禹曉梅，馬文廣，2，鄭昀曄，2

（1．玉溪中煙種子有限責(zé)任公司， 云南 玉溪653100；2．云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 云南 玉溪653100）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量的好壞直接影響到播種品質(zhì)。種子質(zhì)量是種子潛力的綜合表現(xiàn)，種子具有優(yōu)良品質(zhì)是保證快速發(fā)芽、出苗整齊和健壯的先決條件［1］。種子活力是種子質(zhì)量最重要的指標(biāo)，它是指種子在發(fā)芽和出苗期間的活性強(qiáng)度及特性的綜合表現(xiàn)。高活力種子發(fā)芽早、出苗整齊迅速，抵抗不良環(huán)境的能力強(qiáng)，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力；低活力種子在適宜的條件下雖然能發(fā)芽，但是發(fā)芽緩慢，在不良環(huán)境條件下出苗不整齊，甚至不出苗。種子從形成發(fā)育直到成熟脫離母株，每時(shí)每刻都受到外界環(huán)境條件的影響。當(dāng)種子達(dá)到生理成熟干重增至最大時(shí)，種子具有最高的活力，此后隨著種子不停的衰老向著死亡推移，活力逐漸下降，即發(fā)生種子老化（seed aging）。Gove［2］將種子老化定義為：種子的品質(zhì)及其性能或生活力從較高水平下降至較低的水平。

煙草種質(zhì)主要以種子的形式進(jìn)行低溫低濕保存，低溫保存會(huì)延長(zhǎng)儲(chǔ)存壽命，但不能阻止老化［3－4］。種子老化劣變直接影響到種子的活力，從而對(duì)種子田間的出苗能力造成極其嚴(yán)重的影響，最終導(dǎo)致減產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。種子老化也會(huì)引起遺傳完整性的改變，老化到一定程度需要繁殖更新。

種子老化導(dǎo)致種子活力下降的機(jī)制非常復(fù)雜，其實(shí)質(zhì)在于細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理功能上發(fā)生的一系列變化［5－9］。人工加速老化和自然老化方法是研究種子老化過程中生理生化變化、種子活力變化及種子耐藏性等常用的兩種方法。由于自然老化過程緩慢，所需的時(shí)間很長(zhǎng)，難以獲得試驗(yàn)材料等因素，所以在科學(xué)研究中一般很少采用這種方法。而人工加速老化能夠克服自然老化所需時(shí)間長(zhǎng)的不足，容易在較短的時(shí)間內(nèi)獲得不同活力的種子材料，因而廣泛應(yīng)用于種子老化機(jī)理的研究。大量研究表明，利用人工老化法使種子活力迅速喪失，只是加速了種子內(nèi)部的代謝過程，并無(wú)老化機(jī)理上的差異。因此，人工老化法可以模擬種子的自然老化和劣變過程［10－13］。

本實(shí)驗(yàn)采用高溫高濕加速老化方法，旨在研究不同老化溫度和時(shí)間對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響以及種子老化過程中抗氧化酶的變化規(guī)律，為探討煙草種子老化特性和機(jī)理提供理論參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用烤煙品種云煙97為研究對(duì)象，進(jìn)行人工老化實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 煙草種子吸濕等溫曲線

將煙草種子放在分別含有不同溶度LiCl溶液的環(huán)境中，相對(duì)濕度為18%、33%、44%、60%、85%和100%的密閉瓶子中，放置于控溫房中（20±1）℃使其平衡大概4周的時(shí)間，直到種子的水勢(shì)穩(wěn)定。種子含水量的計(jì)算是基于鮮重進(jìn)行。種子的干重通過在烘箱中105℃，17h后獲得，含水量按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

公式（1）：含水量（%）＝（鮮重－干重）／鮮重×100%。

2．2 人工加速老化測(cè)定溫度和時(shí)間的設(shè)置

將種子分別置于39，41，43，45℃下，濕度為100%的環(huán)境中進(jìn)行人工加速老化處理，并在每個(gè)溫度環(huán)境下對(duì)供試種子分別老化24，36，48，60，72，84，96h，以未處理種子為對(duì)照。

2．3 種子活力測(cè)定

發(fā)芽試驗(yàn)按照國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程（ISTA）規(guī)定條件進(jìn)行，取兩層濾紙平展在直徑為9cm的玻璃培養(yǎng)皿中并充分吸水，將不同老化天數(shù)種子和對(duì)照分別均勻擺放在濾紙上，每皿100粒，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)萌發(fā)，溫度25℃，3次重復(fù)，各處理每日分別加入適量的蒸餾水以保證正常生長(zhǎng)。5d測(cè)定種子發(fā)芽勢(shì)，14d統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率和幼苗干重（幼苗在105℃烘箱中殺青15min，90℃烘干17h后稱重為幼苗干重），萌發(fā)定義為子葉變綠。種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)按下列公式（2），（3）計(jì)算：

公式（2）：發(fā)芽指數(shù)＝∑（Gt／Dt），式中Gt為t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

公式（3）：種子活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×幼苗干重（mg）。

2．4 種子浸提液相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

分別稱取不同老化時(shí)間的種子材料，3次重復(fù)，用去離子水沖洗2遍，加入20mL去離子水，在20℃恒溫條件下浸種3h，然后用DDS－11A型電導(dǎo)率儀測(cè)定煮沸前浸出液電導(dǎo)率，再煮沸10min，冷卻至室溫時(shí)測(cè)定煮沸電導(dǎo)率。

公式（4）：相對(duì)電導(dǎo)率（%）＝煮沸前浸出液電導(dǎo)率／煮沸電導(dǎo)率×100%。

2．5 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

稱取0．2～0．5g種子中加入2mL 10%三氯乙酸（thichloroacetic acid，TCA）研磨提取2min；提取液轉(zhuǎn)入離心管，用3mL 10%TCA分3次沖洗研缽（1mL／次），沖洗液與提取液合并；10 000×g離心15 min，取上清液，用10%的TCA 溶液定容至5mL；取1mL上清液，加入1mL 0．6%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），100℃水浴加熱20min，迅速冷卻；10 000×g離心10min，取上清液在532，600，450 nm測(cè)定吸光值（Abs）。

MDA含量計(jì)算：公式（5）：樣品提取液中MDA的濃度（c）＝6．45×（A532－A600）－0．56×A450（試中：樣品中MDA的質(zhì)量摩爾濃度（μmol／L）＝C×N／W 。

C為 MDA 濃度（μmol／L），N 為提取液體積（L），W 為組織的干重（g）。

2．6 3種抗氧化酶（POD、SOD、CAT）的提取方法與測(cè)定

稱取0．2g材料，加入預(yù)冷的提取液3mL，充分冰浴研磨，然后轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL提取液沖洗研缽，于4℃下20 000×g離心20min，分裝上清液，于液氮冷凍后在－80℃超低溫冰箱保存，待測(cè)。酶提取系統(tǒng)配方為50mmol／L Tris－HCl緩沖液，pH＝7．0，內(nèi)含20%甘油，1mmol／L EDTA，1mmol／L AsA，1mmol／L DTT，1mmol／L GSH，5mmol／L MgCl2，配好后于4℃冰箱保存。

超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定，以O(shè)D560變化0．5為一個(gè)酶活單位（U）；過氧化物酶（POD）的測(cè)定參照愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘OD470變化0．01為一個(gè)酶活單位（U）；過氧化氫酶（CAT）的測(cè)定，以每分鐘OD240變化0．1為一個(gè)酶活單位（U）。

2．7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SAS軟件（8．0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用LSD，α＝0．05，百分率數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換（y＝arcsin［sqr（x／100）］）。

3 結(jié)果與分析

3．1 煙草種子吸濕等溫曲線

種子壽命的外界因素主要有3個(gè)，即濕度（水分）、溫度和空氣含氧量，這3個(gè)因素中以水分最為重要。本試驗(yàn)研究了在不同空氣相對(duì)濕度下煙草種子吸濕平衡含水率，得出了煙草種子的吸濕等溫曲線（圖1）。種子吸濕等溫曲線與種子化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)及溫度有關(guān)。煙草種子顯示了典型的油料作物種子的吸濕等溫曲線特征。空氣濕度為18%時(shí)種子含水量為4%，空氣濕度為33%種子含水量為5%，空氣濕度為100%時(shí)種子含水量為25%。煙草種子含水量越低，種子儲(chǔ)藏時(shí)間越長(zhǎng)，一般煙草種子安全含水量為5%左右。煙草種子吸濕等溫曲線可以為煙草種子在室內(nèi)儲(chǔ)藏以及包裝袋內(nèi)儲(chǔ)藏的壽命研究提供理論依據(jù)。

圖1 煙草種子的吸濕等溫曲線

3．2 不同老化溫度處理對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響

經(jīng)過不同老化溫度處理后測(cè)定結(jié)果顯示（圖2），煙草種子云煙97在各溫度下隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)萌發(fā)率均下降，但是下降率不同。云煙97種子在30，35℃和38℃下老化96h后萌發(fā)率下降10%～20%左右，但是40℃老化72h后萌發(fā)率開始大幅下降，96h后萌發(fā)率顯著下降至17%。因此，經(jīng)過不同溫度的老化處理均能夠降低種子的發(fā)芽率，但是較低溫度處理對(duì)萌發(fā)率高的種子老化效果不明顯，而較高溫度老化卻可導(dǎo)致種子萌發(fā)率的迅速下降。因此，根據(jù)不同溫度、不同時(shí)間對(duì)煙草種子老化情況，表明40℃和72h的老化處理組合可以將不同發(fā)芽能力的種子明顯分開，是煙草種子人工加速老化處理的適宜條件。

圖2 不同老化溫度處理對(duì)煙草種子發(fā)芽率的影響

3．3 人工老化處理對(duì)煙草種子活力的影響

云煙97在40℃老化不同時(shí)間后的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)見表1。經(jīng)人工老化處理后，隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈降低趨勢(shì)。在老化進(jìn)程中，除種子發(fā)芽率在老化24h時(shí)與對(duì)照差異不顯著外，老化24h后，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著下降，且以發(fā)芽勢(shì)的降幅最大。如人工老化48h時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)則迅速下降，發(fā)芽勢(shì)由對(duì)照99%下降到82%，變化率分別為17%；活力指數(shù)由對(duì)照20．55下降到13．57，變化率分別為33%；發(fā)芽指數(shù)由對(duì)照的9．48下降為6．47，變化率32%。隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，種子的生理老化程度加深，表現(xiàn)為發(fā)芽速度減慢，種子的發(fā)芽率降低和種子的活力顯著下降。

表1 人工老化過程中煙草種子活力的變化

3．4 人工老化過程中煙草種子抗氧化酶活性及膜質(zhì)過氧化的變化

云煙97在40℃和100%RH相對(duì)濕度的環(huán)境中，經(jīng)不同時(shí)間老化處理后，過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，在種子老化過程中，云煙97種子中的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性均隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)，并且在老化后期72h和96h下降較快。隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，云煙97的相對(duì)電導(dǎo)率均呈上升趨勢(shì)，在老化72h和96h時(shí)上升較快。膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的變化趨勢(shì)與相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致，從24h至96h呈上升趨勢(shì)，且上升幅度越來越大，特別是72h至96h時(shí) MDA含量上升最快。表明煙草種子在人工老化過程中，隨著POD、SOD、CAT等抗氧化物酶活性的降低，脂質(zhì)和膜脂過氧化作用加強(qiáng)，造成MDA有害物質(zhì)的累積及膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，透性增大，導(dǎo)致種子細(xì)胞內(nèi)的礦物質(zhì)和一些無(wú)機(jī)物質(zhì)迅速外滲，電導(dǎo)率升高，并且隨著種子老化程度加劇，這種趨勢(shì)愈來愈明顯。

表2 人工老化過程中煙草種子抗氧化酶活性及膜質(zhì)過氧化的變化

4 總 結(jié)

試驗(yàn)以煙草種子云煙97為研究材料，人工加速老化的處理過程中，溫度、時(shí)間對(duì)種子老化有重要的影響。表明40℃和72h的老化處理組合可以將不同發(fā)芽能力的種子明顯分開，是煙草種子人工加速老化處理的適宜條件。

一般認(rèn)為，衰老種子在死亡之前，其內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列生理生化劣變，包括種子組成成分和酶活性的變化，有毒物質(zhì)的積累，合成及修復(fù)能力的降低等，并且隨著老化程度的加深，這些變化會(huì)越來越明顯，最終導(dǎo)致種子不可逆轉(zhuǎn)性死亡。種子內(nèi)存在SOD、CAT、POD等抗氧化酶，其作為酶促抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分發(fā)揮協(xié)同作用，共同清除活性氧物質(zhì)，使活性氧維持在一個(gè)對(duì)細(xì)胞無(wú)害的穩(wěn)定狀態(tài)。種子老化過程中產(chǎn)生的自由基和過氧化物具有很強(qiáng)的毒害作用，可以啟動(dòng)膜脂中不飽和脂肪酸的過氧化作用，產(chǎn)生O2－，使細(xì)胞膜受到損傷，導(dǎo)致種子老化和組織衰老。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低可以用來衡量植物在逆境脅迫下生物膜受活性氧傷害程度的大小。種子劣變過程中，脂質(zhì)過氧化，膜透性增加，溶質(zhì)外滲，合成能力下降，激素也發(fā)生相應(yīng)的變化，SOD、CAT、POD等保護(hù)性酶的活性降低，清除自由基及過氧化物的能力減弱，自由基不斷積累，攻擊膜磷脂分子的不飽和脂肪酸，膜受到破壞，透性增大，積累MDA等有毒物質(zhì)，造成種子活力下降。本研究結(jié)果表明，隨著種子老化程度的加深，煙草種子SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性下降，MDA含量升高，種子浸出液的相對(duì)電導(dǎo)率也顯著增加。這與前人對(duì)大豆、小麥、玉米、辣椒、大白菜、白菜研究結(jié)果相一致，表明煙草種子人工老化及劣變的主要機(jī)制也在于膜脂過氧化作用加劇。

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