劉春靈，王記紅，高鳳蘭，王艷偉

（河南省漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 病理教研室，河南 漯河 462002）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)生受多種因素的調(diào)控。線粒體促凋亡因子Omi/ HtrA2是屬于絲氨酸蛋白水解酶家族的一種蛋白質(zhì)分子，參與細(xì)胞凋亡的下游反應(yīng)，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有促凋亡效應(yīng)。Caspase是一類促凋亡蛋白，Caspases-9是其中重要的一個(gè)，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，也是Caspase家族的最重要的起始因子[1-2]。本研究著重探討食管癌中Omi/HtrA2及Caspase-9的表達(dá)及其與凋亡之間的關(guān)系，為食管癌的發(fā)生、發(fā)展及靶基因治療、預(yù)后等基礎(chǔ)和臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇2009年1月-2012年12月漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理檢驗(yàn)研究中心、鄭州大學(xué)二附院和漯河市臨穎縣人民醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本80例。其中，男40例，女40例；年齡33～81歲；80例均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。80例標(biāo)本中高分化27例、中分化37例和低分化16例，組織學(xué)類型經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確診，均為鱗狀細(xì)胞癌；癌旁組織組40例，選擇的是同期食管癌切除標(biāo)本斷端(距腫瘤＜2 cm)；正常組織組40例，同樣取的是同期食管癌患者陰性組織（距癌灶邊緣＞5 cm）。80例患者具備完整的臨床資料，術(shù)前均未接受任何相關(guān)治療。即用型免疫組化SP試劑盒、DAB染色試劑盒及TUNEL檢測(cè)（TdT-mediated dUTP-End Labeling）試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。鼠抗人Omi/ HtrA2、Caspase-9單克隆抗體購(gòu)自北京中山公司。

1.2 方法

采用SP法檢測(cè)Omi/HtrA2蛋白和Caspase-9蛋白的表達(dá)。陽性對(duì)照選擇已知陽性切片，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）代替，具體按試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index, AI）采用TUNEL法，每批染色均設(shè)陰性空白對(duì)照和陽性對(duì)照，前者以PBS代替TUNEL混合液，具體按試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。Caspase定位于細(xì)胞漿，Omi/HtrA2定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，Omi/HtrA2陽性染色均為淡黃色、棕黃色或棕褐色。

評(píng)分方法與染色強(qiáng)度見文獻(xiàn)[3]。TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果判定按文獻(xiàn)[4]的方法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性用Spearman等級(jí)資料進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Omi/HtrA2、Caspase-9蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)

Omi/HtrA2主要表達(dá)于癌組織細(xì)胞的胞漿中。Omi/HtrA2、Caspase-9在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率分別為76.25%、58.75%，在癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為27.50%、72.50%，在正常組織中的陽性表達(dá)率分別為22.50%、85.00%；Omi/HtrA2、Caspase-9蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率與其在癌旁組織、正常組織中蛋白的陽性表達(dá)率分別進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；癌旁組織與正常組織的Omi/HtrA2和Caspase-9蛋白陽性表達(dá)率進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 食管鱗癌組織中Omi/HtrA2和Caspase-9蛋白表達(dá)與凋亡的關(guān)系

Omi/HtrA2蛋白表達(dá)陽性組癌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（18.186±1.331）‰，明顯高于陰性組凋亡指數(shù)（5.108±1.783）‰ （t?=34.379，P＜0.01）；Caspase-9蛋白表達(dá)陽性組細(xì)胞凋亡指數(shù)為（17.763±0.675）‰，明顯高于陰性組細(xì)胞凋亡指數(shù)（11.619±0.712）‰（t?=39.183，P＜0.01）。

3 討論

細(xì)胞凋亡受阻可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在目前已知的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中，凋亡抑制蛋白、促凋亡蛋白發(fā)揮重要作用，Omi/HtrA2與Caspase-9便是其中重要的組成部分。Omi/HtrA2是一種促凋亡因子，可通過抑制活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在凋亡信號(hào)的刺激下，Omi/HtrA2由線粒體釋放入胞漿，轉(zhuǎn)化成具有促凋亡功能的成熟分子形式，與凋亡抑制蛋白家族（IAPs）作用，并激活Caspase酶原。Caspase-8、Caspase-9在級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[5-7]。羅特東等[8]用免疫組化檢測(cè)結(jié)直腸癌中Omi/HtrA2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2的表達(dá)與病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。張方林等[9]研究結(jié)果表明在膀胱移行細(xì)胞癌組織中Omi/HtrA2的陽性表達(dá)率明顯高于正常黏膜組織和癌旁組織，并且與膀胱癌病理分級(jí)有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，Omi/HtrA2定位于癌組織細(xì)胞的胞漿中。Omi/HtrA2在食管鱗癌組織中高表達(dá)，陽性表達(dá)率為76.25%，在食管正常組織、癌旁組織低表達(dá)，其陽性率分別為22.50%、27.50%。Omi/ HtrA2在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別與癌旁組織、正常組織中的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Omi/HtrA2在癌旁組織與正常組織的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)研究結(jié)果表明，Caspase-9在食管鱗癌組織中表達(dá)相對(duì)較低，陽性表達(dá)率為58.75%，在正常組織、癌旁組織中陽性表達(dá)率分別為85.00%、72.50%。Caspase-9在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率分別與癌旁組織、正常組織中的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Caspase-9在癌旁組織與正常組織的陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示Omi/ HtrA2、Caspase-9在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用。Omi/HtrA2的高表達(dá)可能是食管癌耐受凋亡的又一重要原因。本研究結(jié)果顯示Omi/HtrA2和Caspase-9出現(xiàn)相反的表達(dá)，預(yù)示著Caspase介導(dǎo)的凋亡途徑可能有更加復(fù)雜的機(jī)制，分析這兩種因子在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)狀況及相互作用，為惡性腫瘤的治療提供新途徑，為腫瘤基因治療提供新的可能的靶點(diǎn)。

[1]Boatright KM, Salvesen GS. Mechanisms of caspase activation[J].Curr Opin Cell Biol, 2003, 15(6)： 725-731.

[2]Roy S, Packman K, Jeffrey R, Tenniswood M. Histone deacetylase inhibitors differentially stabilize acetylated p53 and induce cell cycle arrest or apoptosis in prostate cancer cells[J]. Cell Death Differ,2005. 12(5)： 482-491.

[3]Wang J, Saunthararajah Y, Redner RL, et al. Inhibitors of histone deacetylase relieve ETO-mediated repression and induce differentiation of AML1-ETO leukemia cells[J]. Cancer Res, 1999,59(12)： 2766-2769.

[4]Butler LM, Zhou X, Xu WS, et al. The histone deacetylase inhibitor SAHA arrests cancer cell growth, up-regulates thioredoxin-binding protein-2, and down-regulates thioredoxin[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(18)： 11700-11705.

[5]Ding Y, Nguyen TA. PQ1 a quinoline derivative, induces apoptosis in T47D breast cancer cells through activation of caspase-8 and caspase-9[J]. Apoptosis, 2013, 18(9)： 1071-1082.

[6]倪文凱, 于東風(fēng), 劉弋. Livin、Caspase-9在十二指腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 49(3)： 410-412.

[7]余大海, 王超奇, 王明. Survivin、Caspase-3在膀胱癌中的表達(dá)及預(yù)后意義[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2013, 21(8)： 1837-1839.

[8]羅特東, 陳創(chuàng)奇, 馬晉平, 等. Omi/HtrA2及Caspase-8在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義[J/CD]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013, 7(14)： 98-101.

[9]張方林, 趙延敏, 喬廣兵, 等. 線粒體促凋亡因子Omi/HtrA2在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志, 2010,39(4)： 401-403.