紅細(xì)胞脂筏成分分離的原子力顯微鏡觀測

郝長春, 王佳靜, 朱玲青, 穆文寧, 孫潤廣

(陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院, 陜西 西安 710119)

摘要：用原子力顯微鏡觀測紅細(xì)胞，利用蔗糖密度梯度離心法在4 ℃下從人血紅細(xì)胞中分離出不溶于去垢劑Triton X—100的脂筏成分。用紅細(xì)胞脂筏成分制備Langmuir-Blodgett(LB)單層膜,并進(jìn)行原子力顯微鏡觀測, 結(jié)果表明: 紅細(xì)胞呈雙凹圓盤狀,直徑約為7.5 μm。脂筏成分呈小的聚集體結(jié)構(gòu), 大小約210 nm。單層膜結(jié)構(gòu)形態(tài)隨著表面壓力的增加而變化。在較低表面壓力時呈現(xiàn)出液態(tài)無序和液態(tài)有序共存相結(jié)構(gòu), 當(dāng)繼續(xù)壓縮單層膜時, 液態(tài)有序相微區(qū)發(fā)生融合連接形成大的平臺狀結(jié)構(gòu), 高度起伏約1.55 nm。

關(guān)鍵詞:紅細(xì)胞; 脂筏; 原子力顯微鏡; LB單層膜

中圖分類號:O561.1; Q25 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

Atomic force microscope study of the isolation and reconstruction

of the structure of lipid rafts in erythrocyte

HAO Changchun, WANG Jiajing, ZHU Lingqing, MU Wenning, SUN Runguang

(School of Physics and Information Technology, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:Using the atomic force microscope(AFM) the human red blood cells were observed. Lipid rafts, which do not dissolve in detergent Triton X—100 components, were extracted by the sucrose density gradient centrifugation at 4 ℃. Langmuir-Blodgett (LB) monolayers of erythrocyte ghost were prepared and observed by the AFM. The experimental results show that the red blood cells took on double-concave disc-shaped with the size of 7.5 μm and lipid rafts showed a small granules structure with the size of 210 nm. The monolayer structure and morphology changed with increasing surface pressure. At the low surface pressure, there was liquid disordered and liquid-ordered coexisting phase structure. When continuing to compress the monolayer, the fluid ordered phase fused to form large flat platform structure with the height of 1.55 nm.

Key words: erythrocyte; lipid rafts; atomic force microscope; Langmuir-Blodgett monolayers

生物膜脂筏微區(qū)游動于磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺為骨架的液晶態(tài)雙層膜中,是生物膜不被去垢劑所溶解的部分,稱為Detergent-insoluble glycolipid-riched domains (DIGs),或Detergent-resistant fractions (DRF)[1-2]。通過冰凍蝕刻電子顯微鏡、熒光顯微鏡、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、核磁共振、X衍射等技術(shù)都證實(shí)了生物膜筏狀結(jié)構(gòu)的存在。研究表明, 脂筏含有大量的信號分子,可以參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選、離子通道的調(diào)節(jié)、膜的粘連、細(xì)胞的生長、分化、衰老、凋亡以及應(yīng)急反應(yīng)。它們結(jié)構(gòu)和功能的改變,會引發(fā)多種疾病,如腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病 (如:老年癡呆癥,帕金森氏癥,阿爾茲罕默氏病等)[3-4]。

脂筏微區(qū)雖然在分子水平上已經(jīng)被檢測到,但是其形成過程并沒有得到很好的解釋。生物膜中脂筏在低溫下能抵抗非離子去垢劑的抽提。利用此性質(zhì)就可以對脂筏結(jié)構(gòu)進(jìn)行在體分離[5]。本文在4 ℃下從人血紅細(xì)胞中分離不溶于去垢劑的脂筏部分,用原子力顯微鏡對其形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析,旨在從紅細(xì)胞分離脂筏成分，體外制備LB單層膜，并用原子力顯微鏡觀察分析脂筏結(jié)構(gòu)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1紅細(xì)胞膜脂筏成分的提取

新鮮血液(血庫提供)30 mL, 100×g離心10 min,用吸管吸去血漿及紅細(xì)胞表層的絨毛狀沉淀,加入5倍體積的pH 8.0 PBS緩沖液, 2 000×g離心15 min,棄去上清液,重復(fù)3次。在沉淀中加入40倍體積pH 8.0的PBS緩沖液, 4 ℃下靜置2 h溶血。然后22 000×g離心20 min,重復(fù)4次。沉淀用預(yù)冷的Triton X—100緩沖液(含0.25 mmol/L蔗糖, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris-HCl和1% Triton X—100)重懸,然后用等體積的80%(W/V)蔗糖溶液稀釋。取4 mL去垢劑處理過的膜懸浮液移入離心管,然后依次加入4 mL 30%和3.5 mL 5%的蔗糖溶液, 4 ℃, 38 000×g密度梯度離心18 h。在5%和30%蔗糖界面處收集脂筏成份,進(jìn)行AFM檢測。

1.2干燥血影成分的提取

新鮮血液(血庫提供)30 mL, 4 ℃, 100×g離心20 min。用吸管吸去血漿及紅細(xì)胞表層的絨毛狀沉淀, 加入3倍預(yù)冷的pH 7.4 PBS緩沖液, 4 ℃, 2 000×g離心15 min,棄上清液及表層,重復(fù)3次。然后沉淀加入40倍體積預(yù)冷的pH7.4 Tris-HCl緩沖液, 4 ℃下靜置2 h溶血。然后22 000×g離心20 min,重復(fù)5次。得到白色血影膜樣品,重懸,冷凍干燥。然后將干燥的膜成分溶解到氯仿/甲醇3∶1(V∶V)中形成1 mg/mL溶液。用微量進(jìn)樣器將10 μL溶液均勻平鋪在新解離的云母基片上,進(jìn)行AFM檢測。

1.3血影成分單層膜制備

將血影成分溶解在氯仿/甲醇3∶1(V∶V)中形成濃度為0.5 mmol/L的溶液。KSV-Minitrough (芬蘭KSV公司,槽子: 323 mm×75 mm)進(jìn)行制備。用微量進(jìn)樣器將一定體積的脂溶液滴加到純水表面,讓其自動鋪展。15 min后,等液體表面有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后,以10 mm/min的速度壓膜。膜表面壓力由Wilhelmy吊片式天平檢測,π-A曲線由計(jì)算機(jī)控制自動獲得,每組數(shù)據(jù)最少重復(fù)3次。在固定的膜壓下,使用垂直提膜法以5 mm/min的速度將單分子層轉(zhuǎn)移到新解離的云母基片上,成膜溫度控制在20±0.5 ℃,然后對樣品進(jìn)行原子力顯微鏡檢測。

1.4AFM觀測

原子力顯微鏡(AFM):型號為SPM—9500—J3(日本島津公司)。測量采用輕敲模式,整個實(shí)驗(yàn)觀測過程在室溫下進(jìn)行。所采用的是標(biāo)準(zhǔn)掃描頭,其最大掃描范圍為125 μm×125 μm,微懸臂選用100 μm,探針為T形,材料為Si3N4,懸臂的彈性常數(shù)為0.06 N/m,對樣品作用力控制在10-8N量級。掃描頻率為0.5~1 Hz。

2結(jié)果與討論

2.1紅細(xì)胞的AFM觀測

原子力顯微鏡通過調(diào)節(jié)控制針尖與樣品間的作用力實(shí)現(xiàn)對樣品無損傷掃描,在原子級分辨率尺度范圍內(nèi)獲得樣品的表面形貌圖[6]。圖1給出了正常

圖1　紅細(xì)胞吸附在云母表面的AFM圖

紅細(xì)胞在新解離云母片上的表面形貌圖, 從圖中可以展示紅細(xì)胞呈凹陷圓盤狀(圖1a), 對應(yīng)的立體圖能更直觀展示紅細(xì)胞在固體襯底表面吸附的形態(tài)(圖1b和1c)。文獻(xiàn)報道正常紅細(xì)胞表面柔順光滑[7],直徑約7.5 μm,厚度1.7 μm, 體積83 μm3,表面積145 μm2,表面積與體積比值較大,有利于細(xì)胞變形、氣體交換和攜帶。通過AFM軟件對觀測的紅細(xì)胞進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),紅細(xì)胞的直徑為7.4±0.3 μm,表面積為170±16 μm2,體積為46±1 μm3,厚度為1.4±0.3 μm。對比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)觀測的紅細(xì)胞直徑、表面積大小均在正常范圍,體積和厚度有所降低,其原因是紅細(xì)胞吸附在襯底上時,接觸面發(fā)生粘附所致。

2.2紅細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)觀測

脂筏是存在于細(xì)胞膜中具有特定結(jié)構(gòu)和功能的動態(tài)結(jié)構(gòu)域, 低溫下不溶于非離子去垢劑。通過蔗糖密度梯度離心方法在4 ℃下抽提不溶于去垢劑Triton X—100的部分,將其以一定的濃度滴在新解離的云母襯底表面進(jìn)行原子力顯微鏡檢測。AFM檢測結(jié)果表明,脂筏成分呈現(xiàn)一些小的聚集體結(jié)構(gòu),如圖2a所示。文獻(xiàn)報道脂筏微區(qū)結(jié)構(gòu)區(qū)域大小為50~300 nm[8]。實(shí)驗(yàn)中對AFM圖中小顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行了數(shù)值統(tǒng)計(jì),大小分布見圖2b所示。從圖中可以看出,顆粒體的平均直徑大小為210 nm,此顆粒尺寸與文獻(xiàn)報道的脂筏微區(qū)大小相一致。

圖2　紅細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)抽提液的AFM觀測(a)

2.3紅細(xì)胞血影成分LB膜結(jié)構(gòu)的AFM觀測

文獻(xiàn)報道的脂筏研究中常采用脂與脂、脂與蛋白混合,制備具有特定相態(tài)結(jié)構(gòu)的單層膜或雙層膜微區(qū)來模擬研究脂筏結(jié)構(gòu)的性質(zhì)[9-10]。由于脂筏結(jié)構(gòu)中成分較為復(fù)雜,所以簡單的幾種組分混合并不能給出真實(shí)情況下微區(qū)結(jié)構(gòu)的性質(zhì),僅能提供組分分子間相互作用的機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)中提取的紅細(xì)胞血影含多種組分,所以對其進(jìn)行研究具有重要的參考意義。實(shí)驗(yàn)過程中將干燥的血影成分樣品通過LB的方法在不同表面壓力下制備出單層膜,利用原子力顯微鏡對其進(jìn)行觀測。如圖3所示,當(dāng)表面壓力為5 mN/m時,單層膜呈現(xiàn)出明顯的液態(tài)無序和液態(tài)有序相共存相共存結(jié)構(gòu),液態(tài)有序相對應(yīng)圖中微區(qū)結(jié)構(gòu),兩相高度差為1.55 nm,微區(qū)結(jié)構(gòu)大約為200 nm。隨著表面壓力增大,小的微區(qū)結(jié)構(gòu)逐漸融合,連接成大的平臺(圖3b),從圖中可以看出平臺并不致密,較為疏松。當(dāng)表面壓力增大到30 mN/m時,所有的微區(qū)結(jié)構(gòu)連接到一起形成了具有許多孔洞的大片結(jié)構(gòu),該形貌與文獻(xiàn)中報道的利用多種脂混合模擬脂筏結(jié)構(gòu)形成的形態(tài)相一致[11]。

生物膜脂筏結(jié)構(gòu)和功能的研究是當(dāng)前該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題,本實(shí)驗(yàn)雖然提取出了脂筏成分,但仍存在一些需要解決的問題: (1) 細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)對去垢劑的敏感性有差別,對不同的細(xì)胞選擇合適的去垢劑是個難解決的問題; (2) 去垢劑的引入會不會造成脂筏上的物質(zhì)損失或出現(xiàn)成分間的粘連、相變等問題; (3) 生物膜內(nèi)外頁脂筏成分結(jié)構(gòu)的成分有何差異,脂與蛋白間如何相互作用等關(guān)鍵問題[12]; (4) 脂筏與疾病的關(guān)系[13-14]。

圖3　干燥血影成份LB膜結(jié)構(gòu)的AFM觀測

3結(jié)論

本文用蔗糖密度梯度離心法提取紅細(xì)胞膜脂筏成分,用原子力顯微鏡觀測紅細(xì)胞膜脂筏成分制成的LB膜, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂筏呈現(xiàn)出小聚集體結(jié)構(gòu),大小約210 nm。LB膜隨著成膜壓力增加出現(xiàn)了小微區(qū)、平臺、大片層結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)提供了一個從紅細(xì)胞分離脂筏成分,在體外制備LB膜, 進(jìn)行原子力顯微鏡觀測的新方法,對研究脂筏結(jié)構(gòu)的物理化學(xué)性質(zhì)具有一定的參考意義。

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〔責(zé)任編輯 李博〕