郝貴杰 林 鋒 母昌考 李榮華 赟姚嘉 潘曉藝袁雪梅 沈錦玉① 王春琳①

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211; 2. 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001)

半乳糖凝集素(Galectins)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種保守糖蛋白, 從真菌到哺乳動(dòng)物均有發(fā)現(xiàn), 也是動(dòng)物凝集素家族的成員之一(Vasta, 2009), 可特異性識(shí)別糖鏈末端的β-半乳糖苷, 為非膜整合性的可溶性蛋白(Barondes, 1984; 賀雪明等, 2012)。迄今為止, 在哺乳類動(dòng)物中至少已發(fā)現(xiàn)15種不同的半乳糖凝集素,它們均含有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain, CRD), 根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)不同, 一般被分為 3種類型: 原型、嵌合型和串聯(lián)重復(fù)型。其中原型只含有1個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域, 并且會(huì)形成非共價(jià)結(jié)合的同源二聚體; 嵌合型含有1個(gè)C端CRD結(jié)構(gòu)域和N端富含脯氨酸和甘氨酸的結(jié)構(gòu)域; 串聯(lián)重復(fù)型含有 2個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域, 中間由一段功能肽段連接(Yang et al,2008)。近年來, 在軟體動(dòng)物中又發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的quadruple-galectin (Song et al, 2011; Maldonado-Aguayo et al, 2014), 其對(duì)Galectins家族的結(jié)構(gòu)是一個(gè)新的補(bǔ)充。半乳糖凝集素廣泛存在于大部分細(xì)胞尤其是免疫相關(guān)細(xì)胞中, 它們通過與細(xì)胞表面的糖復(fù)合物結(jié)合, 在多種生物過程中發(fā)揮重要的作用, 如細(xì)胞增殖、黏附、凋亡、免疫反應(yīng)等(秦欣欣等, 2012;Wang et al, 2013)。

隨著水生動(dòng)物免疫學(xué)研究的深入, 越來越多的水生動(dòng)物半乳糖凝集素被發(fā)現(xiàn), 從魚類(Yang et al,2013; Zhang et al, 2016)、甲殼類(Shi et al, 2014; Hou et al, 2015)、軟體動(dòng)物(Yamaura et al, 2008; Wei et al,2012)到海綿(Kawsar et al, 2008)。眾多的研究表明,半乳糖凝集素在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物非特異性免疫中起到重要作用, 尤其是作為模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Molecular, PRR)發(fā)揮抵抗病原微生物的作用(Song et al, 2015)。例如, 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)的半乳糖凝集素 EsGal對(duì)多種病原菌具有較強(qiáng)的凝集活性, 而且這種凝集可被 D-半乳糖和α-乳糖抑制(Wang et al, 2016); 菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的半乳糖凝集素可結(jié)合派琴蟲(Perkinsus)和弧菌(Vibrio)表面的半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺而進(jìn)行病原菌的識(shí)別(Kim et al, 2008)等。然而目前尚未見三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素的相關(guān)報(bào)道。

三疣梭子蟹隸屬甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹屬(Portunus), 因其味道鮮美且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 現(xiàn)已成為沿海各省海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)品。然而, 近年來, 由于集約化養(yǎng)殖及養(yǎng)殖環(huán)境污染等因素, 導(dǎo)致梭子蟹自身的抗病力下降, 對(duì)病害的易感性增加, 疾病頻繁發(fā)生(王國(guó)良等, 2006; 許文軍等, 2006; 劉淇等, 2007;閻斌倫等, 2012)。三疣梭子蟹缺乏特異性免疫系統(tǒng),主要依靠非特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)行病原的識(shí)別及清除,已有很多免疫相關(guān)分子如模式識(shí)別受體及免疫效應(yīng)因子陸續(xù)報(bào)道(Pan et al, 2010; Liu et al, 2012; Hao et al, 2015; Li et al, 2016), 但關(guān)于三疣梭子蟹半乳糖凝集素的研究卻鮮有報(bào)道。本研究從三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定得到了一個(gè)半乳糖凝集素基因 EST(命名為PtGal), 對(duì)序列進(jìn)行了末端擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析, 并開展了基因表達(dá)組織分析及溶藻弧菌刺激響應(yīng)規(guī)律以及重組表達(dá)蛋白功能的研究, 以期為三疣梭子蟹分子育種及抗病選育提供依據(jù), 并為認(rèn)識(shí)梭子蟹半乳糖凝集素以及對(duì)該分子進(jìn)化、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹為寧波鑫億鮮活水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖基地人工繁育并養(yǎng)殖, 規(guī)格 50±3g, 投喂冰鮮小雜魚, 每天換水1/3, 于22—25°C充氣海水中暫養(yǎng)一周后, 選取健康的梭子蟹100只, 有5只蟹分別取肝胰腺、胃、腸等組織快速置于液氮罐中, 其它蟹進(jìn)行溶藻弧菌感染實(shí)驗(yàn)(菌株由寧波大學(xué)海洋學(xué)院王國(guó)良老師惠贈(zèng)), 并設(shè)置對(duì)照組, 分別于感染前(即 0h),感染后3h、6h、12h、24h、48h和72h隨機(jī)挑取5個(gè)個(gè)體, 取肝胰腺, 快速置于液氮罐中備用。

實(shí)驗(yàn)試劑RNAsimple Total RNA kit、FastQuant cDNA RT Kit (with gDNA)、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; PrimeSTAR HS DNA 酶、TaKaRa LA Taq、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase、Agarose Gel DNA Purification Kit、pMD19-T simple vector購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa); Trans1-T1, BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金公司, Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司; 其它為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及序列測(cè)定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 三疣梭子蟹總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

各組織經(jīng)液氮研磨后取 50—100mg, 按照RNAsimple Total RNA kit試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行濃度和純度測(cè)定, 最后各樣品統(tǒng)一定量為 2μg,根據(jù)FastQuant RT Kit (with gDNase)試劑盒說明書進(jìn)行 cDNA第一鏈的合成, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于 PCR或qRT-PCR擴(kuò)增。

1.3 三疣梭子蟹PtGal末端序列的RACE擴(kuò)增及全長(zhǎng)序列的確定

在三疣梭子蟹卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到一種半乳糖凝集素基因編碼框 cDNA序列, 設(shè)計(jì)用于3’RACE擴(kuò)增末端 PolyA序列的引物 PtGal-GSP1和PtGal-GSP2(表 1), 按照 TaKaRa 3′-Full RACE 擴(kuò)增試劑盒說明書, 使用 3′RACE Adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 再利用引物 PtGal-GSP1和 3′RACE Outer Primer進(jìn)行Outer PCR反應(yīng), 反應(yīng)條件為: 94°C 3min;94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1min, 20 個(gè)循環(huán); 72°C 10min。以第一輪 PCR產(chǎn)物為模版, PtGal-GSP2和3’RACE Inner Primer進(jìn)行Inner PCR反應(yīng), 反應(yīng)條件為: 94°C 3min; 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1min, 30 個(gè)循環(huán); 72°C 10min。PCR產(chǎn)物回收克隆至pMD19-T后藍(lán)白斑篩選, 陽性克隆送至南京金斯瑞生物公司測(cè)序,所得序列用DNAstar軟件拼接獲得完整的全長(zhǎng)序列。

1.4 序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及氨基酸序列比對(duì)

半乳糖凝集素基因及氨基酸同源序列從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), 由(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)分析氨基酸序列的一致性。利用 ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)半乳糖凝集素等電點(diǎn) pI及分子量(Mw)進(jìn)行預(yù)測(cè); SignalIP4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找半乳糖凝集素信號(hào)肽; 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)由在線軟件 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)完成(http://smart.embl-heidelberg.de/); N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)用 NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/); 用BioEdit進(jìn)行不同物種半乳糖凝集素氨基酸序列比對(duì)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(qRT-PCR)

應(yīng)用 qRT-PCR檢測(cè)三疣梭子蟹半乳糖凝集素PtGal轉(zhuǎn)錄本的組織分布情況及對(duì)溶藻弧菌刺激的反應(yīng)模式。根據(jù)PtGal基因序列設(shè)計(jì)特異性定量引物qPtGal-F和qPtGal-R, 并選取β-actin基因作為內(nèi)參基因(引物信息見表 1), 根據(jù) SuperReal Premix Plus(SYBR Green)說明書配制 qRT-PCR反應(yīng)體系, 用Mx3005P熒光定量PCR儀(Stratagene公司)進(jìn)行擴(kuò)增完成。反應(yīng)條件為: 95°C 15min; 95°C 10s, 58°C 20s,72°C 30s, 40 個(gè)循環(huán); 72°C 10min。采用 2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)(Livaket al, 2001), 其中ΔCt = Ct(目的基因)－Ct(內(nèi)參基因), ΔΔCt =ΔCt(感染組)-ΔCt(對(duì)照組)。應(yīng)用SPSS 19.0中單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析,P＜0.01表示差異極顯著。應(yīng)用GraphPad Prism 5進(jìn)行柱狀圖的制作。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物Tab.1 Primers used in the experiments

1.6 PtGal的表達(dá)和純化

1.6.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)PtGal序列和pET-21a(+)表達(dá)序列的特征, 設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物PtGal-BD-F/R(表 1)。上游引物 5′端含NdeI酶切位點(diǎn),下游引物5′端含XhoI酶切位點(diǎn)。以肝胰腺cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng), 將產(chǎn)物純化后克隆至pMD19-T載體, 篩選陽性克隆并測(cè)序。再用常規(guī)酶切連接方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-21a(+)-PtGal, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序, 同時(shí)保種待用。

1.6.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分析 取30μL上述保存的菌液, 接種于 3mL LB液體培養(yǎng)基中(含有100μg/mL 氨芐青霉素), 37°C, 250r/min 過夜培養(yǎng), 第二天取新鮮菌液繼續(xù)分管培養(yǎng), 37°C 250r/min恒溫?fù)u至OD600達(dá)到0.6—0.8時(shí), 加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo), 同時(shí)設(shè)置未誘導(dǎo)組, 分別放至15°C搖床培養(yǎng)16h, 37°C搖床培養(yǎng)4h, 8000r/min 離心收集菌體,2倍體積PBS重懸菌體, 加入終濃度為1mg/mL溶菌酶后超聲破碎, 分別取全細(xì)胞裂解液及經(jīng)離心處理的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6.3 蛋白純化與LC-MS鑒定 37°C大量培養(yǎng)重組菌液, 加入終濃度為 1mmol/L的 IPTG, 移至 15°C搖床繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16h并收集菌體。純化重組蛋白采用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白),按照試劑盒說明依次進(jìn)行裝柱、平衡、菌體裂解、離心、上柱、沖洗、洗脫等。收集洗脫蛋白液, SDS-PAGE分析純化效果, 并切下目的條帶, 進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.7 ELISA檢測(cè)重組蛋白rPtGal與不同細(xì)菌及真菌的結(jié)合

參考王鵬等(2014)的方法略作修改, 所用菌株為革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌, 枯草芽孢桿菌), 革蘭氏陰性菌(溶藻弧菌, 副溶血弧菌, 哈維氏弧菌, 鰻弧菌, 大腸桿菌, 嗜水氣單胞菌), 真菌(酵母菌)。具體步驟如下: 將各菌株培養(yǎng)到 OD600為 1.0左右, 并用包被液重懸使其終濃度為5×108ind/mL。按100μL/孔將菌液加入 96孔酶標(biāo)板, 4°C孵育過夜。用PBST(含 0.5mL/L Tween20的 PBS)洗液滿孔洗滌3—4次, 每次3—5min。然后每孔加入200μL含3%BSA的PBS, 置于37°C水浴鍋封閉3h, 同上洗滌。各孔加入不同濃度的重組蛋白 PtGal (16μg/mL倍比稀釋至 0.5μg/mL)100μL, PBS 作為陰性對(duì)照, 30°C 孵育2h, 同上洗滌; 每孔加入100μL一抗His-tag抗體(1∶1000, V/V), 37°C 溫育 1h, 同上洗滌; 再加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(H+L)(1∶250, V/V), 37°C溫育1h, 同上洗滌; 每孔加入200μL TMB顯色液, 避光孵育 10—30min, 然后每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液中止反應(yīng), 于450nm測(cè)定吸光度, 將至少2倍于對(duì)照讀數(shù)的結(jié)果定義為陽性, 結(jié)合指數(shù)定義為: 蛋白的A450讀數(shù)/PBS的A450讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 三疣梭子蟹半乳糖凝集素基因PtGal的序列特征

根據(jù)克隆測(cè)序拼接得到 PtGal全長(zhǎng)為 875bp(GenBank 登錄號(hào): KU648403), 包括 5′-UTR 76bp、編碼區(qū)、3′-UTR 123bp和poly(A)組成, 其 ORF編碼含有222個(gè)氨基酸殘基的蛋白(圖1a)。其理論分子量為23529.4Da, 等電點(diǎn)pI為5.21。SMART檢索表明該蛋白包含一個(gè)半乳糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域, 位于N端16—142位氨基酸, 靠 C端有兩個(gè)富含脯氨酸/甘氨酸低復(fù)雜區(qū),分別為150—164及195—220位氨基酸(圖1b)。和其它半乳糖凝集素相似, PtGal沒有信號(hào)肽, 但它有一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn132-Ile133- Ser134-Ser135)。序列同源性在線比對(duì)結(jié)果顯示, PtGal編碼的氨基酸序列與其它甲殼類具有較高的相似性, 如與中華絨螯蟹Eriocheir sinensis 的相似性為77%, 與凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei的相似性為66%, 與日本囊對(duì)蝦Marsupenaeus iaponicus的相似性為58%。運(yùn)用BioEdit軟件制作 PtGal基因編碼的氨基酸序列與上述甲殼類氨基酸序列比對(duì)圖(圖2), 結(jié)果顯示galectin糖結(jié)合區(qū)高度保守。

2.2 三疣梭子蟹PtGal的表達(dá)分析

PtGal基因組織表達(dá)分析: 以β-actin為內(nèi)參基因檢測(cè)了 PtGal mRNA在健康梭子蟹個(gè)體不同組織中的表達(dá)差異性(圖3), 結(jié)果表明: PtGal mRNA在眼柄中沒有表達(dá), 在肝胰腺、鰓、肌肉、腸、胃、心、性腺中都有表達(dá), 但表達(dá)量存在明顯的差異。以肝胰腺的表達(dá)量為參考, PtGal在性腺中的表達(dá)量最高, 為肝胰腺的51.65倍(P＜0.01), 其次是在肌肉中, 為肝胰腺的 28.4 倍(P＜0.01)。

圖1 PtGAL的全長(zhǎng)cDNA、推導(dǎo)的氨基酸序列及SMART預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequence of PtGAL and the graph predicated by SMART

PtGal在溶藻弧菌感染后的表達(dá)模式: 以三疣梭子蟹肝胰腺為靶組織, qRT-PCR分析PtGal基因在溶藻弧菌感染后不同時(shí)間表達(dá)量的變化, 結(jié)果表明, 溶藻弧菌感染后 3h, PtGal的表達(dá)已開始慢慢的上調(diào),于12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值, 然后慢慢回落, 總體表現(xiàn)為先升高、后降低的趨勢(shì)。

2.3 重組蛋白PtGal的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

圖2 不同物種Galectin 氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment by BioEdit

圖3 PtGal在不同組織中的表達(dá)分布Fig.3 Distribution of PtGal gene in different tissues of P.trituberculatus measured by Quantitative Real-time PCR

原核表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-21a(+)-PtGal, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后, 利用SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白rPtGal的表達(dá)(圖5), 結(jié)果發(fā)現(xiàn): 宿主菌的蛋白表達(dá)譜發(fā)生了變化, 該蛋白在37°C誘導(dǎo) 4h時(shí)主要為包涵體表達(dá), 而在 15°C誘導(dǎo)16h檢測(cè)到可溶性表達(dá)。由于重組蛋白帶有一個(gè) His標(biāo)簽, 所以目的蛋白的分子量略大于其預(yù)測(cè)的理論分子量, 約為26.kDa。利用Ni-Agarose技術(shù)對(duì)超聲波破碎菌體上清中的重組蛋白進(jìn)行分離純化, 電泳檢測(cè)顯示在目的帶位置有一條單一主帶, 這與預(yù)期結(jié)果一致。純化的目的蛋白得率約為 1.5mg/L。

2.4 重組蛋白rPtGal的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

為了驗(yàn)證上述蛋白譜帶就是重組目的蛋白, 對(duì)純化蛋白普帶進(jìn)行了膠內(nèi)酶解及 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析鑒定, 結(jié)果表明所切下的重組蛋白有三個(gè)肽段與三疣梭子蟹半乳糖凝集素推導(dǎo)的氨基酸序列完全匹配, 其中圖 6為匹配序列-RAAGWGQEEAT SSPAFARG-的二級(jí)質(zhì)譜圖。由此可以判定, 上述蛋白條帶即為重組表達(dá)的目的蛋白rPtGal, PtGAL成功地獲得了體外重組分泌表達(dá)。

圖4 溶藻弧菌感染后PtGal在肝胰腺中的表達(dá)情況Fig.4 PtGal mRNA expression level after V. alginolyticus challenge in hepatopancreas

圖5 PtGal在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig.5 Expression and purification of the target fusion protein

圖6 重組目的蛋白中與PtGal相匹配肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 Characteristic spectrum of matched peptide fragments recombinant protein with PtGal

2.5 重組蛋白rPtGal與不同細(xì)菌及真菌的相互作用

為了檢測(cè) rPtGal能否與病原菌進(jìn)行相互作用,我們分別使用不同濃度的重組蛋白與革蘭氏陽性菌代表菌2株、革蘭氏陰性菌6株(代表株大腸桿菌及海水常見弧菌類)以及真菌(酵母菌)進(jìn)行孵育, 然后進(jìn)行 ELISA檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)蛋白會(huì)隨著濃度的升高更好地與病菌結(jié)合, 結(jié)合指數(shù)最高達(dá)到 8.9, 但每種菌的結(jié)合指數(shù)有一個(gè)高峰, 除了溶藻弧菌和哈維氏弧菌在蛋白濃度為2μg/mL時(shí)結(jié)合指數(shù)達(dá)到最高時(shí), 其它均為8μg/mL時(shí)達(dá)到高峰(圖7)。

3 討論

圖7 rPtGal與細(xì)菌及真菌的結(jié)合Fig.7 Binding of rPtGal to bacteria and fungus

半乳糖凝集素galectin是一種不依賴于鈣離子的可溶性凝集素, 為 S型凝集素, 由于其與β-半乳糖苷的特殊親和力而得名(Barondes et al, 1994), 盡管其結(jié)構(gòu)上與其它凝集素有不同, 但所有的凝集素成員都含有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu), 稱為糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域 CRD,賦予其結(jié)合糖結(jié)構(gòu)的活性(Zelensky et al, 2005), 發(fā)揮著多種多樣的生物學(xué)功能。本研究從三疣梭子蟹中篩選出了一個(gè)半乳糖凝集素基因 PtGal, 通過對(duì)其序列及蛋白結(jié)構(gòu)的分析, 發(fā)現(xiàn)PtGal與已知的無脊椎動(dòng)物半乳糖結(jié)構(gòu)相似, 沒有信號(hào)肽而且只含有典型的半乳糖凝集素結(jié)構(gòu)域, 這一點(diǎn)與脊椎動(dòng)物的半乳糖凝集素結(jié)構(gòu)也一致, 推測(cè)PtGal也是通過非經(jīng)典的分泌方式到達(dá)細(xì)胞外(Almkvist et al, 2002), 但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。SMART分析結(jié)果表明PtGal 在N末端有一個(gè)糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域 CRD, 在 C末端有兩個(gè)富含脯氨酸/甘氨酸的低復(fù)雜區(qū)域(圖 1b), 與已知的哺乳動(dòng)物嵌合型半乳糖凝集素結(jié)構(gòu)相似, 但 CRD位置相反, 哺乳動(dòng)物的CRD是在C末端(Yang et al, 2008),這一現(xiàn)象在南美白對(duì)蝦 LvGal及中華絨螯蟹 EsGal等結(jié)構(gòu)中也被發(fā)現(xiàn)(Cha et al, 2015; Wang et al, 2016)。與其它甲殼類半乳糖凝集素進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)PtGal的結(jié)構(gòu)域高度保守, 且與糖結(jié)合的氨基酸殘基也都高度保守, 符合半乳糖凝集素家族成員具有保守糖識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征(Leffler, 2001)。

qRT-PCR檢測(cè)PtGal在三疣梭子蟹各組織中的表達(dá), 在被檢測(cè)的 8種組織中, 除了眼柄中沒有表達(dá),在健康個(gè)體的不同組織都有表達(dá), 這一點(diǎn)與其它甲殼類或貝類的galectin一樣(Wang et al, 2011; 鄭利兵等, 2015), 但表達(dá)量存在顯著的差異, 其在性腺中表達(dá)量最高, 在肝胰腺中的表達(dá)量最低, 說明 PtGal基因的表達(dá)不具有組織特異性, 但表達(dá)量具有一定的組織特異性。已有的研究表明, 水生動(dòng)物經(jīng)病原微生物感染后, 其體內(nèi)的半乳糖凝集素基因 mRNA水平上調(diào), 如經(jīng)鰻弧菌或藤黃微球菌感染的海灣扇貝, 其AiGal1、AiGal2 mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)(Song et al,2010; Song et al, 2011); 經(jīng)溶藻弧菌感染的南美白對(duì)蝦, 其Lvgalectin mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)(Cha et al,2015)等等。本研究中溶藻弧菌感染三疣梭子蟹后,PtGal基因的表達(dá)在3h已開始慢慢的上調(diào), 于12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值, 為0h的3.5倍, SPSS進(jìn)行差異性分析為差異不顯著。而 Song等(2010)報(bào)道的海灣扇貝感染鰻弧菌后 9h, 其 AiGal1表達(dá)量達(dá)到最高, 為0h的1.52倍, 差異顯著(P＜0.05); 感染藤黃微球菌后18h, AiGal1表達(dá)量達(dá)到最高, 為0h的2.89倍, 差異極顯著(P＜0.01), 分析原因?yàn)楸驹囼?yàn)的樣本比較小,而組間5個(gè)樣本表達(dá)量差異較大, 導(dǎo)致其顯著性水平受到了影響。

為了進(jìn)一步探索PtGal的功能, 我們重組表達(dá)并純化了 rPtGal, 經(jīng)質(zhì)譜鑒定為目的蛋白后, 并用ELISA方法測(cè)定了純化蛋白與病原菌的結(jié)合試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn) rPtGal對(duì)革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌的菌體都有明顯的結(jié)合, 而且這種結(jié)合會(huì)隨著蛋白濃度的增加而增強(qiáng), 但與每種菌的結(jié)合到了最適濃度時(shí), 結(jié)合指數(shù)會(huì)有所下降(圖7)。這與Wang等(2016)報(bào)道的ELISA測(cè)定的中華絨螯蟹rEsGal與病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)LPS、PGN、GLU 的結(jié)合, 在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性模式有所不同;也與 Cha等(2015)報(bào)道的 ELISA測(cè)定的凡納濱對(duì)蝦rLvgalectin與多糖LPS、LTA及PGN的結(jié)合, 在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性模式有所不同, 分析原因可能是半乳糖識(shí)別結(jié)合能力依賴于微生物表面的分布密度、呈現(xiàn)形式等, 而單獨(dú)測(cè)定與這些表面多糖的結(jié)合不受其它因素影響, 會(huì)隨著蛋白濃度的增加而增強(qiáng)(Shi et al, 2014), 但我們所用的為病原菌菌體, 一方面不同菌的表面多糖密度和結(jié)構(gòu)有所不同, 因此會(huì)有不同的結(jié)合指數(shù)及最適結(jié)合指數(shù); 另一方面蛋白與菌體表面多糖結(jié)合時(shí), 會(huì)引起本身或其它產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)變化, 因而影響蛋白與多糖的結(jié)合, 以至于菌體與蛋白的結(jié)合不具有蛋白濃度依賴性, 具體結(jié)合指數(shù)及強(qiáng)度的不同, 還有待進(jìn)一步研究。

綜上, 本研究從三疣梭子蟹肝胰腺中克隆獲得了一個(gè)半乳糖凝集素基因, 并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式進(jìn)行了分析, 對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了原核重組表達(dá)及活性分析, 初步探討了其在梭子蟹先天免疫中的可能作用, PtGal其它功能如其在梭子蟹生殖發(fā)育中的作用還需進(jìn)一步研究, 這些工作為探索三疣梭子蟹半乳糖凝集素精確的生物功能提供有用的信息和資料。

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