典型的胚胎毒性分析種類(Chen et al, 2011)。近年來,而海水青 鳉 魚作為新興的海水魚模式種在胚胎毒性分析中也引起關注。有研究者(Iwamatsu, 2004)已經(jīng)詳細描述了淡水日本青 鳉 的胚胎發(fā)育過程, 但尚未見有關海水青 鳉 胚胎發(fā)育的有關報道。本研究對海洋青鳉魚(O. melastigma)的繁殖習性以及胚胎發(fā)育過程進行了詳細的觀察, 它的早期胚胎發(fā)育過程無論是在基因組學和分子生物學, 還是在環(huán)境毒理學上的應用都有著密切的聯(lián)系, 本研究結果在于積累海水青鳉魚在發(fā)育生物學上的基礎資料, 為進一步的科學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚養(yǎng)殖

海水青鳉魚 2—3月齡即進入性成熟, 本試驗選用3月齡 性 成熟海水青 鳉 置于室內(nèi)循環(huán)水體中養(yǎng)殖。實驗用水是由曝氣自來水加入紅海鹽配制而成, 鹽度為 31, 水溫控制在 27—28.5°C; 定期換水、吸污;光暗周期為14h : 10h; 每天3次, 定時投喂初孵鹵蟲的無節(jié)幼體, 達到飽食。

1.2 人工采卵及孵化方法

根據(jù)臀鰭的形態(tài), 可 區(qū)分青 鳉 魚的雌雄(圖 1a,圖1b)。 雌性青 鳉 大約在每天早上 8—9點產(chǎn)卵(光照開始后 1h), 卵 通過長絲掛于雌性青 鳉 魚泄殖腔, 受精, 懸掛數(shù)小時后脫落(圖1c)。為了及時發(fā)現(xiàn)剛受精的受精卵, 當發(fā)現(xiàn)雌魚泄殖腔附近有成簇的受精卵后, 立即將雌魚用魚網(wǎng)撈出, 置于墊有濾棉的大培養(yǎng)皿中, 用鑷子將受精卵取下, 轉移到裝有新鮮配置海水培養(yǎng)皿中。每天更換培養(yǎng)皿中的海水, 水溫控制在25.5—27.5°C, 鹽度 31, pH 為 8.15—8.20。

1.3 胚胎發(fā)育過程觀察

取受精卵在解剖鏡下觀察其外部形態(tài)變化, 在觀察到 1細胞期后立即使用 Zeiss Stereo Discovery V12體視顯微鏡進行連續(xù)拍照。為達到最佳的拍攝效果, 依照 Iwamatsu(2014)的方法并加改動, 將受精卵放入浮游動物計數(shù)框上加蓋玻片進行拍照, 蓋玻片下有 1mm深的凹槽, 拍攝時輕輕移動蓋玻片可調(diào)整受精卵的朝向。在胚胎發(fā)育前期, 每5min觀察一次,到達囊胚階段后每 1h觀察一次, 器官形成后每 6h觀察一次, 選取胚胎發(fā)育各個時期的典型形態(tài)特征拍照。

2 結果

2.1 卵的特征

青鳉魚卵為球形, 半透明, 直徑約為 0.9mm; 卵具有一定的粘性, 卵黃被一層較厚的絨毛膜緊密包裹, 絨毛膜上具有長短不一的絲狀小絨毛均勻地分布在整個絨毛膜表面, 中心是一個大的透明的卵黃囊, 在未受精的情況下, 直徑為 10—30μm 的微油滴嵌其中(圖1 d); 接近卵的植物極, 有粘性長細絲成簇狀地分布; 雌魚產(chǎn)卵時卵子的粘性長絲一頭附著在泄殖腔內(nèi), 另一頭固著在絨毛膜上, 使產(chǎn)出的未受精卵成簇的懸掛在雌魚泄殖腔后方(圖1)。雌魚掛卵后,雄魚追趕雌魚, 排精, 進行授精。青鳉魚受精卵屬于沉性卵, 受精后沉于水底。

圖1 海 水青鳉 魚性成熟親魚及未受精的卵子(標尺100 μm)Fig.1 The matured marine medaka Oryzias melastigma and an unfertilized egg (scale bar 100 μm)

2.2 胚胎發(fā)育觀察

采受精卵進行胚胎發(fā)育觀察。首先, 根 據(jù)青 鳉 魚胚胎發(fā)育時序及形態(tài)特點, 對其胚胎發(fā)育過程進行分期, 整個發(fā)育過程分為受精卵激活階段、受精卵胚盤形成階段、卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經(jīng)胚階段、器官形成階段、孵化出膜階段8個階段。根據(jù)各階段形態(tài)特征的變化, 又把整個發(fā)育階段劃分為33個時期(各時期發(fā)育簡要特征、受精后時間見表1), 受精卵在平均26°C的水溫條件下, 10天內(nèi)孵化出膜, 歷時220h 30min。

2.2.1 受精卵激活階段 處于剛受精階段的卵,卵的外周是由較厚的絨毛膜包圍, 此時的絨毛膜和卵黃之間的卵周隙在體視鏡下很難辨認。有許多油脂微滴均勻地分散在整個卵中(圖2. 0-a); 10min后, 隨著皮質泡的破裂開始形成卵周間隙, 油滴逐漸融合,變大, 數(shù)目變少并開始向植物極聚集(圖 2. 0-b);15min后卵周間隙更加明顯, 卵殼外絨毛膜變薄和硬化, 可以看到它與卵黃逐漸分離, 卵中央是大而透明的卵黃, 周圍形成寬的卵周隙。油滴進一步融合形成數(shù)個大油滴, 并移向植物極(圖2. 0-c)。

表1 海水青鳉魚胚胎發(fā)育特征Tab.1 Feature of embryonic development of marine medaka O. melastigma

2.2.2 受精卵胚盤形成階段(1細胞期) 受精后60min, 靠近皮質側的胞質開始往動物極聚集, 隨后原生質集中在動物極, 并逐漸加厚而形成一個凸起,胚盤隆起呈帽狀, 即1細胞期; 此時油滴已全部遷移到植物極, 并開始聚集(圖2. 1-1, 1-2)。

2.2.3 卵裂階段 受精后 1h 15min, 受精卵開始卵裂。在動物極所在半球發(fā)生卵裂, 形成第一次卵裂溝, 胚盤逐漸由外向內(nèi)縊裂, 分裂成兩個大小相似近半球形的卵裂球, 進入 2細胞期(圖 2. 2-1、2-2); 受精后1h 45min, 出現(xiàn)第二次卵裂溝, 與第一次卵裂溝相垂直形成4個大小形態(tài)相似的卵裂球, 進入4細胞期(圖 2. 3-1、3-2); 受精后 2h, 開始第三次卵裂, 形成兩條卵裂溝與第一次卵裂溝平行, 將胚盤分成八個大小略有不同的卵裂球, 排列成兩行, 每行四個卵裂球, 進入8細胞期(圖2. 4-1、4-2); 受精后2h 5min,開始第四次卵裂, 形成四行排列, 外圈 12個細胞較大, 內(nèi)部4個細胞較小, 進入16細胞期(圖2. 5-1、5-2);3h 10min, 開始第五次卵裂, 外緣的12個卵裂球經(jīng)向分為24個卵裂球, 中央的4個卵裂球水平分成8個卵裂球, 形成兩層分布, 卵裂球不規(guī)則排列, 為32細胞期(圖2. 6-1、6-2); 受精后4h, 進入桑葚胚早期, 卵裂球越分越小, 大小不一且排列不規(guī)則, 邊緣卵裂界限較清晰(圖2. 7-1、7-2)。細胞分裂的軌跡難以追蹤,細胞大致呈3—4層排列, 在外周的細胞較小且扁平。4h 30min, 進入桑葚胚晚期, 細胞變得更小, 邊緣細胞分裂增多, 細胞堆疊為4—5層(圖2. 8-1、8-2)。

2.2.4 囊胚階段 受精后 5h, 形成半圓形囊胚層,胚盤細胞很小, 胚胎進入囊胚早期(圖2. 9-1、9-2); 受精后 8h, 進入囊胚中期, 與囊胚早期無較大差別, 細胞界限逐漸不清晰(圖 2. 10-1、10-2); 受精后 10h 55min, 細胞數(shù)目增多且變得更小, 分不出細胞界限,細胞分裂向胚盤邊緣擴散, 進入囊胚晚期(圖2. 11-1、11-2)。受精后15h, 胚盤開始延展, 細胞越來越小, 進入囊胚擴展期。胚盤變得平坦, 在卵黃囊表面擴展,外包開始(圖 2. 12-1、12-2)。

2.2.5 原腸胚階段 17h囊胚層細胞逐漸增多, 細胞層擴展并逐漸向植物極方向下包, 原腸胚起始(圖2. 13-1、13-2); 18h 30min, 胚層細胞繼續(xù)下包, 覆蓋卵黃囊的1/4, 胚胎進入原腸胚早期(圖2. 14-1、14-2);受精后 19h 30min, 進入原腸胚中期, 胚層細胞繼續(xù)下包, 并內(nèi)卷開始在胚層邊緣形成胚環(huán), 胚層細胞在一側向內(nèi)插入, 增厚形成胚盾, 此時囊胚層覆蓋卵黃接近1/2(圖2. 15-1、15-2); 受精后20h 45min, 囊胚層繼續(xù)下包, 覆蓋卵黃超過 2/3, 胚盾變窄并向動物極延伸, 進入原腸胚晚期(圖2. 16-1、16-2)。

2.2.6 神經(jīng)胚階段 受精后21h 15min, 囊胚層細胞下包至卵黃囊的底部, 進入神經(jīng)胚階段, 胚盾一端(靠近動物極處)膨大, 胚孔邊緣接近閉合, 處于胚孔閉合前期(圖2. 17-1); 受精后25h 30min, 胚孔閉合,進入胚孔閉合期, 胚體形成, 呈柱狀(圖 2. 18-1), 其中一段發(fā)育為頭部原基(圖2. 19-1、19-2)。

2.2.7 器官形成階段 受精后28h, 進入眼基形成期, 頭部兩側出現(xiàn)一對腎形的隆起, 為眼的原基, 開始出現(xiàn)克氏泡(Kupffer′s vesicles)結構(圖 2. 20-1、20-2); 受精后29h進入眼囊形成期, 頭部兩側的腎形隆起更加明顯, 眼囊形成, 胚體尾部有明顯的克氏泡結構, 出現(xiàn)兩個體節(jié)(圖 2. 21-1、21-2); 受精后 35h 30min, 進入耳囊和腦分化開始期, 在胚體背側, 眼囊后方形成橢圓形耳胞原基, 位于胚體兩側; 克氏泡在胚體尾部十分明顯, 油滴合并成一個大油球(圖 2.22-1、22-2)。38h后, 進入腦和耳囊形成期, 頭部后方形成圓形耳囊, 腦進一步分化, 前腦中腦后腦均可見, 體腔擴張, 體節(jié)6—9個(圖2. 23-1、23-2); 45h, 進入晶狀體形成期, 視囊處出現(xiàn)晶狀體結構, 耳囊中缺乏耳石, 前腦、中腦、后腦的界限逐漸分明, 體腔扁平, 心臟原基出現(xiàn), 開始形成管狀心臟, 胚體包圍近卵黃囊體的 1/2(圖 2. 24-1、24-2); 胚胎發(fā)育至 58h 45min , 體腔進一步伸向眼囊泡的后端, 耳囊尚未出現(xiàn)耳石, 心臟發(fā)育成長管狀結構, 出現(xiàn)在頭部末端下方, 心臟有微弱跳動, 但仍不明顯(圖2. 25-1、25-2);65h 30min管狀心臟發(fā)育開始到達眼囊的后方, 在腹側區(qū)可以看到明顯的血島結構(在 6—11體節(jié)之間),同樣在腹側區(qū)形成消化管, 克氏泡明顯縮小, 胚體包圍卵黃囊的1/2(圖2. 26-1、26-2); 胚胎發(fā)育至70h, 開始心臟跳動期, 心臟開始有節(jié)奏地跳動, 可以觀察到一對半圓形的居維葉氏(Cuvierian)管道在胚體左右兩側形成, 克氏泡基本消失, 胚胎尾尖自由脫離卵黃囊,胚體出現(xiàn)微弱抽動現(xiàn)象(圖2. 27-1、27-2); 胚胎發(fā)育至 80h, 進入卵黃靜脈循環(huán)期, 在尾部出現(xiàn)尾靜脈,卵黃靜脈由左右兩側居維葉氏管和尾靜脈組成, 居維葉氏管中觀察到血液的流動(圖2. 28-1、28-2); 胚胎發(fā)育至90h 15min, 進入胚胎包圍3/4卵黃期, 胚體包圍卵黃囊的3/4, 尾部的1/3脫離卵黃囊; 胸鰭原基形成, 耳石出現(xiàn)在充分擴展的耳囊內(nèi)表面上, 呈現(xiàn)為兩個顆粒, 眼球由于黑色素出現(xiàn)開始黑化(圖2. 29-1、29-2); 胚胎發(fā)育至 130h, 進入胚胎完全包裹卵黃囊時期, 胚胎尾部離開卵黃囊(圖2. 30-1、30-2); 胚胎發(fā)育至 145h, 胚胎發(fā)育到達尾芽期, 卵黃囊明顯變小,胚胎包繞卵黃囊并且胚胎尾尖接觸到眼睛, 尾部鰭褶開始形成, 胚胎下頜形成, 卵內(nèi)可以明顯看到紅色的血液流動, 尾部開始出現(xiàn)色素細胞(圖2. 31-1、31-2)。

圖2 海 水青 鳉 魚胚胎發(fā)育照片(標尺100 μm)Fig.2 Photos of embryonic development of marine medaka O. melastigma (scale bar: 100 μm)

2.2.8 孵化出膜階段 胚胎發(fā)育至 217h, 進入孵化出膜階段。卵黃囊比之前階段變得更小, 胚體的血液循環(huán)路線可以清晰地看到, 黃綠色的膽囊胚胎體可以在胚胎的側面觀察到, 整個胚體偶爾在絨毛膜內(nèi)翻轉(圖2. 32-1、32-2); 發(fā)育至220h 30min左右, 仔魚開始陸續(xù)出膜, 仔魚出膜的方式主要是通過尾巴擺動破膜而出, 尾巴出膜后, 仔魚通過猛烈抖動身體擺脫卵膜。剛出膜的仔魚尾部和頭部略微彎曲, 體長約 3—4mm, 在水底很少運動, 身體有少量色素斑;卵黃囊為橢圓形(圖2. 33-1、33-2)。

3 討論

海水環(huán)境與淡水環(huán)境存在較大差異(如鹽度, 密度, pH, 離子強度和溶解氧等), 決定了污染物在海洋中的生態(tài)毒理學特性與在淡水中不同(French et al,2009; Jeon et al, 2010)。 同一屬不同種的海水青 鳉 魚(O. melastigma)和 淡水青 鳉 魚(O. latipes)在這兩種環(huán)境中的反應也不同(Yang et al, 2013), 這些差異也表明淡水生態(tài)毒理的研究結果不能直接用于評估海水環(huán)境的毒性效應(伍辛瀧等, 2012; Dong et al, 2014)。海水青 鳉 魚目前已被推薦為“一種理想的海洋模式魚種”。

本文對海水青 鳉 魚的胚胎發(fā)育過程進行了觀察及拍照, 與 日本青 鳉 魚(Iwamatsu, 2004)相似, 胚胎發(fā)育遵循典型的硬骨魚類的模式, 即經(jīng)過受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官分化形成及出膜等時期。卵受精后不久, 卵母細胞成熟, 生殖泡破裂釋放出第二極體并排出到細胞質表面, 完成受精卵的激活并進一步形成胚盤。卵裂方式為盤狀不完全卵裂,早期卵裂以經(jīng)裂-緯裂的模式卵裂球自外向內(nèi)發(fā)生縊裂, 分裂迅速。其中, 本 文觀察海水青 鳉 魚在神經(jīng)胚階段中, 胚孔閉合后, 胚體出現(xiàn); 但 是淡水青 鳉 魚在原腸胚末期, 囊胚層下包 3/4 時, 胚體出現(xiàn)。這是整個胚胎發(fā)育過程中, 觀察 到 兩種青 鳉 魚發(fā)育時序上的主要差別。除此之外, Iwamatsu(2014)將 淡水青 鳉 魚的胚胎發(fā)育過程, 以手繪圖形式將各個發(fā)育時期的特征顯示, 本文利用顯微拍照顯示各個時期的發(fā)育特征, 兩篇文章可以互為補充。

青 鳉 魚的卵和幼體對許多環(huán)境污染物和環(huán)境脅迫因子非常敏感(Tseng et al, 2013; Tian et al, 2014)。本文在對其發(fā)育過程各個時期特點進行描述后, 將利于進行海洋環(huán)境因子變化對器官發(fā)育及發(fā)育進程影響的研究。并且, O. melastigma 胚胎的分子分期,主要是心臟、胸鰭、腦、眼、肌肉、胰腺、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)也已進行了研究(Chen et al, 2011)。對青鳉魚胚胎發(fā)育器官形態(tài)觀察結合分子水平研究如利用基因敲除等技術, 可以找到對污染物或其他環(huán)境脅迫因子敏感的基因, 這將有助于更深入的闡述其毒理機制。

4 結論

本文對海水青 鳉 魚胚胎發(fā)育過程進行了觀察和描述, 整個發(fā)育過程分為受精卵激活階段、受精卵胚盤形成階段、卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經(jīng)胚階段、器官形成階段、孵化出膜階段八個階段。根據(jù)各階段形態(tài)特征的變化, 又把整個發(fā)育階段劃分為33個時期。本研究為開展海洋生態(tài)毒理對海水青 鳉 魚器官發(fā)育影響的研究提供了資料。

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