陳亞偉，樊冬梅，劉　剛，田曉予

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慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定表達miR-183的人卵巢癌skov3細(xì)胞系

陳亞偉，樊冬梅，劉剛，田曉予

摘要：目的建立穩(wěn)定表達miR-183的人卵巢癌skov3 細(xì)胞系。方法將Pre-miR-183、has-miR-183 inhibitor基因克隆到真核表達載體pEZX-MR03、pEZX-AM03中，構(gòu)建成重組表達載體pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor，再將重組表達載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中包裝慢病毒。用包裝好的慢病毒感染人卵巢癌skov3 細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素、潮霉素B篩選后獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，最后用RT-PCR法檢測miR-183在轉(zhuǎn)錄水平的表達。結(jié)果分離培養(yǎng)出穩(wěn)定高表達和低表達 mirR-183的單克隆細(xì)胞株。結(jié)論實驗成功建立了穩(wěn)定表達miR-183的 skov3細(xì)胞系，為研究miR-183的生物學(xué)功能提供了有效的細(xì)胞模型。

關(guān)鍵詞：慢病毒；skov3細(xì)胞； miR-183；卵巢瘤

作者單位：河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

卵巢癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病十分隱匿，大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)處于晚期，失去手術(shù)機會。雖然化療在卵巢癌的治療中占重要地位，但耐藥的產(chǎn)生也使卵巢癌化療難以取得理想效果[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類調(diào)節(jié)性小RNA，長約18～22個核苷酸，它本身不編碼蛋白，但對蛋白編碼基因有重要的調(diào)控作用。miRNAs與多種腫瘤密切相關(guān)，它可調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達，參與腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育、凋亡、增殖、血管形成、侵襲遷移等一系列重要進程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[5-7]。其中，miR-183在卵巢癌中存在異常表達，但它是促癌 miRNA 還是抑癌 miRNA，報道并非一致[8-9]。用miRNA芯片和實時RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與相對低侵襲力的skov3細(xì)胞相比較，miR-183在高侵襲力的SKOV3ip細(xì)胞中呈低表達[10]。而miR-22，miR-183和miR-31通過抑制Tiam1的蛋白表達，進而抑制細(xì)胞遷移、侵襲和生長，但不影響細(xì)胞凋亡。為研究miR-183在卵巢癌中的作用，作者采用慢病毒轉(zhuǎn)染試劑將Pre-miR-183、has-miR-183 inhibitor基因?qū)肴寺殉舶﹕kov3細(xì)胞中，并經(jīng)嘌呤霉素、潮霉素B篩選，建立穩(wěn)定表達mirR-183的細(xì)胞株，為今后研究miR-183的生物學(xué)功能提供有效的細(xì)胞模型。

1材料與方法

1.1材料人卵巢癌skov3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，293T細(xì)胞由河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物實驗室傳承。MiR-183的真核表達載體pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及陰性對照(negative control,NC)均由廣州復(fù)能基因有限公司構(gòu)建。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco)，Opti-MEM?I (美國Invitrogen)、胎牛血清(以色列BI)，miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，Lenti-Pac HIV表達包裝試劑盒、miR-183 和 miR-U6 qPCR檢測引物、miRNA反轉(zhuǎn)錄及其qPCR試劑盒(廣州復(fù)能基因有限公司)，嘌呤霉素(美國 Life)，潮霉素B(美國Invitrogen)。

1.2方法

1.2.1確定嘌呤霉素、潮霉素B篩選濃度篩選前1 d，將skov3細(xì)胞以每孔5×104個接種到24孔板中，加入0.5 mL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達到60%～70%。嘌呤霉素(0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg·L-1)、潮霉素B(100、110、120、130、140、150 mg·L-1)按不同濃度梯度分別加入到鋪好的24孔板中，每天換液，濃度不變，培養(yǎng)3 d使skov3細(xì)胞全部死亡的最小濃度即為篩選濃度。

1.2.2包裝慢病毒轉(zhuǎn)染前1 d，取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞2×106個接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 mL含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達到50%～60%。分別將2.5 μg的pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及NC和5.0 μL的Lenti-Pac HIV加入到200 μL的Opti-MEM?I培養(yǎng)基中。 此外，另取200 μL的Opti-MEM?I培養(yǎng)基并加入15 μL的EndoFectin Lenti。最后，將后者倒入前者，混勻，室溫靜置20 min后，加到293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液， 經(jīng)過離心(4 ℃，3 000 r·min-1，15 min)和過濾(0.45 μm)收集病毒液。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前12 h，將skov3細(xì)胞以每孔5×105個接種到6孔板中，加入2 mL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達到50%～60%；棄掉舊培養(yǎng)基，加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，然后分別加入4種慢病毒液，24 h后換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選觀察轉(zhuǎn)染后的skov3細(xì)胞熒光情況，并根據(jù)載體所攜帶抗性基因的不同，于轉(zhuǎn)染后72 h分別加入相對應(yīng)的抗生素，嘌呤霉素(1 mg·L-1)，潮霉素B(120 mg·L-1)進行篩選(嘌呤霉素持續(xù)加入，潮霉素B加24 h撤24 h，反復(fù)3次)，根據(jù)細(xì)胞死亡情況及時更換培養(yǎng)基。常規(guī)傳代，待細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)好后，藥物濃度加大1倍進一步篩選，待細(xì)胞篩純后，藥物濃度減半維持。

1.2.5RT-PCR檢測miR-183在skov3細(xì)胞中的表達 細(xì)胞轉(zhuǎn)染篩純后，用miRNA提取分離試劑盒提取miR-183，并檢測RNA質(zhì)量及濃度。按照All-in-One TM miRNA qRT-PCR Detection Kit 說明書將miR-183反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并擴增，均以U6為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 30 s延伸，共40個循環(huán)。

2結(jié)果

2.1嘌呤霉素、潮霉素B篩選濃度嘌呤霉素、潮霉素B篩選正常skov3細(xì)胞3 d后，嘌呤霉素濃度≥1 mg·L-1，潮霉素B濃度≥120 mg·L-1時，skov3細(xì)胞全部死亡。嘌呤霉素，潮霉素B的最佳篩選濃度分別為1 mg·L-1、120 mg·L-1。大約篩選10～14 d可獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

2.2包裝病毒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選293T細(xì)胞24 h即出現(xiàn)熒光，48 h熒光最強。由圖1可見穩(wěn)轉(zhuǎn)的skov3細(xì)胞株。其中，pEZX-MR03-183 mimics及NC攜帶eGFP標(biāo)簽發(fā)出綠色熒光，pEZX-AM03-183 inhibitor及NC攜帶RFP標(biāo)簽發(fā)出紅色熒光，并且細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化。

2.3skov3細(xì)胞中miR-183的相對表達量RT-PCR檢測miR-183在各組穩(wěn)轉(zhuǎn)skov3細(xì)胞株中的表達，包括4組分別為miR-183 mimics 及NC，miR-183 mimics及NC。采用經(jīng)典的2-ΔΔCt相對定量計算方法來計算各組間的表達差異，與NC組相比較，inhibitor組下調(diào) 0.19倍，而mimics組上調(diào)13.54倍。

A、B為上調(diào)NC；C、D為miR-183 mimics；

3討論

異常表達的miRNA可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥等過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)與卵巢癌細(xì)胞相關(guān)的miRNA包括：miR-7f、miR-10b、miR-21、miR-34、miR-145、miR-152、miR-181、miR-199a、miR-29a、miR-126、miR-101、miR-200c、miR-100、miR-182、miR-16、miR-15a、miR-20a、miR-205、miR-214等[12-20]在卵巢癌中表達異常。其中，miR-183在卵巢癌也是異常表達的[8-11]，但其究竟扮演癌基因還是抑癌基因的角色仍存在爭議。Dahiya等研究表明miR-183在卵巢癌組織中下調(diào)0.45倍。與正常卵巢組織相比hsa-miR-183-5p在卵巢癌組織中上調(diào)，提示miR-183可能參與卵巢癌的發(fā)展。與相對低侵襲力的skov3細(xì)胞相比較，miR-183在高侵襲力的SKOV3ip細(xì)胞中呈低表達[10]。通過建立穩(wěn)定表達miR-183的卵巢癌細(xì)胞系，來進一步研究miR-183對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響更是少見報道。

本實驗首先構(gòu)建真核表達載體pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及相應(yīng)NC，通過慢病毒介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)染至skov3細(xì)胞中，再用嘌呤霉素、潮霉素B對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進行篩選，最終獲得穩(wěn)定表達miR-183的skov3細(xì)胞系。其中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選過程至關(guān)重要，由于轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的轉(zhuǎn)染效果影響很大，所以應(yīng)保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。而慢病毒液對細(xì)胞有毒性作用，剛轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞狀態(tài)不好，篩選時間及藥物濃度不易掌握，可常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至其狀態(tài)好轉(zhuǎn)后再篩選。并且，在篩選過程中要及時觀察細(xì)胞狀態(tài)，以免篩選過度損傷轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞導(dǎo)致實驗失敗。本研究通過RT-PCR檢測各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中miR-183的表達情況，成功建立miR-183慢病毒介導(dǎo)的skov3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為以后進一步研究miR-183與卵巢癌skov3細(xì)胞生物學(xué)特性(增殖、凋亡、侵襲、耐藥、裸鼠成瘤等)的相關(guān)性提供細(xì)胞學(xué)模型，為研究miR-183與卵巢癌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Hartge P.Designing early detection programs for ovarian cancer.J Natl Cancer Inst,2010,102(1):3-4.

[2]Jayde V,White K,Blomfield P.Symptoms and diagnostic delay in ovarian cancer: a summary of the literature.Contemp Nurse,2010,34(1):55-65.

[3]Fotopoulou C,Savvatis K,Steinhagen-Thiessen E,et al.Primary radical surgery in elderly patients with epithelial ovarian cancer:analysis of surgical outcome and long-term survival.Int J Gynecol Cancer,2010,20(1):34-40.

[4]Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.Nat Rev Genet,2009,10(10):704-714.

[5]Pratt AJ,MacRae IJ.The RNA-induced silencing complex:a versatile gene-silencing machine.J Biol Chem,2009,284(27):17897-17901.

[6]Flynt AS,Lai EC.Biological principles of microRNA-mediated regulation:shared themes amid diversity.Nat Rev Genet,2008,9(11):831-842.

[7]Van Jaarsveld MT,Helleman J,Berns EM,et al.MicroRNAs in ovarian cancer biology and therapy resistance.Int J Biochem Cell Biol,2010,42(8):1282-1290.

[8]Dahiya N,Sherman Baust CA,Wang TL.MicroRNA expression and identification of putative miRNA targts in ovarian cancer.PLoS One,2008,3(6):2346.

[9]Wang L,Zhu MJ,Ren AM,et al.A ten-microRNA signature identified from a genome-wide microRNA expression profiling in human epithelial ovarian cancer.PLoS One,2014,9(5):96472.

[10]李俊,梁山輝,Maria Al-beit,等.卵巢上皮惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的篩選與鑒定.中華腫瘤雜志,2010,32(9):650-654.

[11]Li J,Liang S,Jin H,et al.Tiam1,negatively regulated by miR-22,miR-183 and miR-31,is involved in migration,invasion and viability of ovarian cancer cells.Oncol Rep,2012,27(6):1835-1842.

[12]Guo LM,Pu Y,Han Z,et al.MicroRNA-9 inhibits ovarian cancer cell growth through regulation of NF kappaB1.FEBSJ,2009,276(19):5537-5546.

[13]Guan Y,Yao H,Zheng Z,et al.MiR-125b targets BCL3 and suppresses ovarian cancer proliferation.Int J Cancer,2011,128(10):2274-2283.

[14]Semaan A,Qazi A M,Seward S,et al.MicroRNA-101 inhibits growth of epithelial ovarian cancer by relieving chromatin mediated transcriptional repression of p21( waf1/cip1).Pharm Res,2011,28(12):3079-3090.

[15]Chung YW,Bae HS,Song JY,et al.Detection of MicroRNA as novel biomarkers of epithelial ovarian cancer from the serum of ovarian cancer patient.Int J Gynecol Cancer,2013,23 (4):673-679.

[16]Nam EJ,Yoon H,Kim SW,et al.MicroRNA expression profiles in serous ovarian carcinoma.Clin Cancer Res,2008,14:2690-2695.

[17]Sun F,Fu HJ,Liu Q,et al.Downregulation of CCND1 and CDK6 by miR-34a induces cell cycle arrest . FEBS Lett,2008,582(10):1564-1568.

[18]Zhang L,Volinia S,Bonome T,et al.Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(19):7004-7009.

[19]Peng DX,Luo M,Qiu LW,et al.Prognostic implications of microRNA-100 and its functional roles in human epithelial ovarian cancer.Oncol Rep,2012,27(4):1238-1244.

[20]Lou Y,Yang X,Wang F,et al.MicroRNA-21 promotes the cell proliferation invasion and migration abilities in ovarian epithelial carcinomas through inhibiting the expression of PTEN protein.Int J Mol Med,2010,26(6):819-827.

Establishment of Human Ovarian Cancer Skov3 Cell Line Stably

Expressing miR-183 by Lentiviral System

CHEN Ya-wei,FAN Dong-mei,LIU Gang,et al

(First Affiliated Hospital，Henan University of Science & Technology，Luoyang 471003，China)

Abstract:ObjectiveTo establish human ovarian cancer skov3 cell line stably expressing miR-183. MethodsThe gene of Pre-miR-183,has-miR-183 inhibitor were cloned into eukaryotic expression vector,respectively,yielding pEZX-MR03-183 mimics, pEZX-AM03-183 inhibitor. The pEZX-MR03-183 mimics,pEZX-AM03-183 inhibitor were transfected into 293T cells for acking lentivirus, and the lentivirus transfected in human ovarian cancer skov3 cells. Screening with puromycin and hygromycin B, there got the stable transfection skov3 cell line, and through RT-PCR to verify the expression of miR-183 at transcription level. ResultsThe monoclonal skov3 cell line with stable high and low expression of miR-183 were successfully isolated and cultured.ConclusionThe study successfully establish the stably transfected skov3 cell lines of miR-183 that could be used to be an effective cell model to research the biological functions of miR-183.

Key words:lentivirus；skov3 cell；miR-183；ovarian cancer

通信作者：田曉予，女，博士，教授，E-mai：tiaoxiaoy1210@163.com

作者簡介：陳亞偉(1988-)，女，河南開封人，從事婦科腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究工作。

收稿日期：2015-07-09

中圖分類號：R737.31

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-688X(2015)04-0248-04