王明龍, 章建林

作者單位：200003 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院 整形外科

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促進(jìn)自體脂肪移植血管形成的研究進(jìn)展

王明龍, 章建林

脂肪移植； 血管形成； 自體脂肪

臨床上對于外傷、腫瘤、先天性發(fā)育不良等原因?qū)е碌能浗M織缺失，或正常情況下的美容手術(shù)，常用的治療方法有皮瓣移植、假體置入、軟組織填充等。軟組織填充由于創(chuàng)傷小、效果佳、可塑性強(qiáng)，而成為較常用的治療手段之一。臨床常用的填充物，如硅膠、膠原蛋白和玻璃酸鈉等均存在排斥反應(yīng)，或術(shù)后療效不持久的缺點。自體脂肪移植則是解決以上問題的有效辦法，自體脂肪組織具有來源豐富、取材方便、無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點。但目前自體脂肪移植的臨床效果并不理想，游離脂肪細(xì)胞移植，早期受區(qū)血供差等原因，導(dǎo)致其存活率低，部分液化、壞死、鈣化，吸收率為30%～70%，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，如何促進(jìn)移植脂肪細(xì)胞血管化，從而提高存活率成為臨床脂肪細(xì)胞移植迫切需要解決的問題。脂肪組織血液供應(yīng)特點：⑴成熟的脂肪組織中，僅10%單房成熟脂肪細(xì)胞占據(jù)超過90%的空間體積，其余90%細(xì)胞占據(jù)10%空間體積。體積龐大的脂肪細(xì)胞垂掛在血管支架上，每個細(xì)胞都有單獨的血管供應(yīng)系統(tǒng)與主干相連，有學(xué)者形象地將脂肪組織結(jié)構(gòu)比喻為“葡萄串”樣結(jié)構(gòu)。⑵成熟脂肪細(xì)胞是高能耗細(xì)胞，非常脆弱，對血液供應(yīng)的要求很高。⑶在移植物與宿主建立充分的血供之前，脂肪組織只能靠周圍組織液的浸潤和滲透來維持營養(yǎng)供應(yīng)，這種供應(yīng)的距離極為有限，僅為150～ 200 μm，超過200 μm會出現(xiàn)缺血壞死。由于脂肪組織血供的特殊性，也為脂肪移植血管化的研究帶來了很大困難。

對于脂肪移植存活率及血管化的影響大致與以下4點有關(guān)：⑴移植脂肪的供區(qū)；⑵移植的脂肪的質(zhì)量；⑶受區(qū)(即手術(shù)脂肪移植區(qū))的術(shù)前處理；⑷術(shù)后護(hù)理等。目前各種研究主要在前3個方面。以下就前3點，對目前各種促進(jìn)自體脂肪游離移植成血管化的研究進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。

1 不同供區(qū)脂肪的對移植脂肪血管化的影響

有學(xué)者對機(jī)體各部位皮下脂肪組織的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞的活性、移植后移植物的質(zhì)量及組織形態(tài)學(xué)均無明顯差別。但下腹部與大腿內(nèi)側(cè)脂肪組織中的脂肪細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量較高，并且這些部位的脂肪細(xì)胞具有α2受體[1]，其具有抗脂肪分解及對營養(yǎng)反應(yīng)較低的特性，其移植后存活的可能性較大。目前研究證明，脂肪來源干細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、肝細(xì)胞生長因子、胎盤生長因子、胰島素樣生長因子和血管生成素等[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪來源干細(xì)胞具有促血管化和抗凋亡的潛能。因此，不同部位脂肪對于移植脂肪血管化具有一定的影響。

2 移植脂肪的質(zhì)量

移植脂肪的質(zhì)量不同對移植后脂肪血管化的影響起決定性作用，目前，大部分對于促進(jìn)移植脂肪血管化的研究也主要集中在增強(qiáng)移植脂肪的質(zhì)量方面，主要方法大致為：⑴利用各種細(xì)胞因子、生長因子輔助脂肪移植血管化。⑵各種細(xì)胞因子+脂肪來源干細(xì)胞輔助脂肪移植及各種細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞輔助脂肪移植。⑶組織工程方法增強(qiáng)脂肪移植血管化。

2.1 各種細(xì)胞因子輔助血管化的研究

2.1.1 胰島素對移植脂肪組織成血管的促進(jìn)作用 近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖的作用。增加血管內(nèi)皮生長因子的分泌，并能有效地促進(jìn)大鼠前脂肪細(xì)胞的增殖和分化。研究表明，低濃度胰島素對細(xì)胞的增殖分化和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用，而高濃度的胰島素反而有抑制作用[3-4]。鄧穎等[5]研究表明，微血管免疫組化觀察顯示，脂肪移植10、20 d兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，微血管密度隨著時間的推移增多，微血管增生在移植后前20 d增加較快，20～28 d新生血管增加速度變緩。胰島素微血管密度組明顯大于對照組(P<0.01)，實驗結(jié)果顯示，脂肪移植后10 d，可見明顯的微血管重建現(xiàn)象，胰島素組在移植后20 d，血管生長達(dá)到高峰，28 d時仍有血管生長，但生長變緩慢。對照組微血管生長在移植后28 d達(dá)到高峰，遲于胰島素組。本研究證明，胰島素對自體脂肪移植組織的血管再生起到促進(jìn)作用。2.1.2 成纖維細(xì)胞生長因子輔助移植脂肪血管化 目前對酸性成纖維細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子進(jìn)行研究。申在旭等[6]在脂肪移植隆乳術(shù)中應(yīng)用酸性成纖維細(xì)胞生長因子預(yù)處理的脂肪干細(xì)胞輔助脂肪組織移植，通過與對照組未處理的脂肪干細(xì)胞輔助脂肪移植對比，結(jié)果表明，治療組術(shù)后1、3個月，隆起增加值分別為(13.8±2.9) mm，(12.9±3.6) mm；隆起維持率分別為86.7%、80.0%。對照組術(shù)后1、3個月隆起增加值分別為(12.4±1.7) mm，(11.2±1.4) mm；隆起維持率分別為66.7%，59.5%。對照組脂肪隆起減少更明顯。2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另有研究顯示，酸性成纖維細(xì)胞生長因子可刺激脂肪細(xì)胞增殖分裂，減少脂肪細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生長，增加脂肪的供血。2000年，E Yuksel等認(rèn)為，除了各種因子的促前脂肪細(xì)胞分化增殖作用外，堿性成纖維細(xì)胞生長因子促血管再生的活性，為移植體構(gòu)建了良好的生存環(huán)境，也可能在促進(jìn)移植體存活方面起到了重要作用。靳元嶸和楊瑟飛[7]的研究也證明，堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以更好地促進(jìn)脂肪移植體早期血運(yùn)重建。

2.1.3 血管內(nèi)皮生長因子對移植脂肪組織成血管的促進(jìn)作用 對血循環(huán)重建而言， 血管內(nèi)皮生長因子作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，是血管形成重要的調(diào)節(jié)因子，在新生血管形成過程中起著重要的作用。并且在一些血管內(nèi)皮生長因子撤退性研究中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子撤退后，出現(xiàn)生理性及病理性的血管退化現(xiàn)象，進(jìn)一步證明血管內(nèi)皮生長因子在成血管機(jī)制中的重要作用。血管內(nèi)皮生長因子可促進(jìn)移植組織內(nèi)的血管增生和脂肪細(xì)胞的分化增殖。2011年，JG Rasmussen等研究腺病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子對血管生成的影響，及對游離脂肪移植物存活率的影響，結(jié)果證明，血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)血管的生成，提高了脂肪移植存活率。Chung等[8]將血管內(nèi)皮生長因子包裝到微球體緩釋裝置中，分為3組：血管內(nèi)皮生長因子微球體組、空微球體組、脂肪提取物對照組，皮下注射，第3、6周組織檢測顯示，血管內(nèi)皮生長因子組質(zhì)量和體積都有增加，另兩組質(zhì)量和體積減少；CD31+、伊紅和蘇木精染色觀察，血管內(nèi)皮生長因子微球體組血管密度明顯多于另兩組。有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子和血小板源性生長因子共同作用，可以促進(jìn)脂肪組織血管化。

2.1.4 富血小板血漿對移植脂肪組織成血管的促進(jìn)作用 富血小板血漿是通過離心自體全血，而獲得的血小板濃縮物。富血小板血漿中生成血管的生長因子成分包括：間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等。而其含有的因子也均被研究證明，具有促進(jìn)移植脂肪血管化的作用。Li等[9]的動物研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植組織無炎癥和膿腫形成；實驗組在血管再生、脂肪液化壞死方面都要好于對照組；在l5、30和90 d后，實驗組的移植脂肪的質(zhì)量和體積，均顯著大于對照組(P<0.05)；組織學(xué)觀察得出，在15、180 d后，實驗組的微血管數(shù)量顯著多于對照組(P<0.05)。Willemsen等[10]通過問卷調(diào)查獲取患者的滿意度和結(jié)果。以上研究表明，富血小板血漿混合自體顆粒脂肪組織移植，能加速移植組織早期血管重建，避免纖維化和脂肪細(xì)胞凋亡。

2.1.5 其余對移植脂肪組織血管化具有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子研究 此外，如在紅細(xì)胞生成素、雌激素[11]、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子B、血管生長素、肝細(xì)胞生長因子、透明質(zhì)酸水凝膠等的研究中，大部分研究都得出了可促進(jìn)移植脂肪組織血管化加速的結(jié)論，但對各種生長因子及細(xì)胞因子來說，主要有作用的持續(xù)性和劑量的把控問題。有學(xué)者研究出多次注射及各種微量控釋裝置，將所用的細(xì)胞因子放入控釋裝置，從而減少降解率，并控制局部濃度，最終延長其效用時間。如可降解多孔層結(jié)構(gòu)或預(yù)包埋的微球生物材料等。

2.2 與脂肪干細(xì)胞聯(lián)合移植及各種輔助細(xì)胞因子的作用

2006年，K Yoshimura等提出脂肪來源干細(xì)胞協(xié)同自體脂肪移植的概念。此后對于脂肪來源干細(xì)胞的研究紛紛展開。2.2.1 血管基質(zhì)組分輔助脂肪組織移植血管化 血管基質(zhì)組分是一種混合組分，其中包含多種細(xì)胞、干細(xì)胞和祖細(xì)胞[12]。Kim等[13]的研究表明，血管基質(zhì)組分與脂肪來源干細(xì)胞對于脂肪移植成活起到一定的作用，對移植脂肪的血管化起到了促進(jìn)的作用，雖然脂肪來源干細(xì)胞具有多重分化功能，可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等[14]，但本研究顯示，其新生血管并非脂肪來源干細(xì)胞分化而成。

2.2.2 脂肪來源干細(xì)胞+血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 2007年， CG Yi等利用腺病毒做血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的載體，并混合人類脂肪組織后注入到動物頭皮下。2組對照組則分別注入綠色熒光蛋白基因-人類脂肪組織混合物和生理鹽水。經(jīng)過一系列處理后結(jié)果顯示，實驗組的毛細(xì)血管密度顯著增高(P<0.01)，其脂肪移植組織的質(zhì)量和體積明顯高于對照組(P<0.05)。Lu等[15]利用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞輔助脂肪移植血管化實驗，注入裸鼠背部皮下4個區(qū)域，6個月后，毛細(xì)血管計數(shù)結(jié)果實驗組移植物質(zhì)量較大，脂肪液化壞死及鈣化均明顯少于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。楊波等[16]用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165基因轉(zhuǎn)染脂肪來源干細(xì)胞，促進(jìn)移植脂肪血管化，同樣證明了其有效性。

2.2.3 脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合各種細(xì)胞因子促進(jìn)移植脂肪血管化的方法 脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合富血小板纖維蛋白促進(jìn)移植脂肪血管化[17]，肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞促進(jìn)移植脂肪血管化，重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的脂肪來源干細(xì)胞和前列腺素E1促進(jìn)移植脂肪等。還有多種細(xì)胞因子及生長因子以復(fù)合或轉(zhuǎn)染脂肪來源干細(xì)胞的方式，用于促進(jìn)脂肪移植的血管化，其中大部分研究都得出了可促進(jìn)移植脂肪組織血管化加速的結(jié)論，且解決了單獨細(xì)胞因子早期降解及最適劑量等時效問題。

2.3 組織工程方法促進(jìn)脂肪移植血管化的方法

2.3.1 脂肪組織工程促進(jìn)脂肪移植血管化 組織工程技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于脂肪移植術(shù)，但核心問題仍然是血管化的問題，機(jī)體脂肪組織高度血管化，血流供應(yīng)和毛細(xì)血管密度是骨骼肌組織的2～3倍。因此，學(xué)者們達(dá)成了一種共識：組織工程組織的構(gòu)建受限于構(gòu)建組織的血管化程度。如何解決組織工程脂肪組織的血管化問題，學(xué)者們做出了不同的嘗試。有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子在纖維素支架材料中聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯促進(jìn)組織工程脂肪血管化，而這正是脂肪細(xì)胞再生和維持所必需的。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可使種子細(xì)胞表達(dá)重組促血管生成生長因子，并釋放促血管生成生長因子，提高組織工程脂肪血管化水平。1999年，LO Shea等將編碼血小板源性生長因子的質(zhì)粒DNA引入聚乳酸乙酸共聚物支架中，體內(nèi)外實驗均觀察到組織血管形成加速。2000年，MJ Wissink等利用肝素與堿性成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合，特性構(gòu)建堿性成纖維細(xì)胞生長因子控釋體系；將堿性成纖維細(xì)胞生長因子控釋體系結(jié)合到膠原支架上埋植于大鼠皮下，支架內(nèi)血管長入明顯加快。

2.3.2 組織工程室 2003年，SO Hofer等將在體血管放入生物惰性材料，制作有一定硬度的組織工程室，為培養(yǎng)組織提供血管基礎(chǔ)、營養(yǎng)物質(zhì)和生長所需空間，稱為血管化的組織工程室。2007年，JH Doldercr等在大鼠體內(nèi)構(gòu)建了以腹壁下淺動脈為蒂的脂肪瓣在組織工程室內(nèi)自發(fā)生長模型，6周后組織工程室內(nèi)脂肪瓣體積從0.08 ml增加到1.20 ml。ML Moya等將成纖維細(xì)胞生長因子-1添加到軟藻酸鹽微支架上，發(fā)現(xiàn)與加入單純FGF-1相比，能觀察到更明顯的血管化。組織工程室不僅為室內(nèi)組織生長提供所需空間，促進(jìn)血管出芽，增加室內(nèi)組織的體積，構(gòu)建出相對獨立空間，還可進(jìn)行進(jìn)一步的實驗干預(yù)，如局部應(yīng)用一些生長因子或誘導(dǎo)因子加速室內(nèi)組織生長。

2.3.3 組織工程共培養(yǎng)體系 脂肪組織工程中的共培養(yǎng)策略，主要是將種子細(xì)胞與內(nèi)皮或內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)，以在工程脂肪中建立良好的血供為目的。一種細(xì)胞釋放一種特定的物質(zhì)，與另一種細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)其產(chǎn)生一定的生物性效應(yīng)[18]。Strassburg等[19]的研究顯示，脂肪來源干細(xì)胞增強(qiáng)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的成血管能力。2011年，JH Choi等的研究表明，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對脂肪來源干細(xì)胞的成脂功能具有促進(jìn)作用。雖然共培養(yǎng)體系促進(jìn)移植脂肪的血管化更有優(yōu)勢，且近期也應(yīng)用到多領(lǐng)域，但脂肪組織共培養(yǎng)體系中內(nèi)皮祖細(xì)胞較難獲取，兼容兩種細(xì)胞特性的生物支架較少，及2種細(xì)胞的培養(yǎng)比例等問題仍待解決。

3 受區(qū)(即手術(shù)脂肪移植區(qū))的術(shù)前處理

采用負(fù)壓真空隆乳裝置隆乳已有100多年歷史。最近的brava負(fù)壓真空隆乳裝置聯(lián)合脂肪移植在臨床的應(yīng)用取得了可觀的效果。 Heit等[20]的基礎(chǔ)研究解釋了以上實驗成功的原因。以小鼠為實驗對象，通過連續(xù)長時間的負(fù)壓真空吸引結(jié)果顯示，外擴(kuò)張21 d局部組織出現(xiàn)腫脹；28 d是時皮下脂肪層厚度倍增，MRI結(jié)果一樣。擴(kuò)張部位皮下層細(xì)胞倍增，脂肪細(xì)胞數(shù)增至原來的2.2倍；血流灌注顯示，28 d時，實驗組皮下組織血管密度為對照組的1.9倍，處理組7 d時，觀察到機(jī)械刺激作用導(dǎo)致血管構(gòu)筑，血管以再定位和官腔增大的形式發(fā)生強(qiáng)烈重塑。

4 討論

通過以上文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，無論是供區(qū)的選擇，添加各種細(xì)胞因子提高移植脂肪質(zhì)量，脂肪組織工程技術(shù)，還是術(shù)前受區(qū)的真空負(fù)壓擴(kuò)張?zhí)幚?，最終目的都是以促進(jìn)脂肪移植的血管化，提高脂肪移植存活率。以上總結(jié)了近年來較有潛力的促自體脂肪移植組織血管再生的物質(zhì)及其研究方法，大部分都取得了一定的成果，但有很多的問題尚未解決：⑴超早期血管化，超早期移植脂肪缺氧與營養(yǎng)供應(yīng)。⑵移植脂肪中心壞死區(qū)的保存。人類脂肪組織抽吸物在移植后3～4周按組織學(xué)分類可分為3種區(qū)域：外周區(qū)域(活性脂肪細(xì)胞)、過渡區(qū)域(炎性過程)和中央?yún)^(qū)域(壞死區(qū)域)。移植早期的外周區(qū)細(xì)胞由周圍原有組織滲透的血漿提供的代謝環(huán)境保持活性，其滲透的范圍為距離軟組織300 μm內(nèi)[21]。⑶移植的脂肪最終細(xì)胞是原移植細(xì)胞存活,還是新生的脂肪細(xì)胞，再生細(xì)胞的數(shù)量、比例、最大可達(dá)到的體積和數(shù)量及其機(jī)制問題。大多數(shù)研究顯示,在最初移植的脂肪經(jīng)歷體積減小后一般在5～7 d會有體積的增加。綜上所述,盡管我們已經(jīng)做了很多研究探索脂肪移植血管化的問題，盡管取得了一些成果，但上述關(guān)鍵問題仍亟待解決。

目前研究普遍認(rèn)為，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，因此,又稱為血管內(nèi)皮干細(xì)胞,是參與生理性及病理性血管形成最主要的細(xì)胞。然而EPC生理狀態(tài)下較少存在于外周，EPC的體外培養(yǎng)較困難，而且長期培養(yǎng)后易分化,失去成血管能力,限制了其應(yīng)用。大量研究表明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α是EPC的強(qiáng)大趨化劑，其通過與EPC表面的特異性基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α特異性受體結(jié)合，在短時間內(nèi)即可迅速動員骨髓中EPC進(jìn)入外周血，并介導(dǎo)外周血中EPC遷移、歸巢到缺血缺氧組織局部，從而參與了血管新生及損傷血管的重新內(nèi)皮化[22]。由此我們設(shè)想，可以構(gòu)建一種承載基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α基因的病毒轉(zhuǎn)染脂肪來源干細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染的脂肪來源干細(xì)胞混合脂肪顆粒共同移植，在受區(qū)缺氧刺激下，脂肪來源干細(xì)胞大量分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α，從而趨化EPC進(jìn)入移植區(qū)參與血管構(gòu)建，加速移植物早期血管建立，最終提高移植脂肪存活率。

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上海市自然科學(xué)基金資助項目(124119a0701)

作者單位：200003 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院 整形外科

王明龍(1987-)，男，遼寧朝陽人，碩士研究生.

章建林，200003，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院 整形外科，電子信箱:zhangjianlin9@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.11.016

2016-09-21)