張雪梅， 趙 婧， 趙銀河

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和工程中心， 昆明650201）

全球開花植物已知有250 000多種，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中占有明顯的優(yōu)勢?；ㄆ鞴偈侵参锷尺^程中的重要的器官，已經(jīng)成為進(jìn)化論者和生態(tài)學(xué)家的研究焦點(diǎn)。對授粉方式的適應(yīng)，花器官發(fā)生了巨大變化，有利于對被子植物花器官進(jìn)化的進(jìn)一步了解。

開花是高等植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的一個重要過程，即受外界環(huán)境因素的影響，又受內(nèi)在基因的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)MADS－box基因在花發(fā)育過程中起著重要作用［1］。隨著花器官發(fā)育研究的深入，有關(guān)花器官發(fā)育的相關(guān)基因研究已取得了突破性的進(jìn)展，這主要體現(xiàn)在通過對雙子葉植物擬南芥和金魚草的花同源異型突變體的研究發(fā)現(xiàn)上。這些雙子葉植物的花由同心圓的四輪結(jié)構(gòu)組成，從外向內(nèi)依次為：第1輪萼片，第2輪花瓣，第3輪雄蕊，第4輪心皮［2］?；ㄆ鞴俚耐串愋瓮蛔凅w有一個共同的特征，即相鄰兩輪器官的發(fā)育同時(shí)受到影響。按照變異器官分布的空間順序，這些突變體分為三類：第一類突變體的萼片轉(zhuǎn)化為心皮，花瓣轉(zhuǎn)化為雄蕊，導(dǎo)致花的組成由外至內(nèi)依次為心皮－雄蕊－雄蕊－心皮；第二類突變體將花瓣轉(zhuǎn)化為萼片，雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮，花組成為萼片－萼片－心皮－心皮；第三類突變體雄蕊轉(zhuǎn)化為花瓣，心皮轉(zhuǎn)化為類似萼片的結(jié) 構(gòu)，花組成為萼片－花瓣－花瓣－萼 片［3－4］。通 過ABC功能基因的轉(zhuǎn)化，無法使葉片轉(zhuǎn)變成花器官，因此，植物從營養(yǎng)器官到花器官轉(zhuǎn)變的過程還需要其他花發(fā)育相關(guān)基因的參與［2－3］。在尋找與 ABC類基因相互作用的蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)了這類SEPALLATA（SEP）基因。目前ABCE模型能成功地解釋花器官發(fā)育，即A＋E控制萼片的發(fā)育，A＋B＋E控制花瓣的發(fā)生，B＋C＋E控制雄蕊的發(fā)育，C＋E決定心皮的發(fā)育［5］。另外，胚胎的發(fā)育由D和E類基因共同控制。在擬南芥中，E類基因有4個，SEPALLATA 1（SEP 1），SEP 2，SEP 3，SEP 4［3］，它們在功能上是冗余的，在四輪花器官中都表達(dá)，單獨(dú)突變sep 4沒有明顯的表型變化，如果sep 1、sep 2、sep 3、sep 4四類基因都突變，那么，所有花器官變成葉狀的結(jié)構(gòu)，表明擬南芥的SEP 1、SEP 2、SEP 3、SEP 4基因都與花發(fā)育相關(guān)。因此，擬南芥花器官的發(fā)育是受SEP類基因與A、B、C類基因的共同調(diào)控。SEP類轉(zhuǎn)錄因子不僅能夠與B、C類蛋白共同作用，調(diào)控第三和第四輪花器官的發(fā)育，還能夠與D類基因編碼蛋白相互作用，調(diào)控胚珠的發(fā)育［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，sep 1、sep 2、sep 3 三重突變體具有和stk、shp 1、shp 2三突變體類似的胚珠結(jié)構(gòu)，此外，STK和SHP等C類基因編碼蛋白都可能和SEP－3－蛋白形成聚合體，這表明SEP 與D類基因共同決定胚珠的發(fā)育［3，5］。除了在擬南芥中的作用外，在其它植物中也發(fā)現(xiàn)SEP類基因在花發(fā)育的功能。

蓮瓣蘭（Cymbidium tortisepalum）是中國春蘭的一個新品系，大雪素為滇蘭四大名品之首，寬葉蓮瓣素白花素心品種，并且于春節(jié)期間開花［6］，俗稱大素心，已有數(shù)百年的栽培歷史，原產(chǎn)于滇西的部分地區(qū)［6］。本研究以蓮瓣蘭大雪素為實(shí)驗(yàn)材料，用RACE方法快速地克隆全長cDNA，從花的器官材料中分離開花相關(guān)SEP 1基因并進(jìn)行克隆。通過對蓮瓣蘭大雪素SEP 1基因的初步研究，了解SEP 1基因是植物花器官調(diào)控途徑的一個重要因子。

1 材料與方法

1．1 材 料

1）所采用材料為蓮瓣蘭大雪素（Cymbidium tortisepalum），是中國蘭花中的優(yōu)秀品種，也是滇蘭蓮瓣蘭中的一顆明珠，是蓮瓣蘭代表品種。它盛開在元旦春節(jié)花，它的花枝高挺出架，潔白的花朵顯得格外清雅、素凈，具有暗香［9］。

2）必要培養(yǎng)液的配置。200 m L LB培養(yǎng)液的配制：2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、1 g NaCl（p H＝7），若配制固體培養(yǎng)基則加3 g瓊脂。

3）實(shí)驗(yàn)設(shè)備。計(jì)算機(jī)、PCR儀、電泳槽、離心機(jī)、振蕩床、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、滅菌鍋、烘箱、移液設(shè)備、容器、刮子等。

1．2 方 法

1．2．1 RNA的提取

選用 TransZol Plant（TransGen Biotech，Beijing，code＃ET 121－01）提取大雪素花器官的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。

1．2．2 特異性引物設(shè)計(jì)

3′－RACE CDC Primer：5－AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC（T）30 VN－3

SEP－F 5－TTGAAAAGAGAGTAAGAGATGGGA－3

SEP－R 5－AACTTCTGATTTGCCCCCC－3

1．2．3 cDNA的合成

按SMART RACE c DNA Amplication Kit操作流程進(jìn)行。3’SMART－RACE PCR加入以下試劑于滅菌的PCR反應(yīng)管中：Total RNA，2μg；10×Advantage PCR Buffer，5μL；d NTP mix（10 mmol／L），4μL；Primers（10μmol／L），各0．75μL；Advantage 2 Polymerase Mix，2μL；dd H2O 17．75μL?；旌弦陨显噭虝弘x心，將反應(yīng)管放在預(yù)熱的PCR儀上，按下列程序進(jìn)行循環(huán)：35的循環(huán)；94℃×3 min 30 s，94℃×20 s，58℃×30 s，72℃×1 min，72℃×7 min，4℃×∞循環(huán)結(jié)束后，取3μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測合成情況。

1．2．4 電泳檢測，割膠回收目的片段

取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，克隆方法參照文獻(xiàn)［7］，隨機(jī)篩選白色菌落，送北京華大基因公司進(jìn)行測序。

1．2．5 SEP 1基因的表達(dá)

選用 TransZol Plant（TransGen Biotech，Beijing，code＃ET 121－01）分別提取苞葉、花萼、花瓣，合蕊柱以及授粉后3天的合蕊柱的RNA，然后進(jìn)行cDNA的合成。選用特異引物進(jìn)行RT－PCR．，其引物序列如下：

SEP－F 5－ACGCATGTTGTAGGATACG－3

SEP－R 5－AACTTCTGATTTGCCCCCC－3

PCR反應(yīng)條件與克隆該基因一樣，反應(yīng)終止取5止的PCR產(chǎn)物，用1．0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 RACE的結(jié)果

圖1 SEP 1基因全長電泳結(jié)果

用轉(zhuǎn)錄組測序方法獲得了SEP 1基因的序列，在NCBI http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／database 中 進(jìn)行功能預(yù)測是SEP 1 5′片段序列。為了進(jìn)一步研究這些基因的功能及表達(dá)特性，克隆了全長序列cDNA。對瓣蘭大雪素不同發(fā)育時(shí)期的花原基、花蕾以及合蕊柱混合樣品進(jìn)行Total RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳方法監(jiān)測RNA的質(zhì)量；以Total RNA為模板，按照RACE試劑盒的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到3′端和5′端cDNA模板，對3′端的cDNA模板進(jìn)行特異引物和Outprimer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得3′端片段，5′端與3′端的序列進(jìn)行拼接，再一次進(jìn)行全長cDNA的克隆，對菌液PCR進(jìn)行擴(kuò)增，見圖1。

2．2 序列比對

通過測序獲得了功能預(yù)測為SEP 1基因的全長cDNA。這個基因cDNA全長為1 047 bp，包含有編碼框，207 bp的5′UTR和87 bp 3′UTR 的非翻譯區(qū)，并具有olig（d T）的尾巴，具有完整的開放閱讀框 （ORF）753 bp，編碼250氨基酸的蛋白質(zhì)，該基因序列從起始密碼子ATG，如圖2。從蓮瓣蘭大雪素中分離出來的SEP 1基因，是屬于MADS－box基因。

2．3 SEP 1基因在各個花器官的表達(dá)

從圖3可以看出，SEP 1基因除了授粉前合蕊柱和授粉后3 d合蕊柱，在其他各個花器官中都沒有表達(dá)，包括包裹在花序外面的苞葉，而在授粉前的合蕊柱中表達(dá)量最高。

圖2 SEP 1基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列

圖3 SEP 1基因在各個花器官的表達(dá)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以蓮瓣蘭大雪素為材料分離出SEP 1基因，通過RACE方法快速克隆出全長cDNA，確定該基因?yàn)? 047 bp的全長cDNA序列，編碼250個氨基酸。獲得的序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Blastx分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)含有典型的MADS結(jié)構(gòu)域（MADS－MEF 2－like）和 K結(jié)構(gòu)域，這兩個保守結(jié)構(gòu)域是MADS－box基因家族的典型特征，具有高度的保守性，與MADS－box家族中從其他植物提取出的SEP 1基因的同源性很高［3］。MADS－box 結(jié)構(gòu)域在MADS－box蛋白因子的N末端，大約有60個氨基酸組成具有高度保守結(jié)構(gòu)域，可以和特異DNA結(jié)合［4］，因此，MADS－box 結(jié)構(gòu)域具有 DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化的功能［5］。

SEP類基因?qū)儆贓類基因，在擬南芥中已研究得比較清楚。用RACE方法從蝴蝶蘭花葶和春蘭中克隆并己經(jīng)證明SEP基因參與花器官發(fā)育和植物開花的調(diào)控［8］。而從蓮瓣蘭大雪素中還沒有研究過，本研究結(jié)果顯示，該序列還與其他植物上克隆出來的SEP 1基因有很高的同源性［9］。在表達(dá)模式上，SEP 1在四輪中花器官中都表達(dá)，這與高等真雙子植物中分離出來的SEP 1不一致，這也許與蘭科比較復(fù)雜的花器官結(jié)構(gòu)有關(guān)系，將為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)，并且了解SEP 1在蓮瓣蘭大雪素中的調(diào)控。

雖然對花發(fā)育相關(guān)基因的研究已經(jīng)有幾十年，但是對于SEP基因功能的研究仍然存在著很多問題，在蘭花上的研究更少見，并且蘭花SEP 1基因的克隆以及SEP 1與開花相關(guān)基因、蛋白的作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究，另外，SEP 1基因可以誘導(dǎo)開花，但其分子機(jī)制和在蓮瓣蘭花中的調(diào)控機(jī)制還有待研究。

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