魏潔書(shū)++王煥++戴慧明++卿志浩++楊錦芬

摘要：HMGR和DXR分別是萜類(lèi)生物合成途徑——MVA和MEP途徑的2個(gè)關(guān)鍵酶。本研究對(duì)煙草施用HMGR和DXR的專(zhuān)一抑制劑洛伐他?。∕EV）和膦胺霉素（FSM），測(cè)定煙草NtHMGR、NtDXR、FPPS和GGPPS基因轉(zhuǎn)錄水平、HMGR和DXR酶活性變化。結(jié)果表明，抑制劑處理后煙草內(nèi)源基因NtHMGR和NtDXR表達(dá)量在24h受到明顯抑制；HMGR和DXR活性均在一定時(shí)間內(nèi)受到抑制。MEV和FSM能有效抑制煙草中HMGR和DXR的活性。

關(guān)鍵詞：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）；1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）；洛伐他汀；膦胺霉素

中圖分類(lèi)號(hào)：TS411文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

植物萜類(lèi)化合物的生物合成至少有2條途徑。細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA途徑）；質(zhì)體中的2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP途徑）[1]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）分別是MVA和MEP上游途徑中的2個(gè)關(guān)鍵酶[2，3]。

洛伐他?。╩evinolin，MEV）是HMGR的專(zhuān)一抑制劑，它能與HMGR的活性部位結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）轉(zhuǎn)變成甲羥戊酸（MVA）[4，5]；膦胺霉素（fosmidomycin，F(xiàn)SM）是DXR的專(zhuān)一抑制劑，它能阻斷1-去氧木糖-5磷酸（DXP）合成2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）[6，7]。

1材料與方法

1.1材料

野生型煙草“中煙90”種子，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心保存。

1.2主要儀器與試劑

MEV（美國(guó)Sigma公司）；FSM（美國(guó)Sigma公司）； CFX96熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3方法

1.3.1考察抑制劑噴施濃度和取樣時(shí)間

考察噴施濃度和取樣時(shí)間：播種煙草種子，溫室培養(yǎng)至三葉一心期（苗齡約6周），進(jìn)行噴施。植株分為4組，分別噴施MEV、MEV溶劑對(duì)照、FSM、純水對(duì)照，連噴3d，觀察植株生長(zhǎng)情況，取致植株全部白化或變形的最低濃度為抑制劑最適濃度。未處理煙草長(zhǎng)至6個(gè)月，噴施最適濃度抑制劑，噴施前采樣作為0h樣品，噴施處理6h、12h、24h、36h、48h后各采集葉片100mg，提取RNA，熒光定量PCR檢測(cè)。引物見(jiàn)表1，引物退火溫度篩選、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法參考文獻(xiàn)[8]。反應(yīng)條件為：95℃ 30s；95℃ 3s，60℃ 5s，40個(gè)循環(huán)。采用比較Ct值法[9]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量F，公式為F=2-△△Ct，其中△△Ct=（待測(cè)組目的基因Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因Ct值）-（對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值）。0h樣品檢測(cè)NtHMGR、NtDXR基因表達(dá)量，MEV及對(duì)照噴施組檢測(cè)NtHMGR基因的表達(dá)量，F(xiàn)SM及對(duì)照噴施組檢測(cè)NtDXR基因表達(dá)量。

1.3.2基因表達(dá)量和酶活性的測(cè)定

用考察濃度后的抑制劑噴施苗齡6個(gè)月的煙草，測(cè)定煙草內(nèi)源基因NtHMGR和NtDXR、下游基因FPPS和GGPPS表達(dá)量。噴施前采樣作為0h樣品，噴施處理24h、36h、48h后各采集煙草葉片100mg。酶活性的測(cè)定根據(jù)底物專(zhuān)一性原理，具體測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[10]。煙草葉片于MEV噴施處理后12h、24h、48h后采集，F(xiàn)SM噴施處理后24h、48h后采集。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1確定MEV和FSM噴施煙草最適濃度和取樣時(shí)間

MEV噴施煙草后，葉片呈現(xiàn)皺縮的現(xiàn)象，如圖1，使用不同濃度MEV噴施后，煙草皺縮苗率有所不同，用350μmol/L噴施后，煙草皺縮苗率達(dá)到57.5%，而400μmol/L噴施后皺縮苗率僅為45%，溶劑噴施后葉片沒(méi)有出現(xiàn)皺縮（圖2）。故采用350μmol/L的MEV為最適噴施濃度。

a.噴施MEV后的皺縮苗b.噴施溶劑后的正常苗圖1350μmol/L MEV和溶劑噴施后煙草幼苗表型對(duì)比

圖2不同濃度MEV噴施煙草幼苗后的皺縮苗率

FSM噴施煙草后，葉片呈現(xiàn)黃化及白化的現(xiàn)象，如圖3，使用不同濃度FSM噴施后，煙草黃白苗所占比例有所不同，用75μmol/L噴施后，黃苗率達(dá)到67.5%，用100μmol/L噴施后，白苗率達(dá)到82.5%，用150μmol/L和200μmol/L噴施后，白苗率都達(dá)到95%，其余5%均出現(xiàn)黃化（圖4），說(shuō)明150μmol/L FSM處理煙草即可達(dá)到效果，故采用150μmol/L為最適噴施濃度。

a.噴施FSM后的白化苗b.噴施純水后的正常苗圖3150μmol/L FSM和純水噴施后煙草幼苗表型變化

圖4不同濃度FSM噴施煙草幼苗后的黃白苗率

專(zhuān)一抑制劑噴施煙草后，對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)量會(huì)隨著時(shí)間的變化有所降低和升高。NtHMGR表達(dá)量在36h達(dá)到最高值，為未處理的4.34倍，如圖5-a。NtDXR基因表達(dá)量在36h達(dá)到最高值，為未處理的6.26倍，如圖5-b。

根據(jù)圖5變化趨勢(shì)確定基因表達(dá)量采樣時(shí)間為24h、36h、48h，HMGR酶活性為12h、24h、48h，DXR酶活性為24h、48h。a.MEV噴施煙草NtHMGR基因表達(dá)量變化b.FSM噴施煙草NtDXR基因表達(dá)量變化圖5專(zhuān)一抑制劑噴施煙草后NtHMGR和NtDXR表達(dá)量變化

2.2噴施MEV和FSM對(duì)煙草基因表達(dá)量和酶活性的影響

2.2.1基因表達(dá)量變化

MEV噴施煙草后，NtHMGR表達(dá)量在36h達(dá)到最高值，如圖6-a。FSM噴施后，NtDXR基因表達(dá)量在36h有一個(gè)低谷，36～48h出現(xiàn)升高，如圖6-b。MEV噴施后，F(xiàn)PPS與GGPPS表達(dá)量在36h達(dá)到最高值，在48h回到原水平，與NtHMGR表達(dá)變化呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，如圖6-c。FSM噴施后，F(xiàn)PPS表達(dá)量緩慢升高，GGPPS表達(dá)量變化不大，如圖6-d。圖6MEV及FSM噴施野生型煙草后基因表達(dá)量變化

2.2.2HMGR和DXR活性變化

煙草在噴施專(zhuān)一抑制劑MEV后，HMGR活性在12h、24h和48h分別是溶劑對(duì)照的0.82倍、0.80倍和1.29倍。12h和24h時(shí)HMGR活性受到抑制，48h HMGR活性出現(xiàn)了反饋性的提高，如圖7-a。噴施FSM后，煙草內(nèi)的DXR活性在24h和48h分別是溶劑對(duì)照的1.3倍和0.485倍，DXR活性在48h受到抑制，如圖7-b。

3討論

作為植物中萜類(lèi)生物合成途徑MVA途徑和MEP途徑中關(guān)鍵酶的抑制劑，洛伐他?。∕EV）和膦胺霉素（FSM）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于HMGR和DXR的調(diào)控研究[11，12]。本文對(duì)煙草施用MEV和FSM，抑制了HMGR或DXR酶活性，煙草內(nèi)源基因NtHMGR、NtDXR，下游基因FPPS、GGPPS表達(dá)量在一定時(shí)間內(nèi)有所提高。a.煙草噴施MEV和溶劑對(duì)照HMGR活性比較b.煙草噴施FSM和溶劑對(duì)照DXR活性比較圖7煙草噴施抑制劑和溶劑對(duì)照酶活性含量比較

噴施抑制劑MEV后，煙草HMGR活性在12～24h受到抑制后，NtHMGR基因及下游FPPS、GGPPS基因表達(dá)水平均出現(xiàn)反饋性提高，從而彌補(bǔ)了HMGR由于受抑制而降低的現(xiàn)象，增加HMGR的合成，在48h時(shí)測(cè)定的HMGR活性回升至比對(duì)照更高的水平，推測(cè)此時(shí)NtHMGR基因轉(zhuǎn)錄由于已滿足HMGR的合成需求，因此又回落至處理前水平，下游基因表達(dá)水平也在此時(shí)回落。Joseph和Ross[13]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定濃度的MEV，可使細(xì)胞內(nèi)HMGR活性比對(duì)照減少33%以上，本實(shí)驗(yàn)煙草噴施MEV后HMGR活性在24h內(nèi)受到抑制。噴施抑制劑FSM后，煙草DXR活性在24h并未受到明顯影響，NtDXR基因及下游FPPS、GGPPS基因表達(dá)水平也與對(duì)照持平，在48h時(shí)DXR活性受到抑制，NtDXR基因表達(dá)出現(xiàn)一個(gè)明顯上升的趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了反饋性的提高，下游FPPS基因表達(dá)水平也隨之逐漸上升。用HMGR和DXR的專(zhuān)一抑制劑處理煙草后，相應(yīng)的酶基因及部分下游基因表達(dá)水平有明顯增加，表明煙草體內(nèi)對(duì)抑制劑處理具有明顯的反饋補(bǔ)償作用，由于抑制劑抑制了IPP合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致IPP來(lái)源不足，細(xì)胞通過(guò)增加關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)來(lái)抵消抑制劑的作用。

4結(jié)語(yǔ)

本文結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)煙草施用MVA途徑和MEP途徑中關(guān)鍵酶HMGR和DXR的專(zhuān)一抑制劑洛伐他?。∕EV）和膦胺霉素（FSM），在一定時(shí)間內(nèi)抑制了HMGR或DXR酶活性，煙草內(nèi)源基因NtHMGR、NtDXR，下游基因FPPS、GGPPS表達(dá)量在一定時(shí)間內(nèi)有所提高，該結(jié)果為利用MEV和FSM抑制植物萜類(lèi)的合成，以及進(jìn)一步闡明萜類(lèi)化合物2條生物合成途徑間的協(xié)同作用奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Vranová E，Coman D，Gruissem W.Network analysis of the MVA and MEP pathways for isoprenoid synthesis[J].Annu Rev Plant Biol，2013，64：665-700.

[2]Carretero-Paulet L，Ahumada I，Cunillera N，et al.Expression and molecular analysis of the Arabidopsis DXR gene encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，the first committed enzyme of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway[J].Plant Physiol，2002，129（04）：1581-1591.

[3]羅永明，劉愛(ài)華，李琴，等.植物萜類(lèi)化合物的生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，15（01）：45-51.

[4]蔡正艷，周偉澄.3-羥基-3-甲基戊二酞輔酶A還原酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2006，15（22）：1907-1911.

[5]Bach TJ，Lichtenthaler HK.Mevinolin：a highly specific inhibitor of microsomal 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase of radish plants[J].Z Naturforsch，1982，37：46-50.

[6]Zeidler J，Schwender J，Müller C，et al.Inhibition of the non-mevalonate 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate athway of plant isoprenoid biosynthesis by fosmidomycin[J].Z Naturforsch，1998，53：980-986.

[7]Kuzuyama T，Shimizu T，Takahashi S.Fosmidomycin，a specific inhibitor of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerasein the nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis[J].Tetrahedron Lett，1998，39：7913-7916.

[8]魏潔書(shū)，楊錦芬，凌敏，等.茉莉酸甲酯調(diào)控陽(yáng)春砂HMGR、DXR和DXS基因表達(dá)[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（01）：88-92.

[9]魏潔書(shū)，楊錦芬.應(yīng)用熒光定量比較Ct值法測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)量[J].中國(guó)科技論文在線精品論文，2013，6（05）：390-395.

[10]劉卉，陽(yáng)春砂HMGR和DXR基因在煙草萜類(lèi)化合物生物合成中的功能研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[11]Skorupinska-Tudek K，Poznanski J，Wojcik J，et al.Contribution of the mevalonate and methylerythritol phosphate pathways to the biosynthesis of dolichols in plants[J].J Biol Chem，2008，283（30）：21024-21035.

[12]Roberts S C.Production and engineering of terpenoids in plant cell culture[J].Nat Chem Biol，2007，3（07）：387-395.

[13]Joseph Chappell，Ross Nable.Induction of Sesquiterpenoid Biosynthesis in Tobacco CellSuspension Cultures by Fungal Elicitor[J].Plant Physiol，1987（85）：469-473.