陳挺 張雪 翁海旭 馬超群 鄭興 肖良

G蛋白偶聯(lián)受體偏倚配體及其在心血管藥物研究中的應(yīng)用

陳挺 張雪 翁海旭 馬超群 鄭興 肖良

G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor, GPCR）藥物是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的一類藥物，約占整個藥品市場份額的1/3。其中，它在心血管疾病中的應(yīng)用尤為突出，包括降壓、強心、防止血栓形成等各個方面[1]。近年來，隨著對GPCR功能認識的不斷深入，越來越多的藥理學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，GPCR信號通路具有靶向效應(yīng)[2]。“偏倚配體”是一類可以將受體選擇性地穩(wěn)定在不同構(gòu)象的配體分子，能夠激活GPCR下游某些特定的信號通路，從而避免通路全部激活產(chǎn)生的不良反應(yīng)，具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景[3]。

1 G蛋白與β-arrestin介導(dǎo)的GPCR信號通路

GPCR基因家族在人類基因組中最為龐大，幾乎表達于機體所有組織中并影響體內(nèi)幾乎所有的生理反應(yīng)。GPCR與激素、神經(jīng)遞質(zhì)以及代謝產(chǎn)物等細胞外信號結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化，通過偶聯(lián)的相關(guān)功能蛋白觸發(fā)細胞內(nèi)的信號反應(yīng)。越來越多的研究表明，除異三聚體G蛋白之外，GPCR還可以偶聯(lián)多種細胞內(nèi)信號蛋白并介導(dǎo)特定的信號通路[4]。作為許多功能蛋白的支架，β-arrestin是其中最為普遍的、發(fā)揮重要功能的調(diào)節(jié)蛋白，在有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、酪氨酸激酶信號通路以及磷酸酶相關(guān)的信號通路等多種信號通路中，它可以使胞內(nèi)信號蛋白之間的聯(lián)系更為緊密從而有利于通路的活化[5]。隨著基因芯片等技術(shù)的應(yīng)用，人們逐漸發(fā)現(xiàn)GPCR是通過復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮功能效應(yīng)的GPCR藥理學(xué)概念將突破傳統(tǒng)標準得到不斷更新。

2 配體偏倚理論

經(jīng)典的受體藥理學(xué)認為配體分子（激動劑或抑制劑）與某一特定GPCR結(jié)合后引起受體構(gòu)象變化，通過單一的信號機制來發(fā)揮特定的功能效應(yīng)。在這種模式主導(dǎo)下，經(jīng)典受體藥理學(xué)根據(jù)單一配體-受體結(jié)合的親和力和效力差異將GPCR配體分為完全激動劑、部分激動劑、中性拮抗劑以及反向激動劑等類型。然而最新研究表明，除親和力和效力外，不同GPCR配體分子（激動劑或抑制劑）還可以結(jié)合相同或不同的GPCR觸發(fā)更為廣泛的信號網(wǎng)絡(luò)，通過對不同信號通路的選擇性而發(fā)揮特定的功能效應(yīng)與藥理作用[4]。

最早關(guān)于偏倚配體的描述來源于α2腎上腺素受體（α2adrenergic receptor,α2-AR）的幾種激動劑可以分別偶聯(lián)Gαs、Gαi而產(chǎn)生不同效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，研究者們據(jù)此推測不同配體分子可以通過誘導(dǎo)其受體的不同構(gòu)象變化而產(chǎn)生特定的藥理作用。此后，不同垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽類似物引起完全相反的藥理效應(yīng)、不同激動劑引起受體內(nèi)化的差異等研究進一步支持了配體偏倚的理論。研究證實，偏倚配體能夠直接將受體穩(wěn)定在不同的構(gòu)象，激活特定的受體下游信號通路[6]。配體偏倚與系統(tǒng)無關(guān)，是配體-受體相互作用的固有特性，僅與細胞類型以及受體密度等因素有關(guān)[7]。盡管理論上配體偏倚可以發(fā)生于既定受體的任意兩個信號通路之間，如G蛋白與G蛋白之間的偏倚、β-arrestin不同亞型之間的偏倚甚至β-arrestin不同狀態(tài)之間的偏倚等，但G蛋白和β-arrestin偶聯(lián)是配體作用于受體后細胞內(nèi)應(yīng)答的第1步，且多數(shù)GPCR至少偶聯(lián)1個G蛋白和1個β-arrestin。因此G蛋白和β-arrestin之間的偏倚非常有利于實現(xiàn)GPCR的功能選擇性，代表了受體偏倚理論的一般機制，也是目前偏倚配體機制研究的熱點以及偏倚配體新藥研究的直接靶標[8-9]。

一般地，配體可以通過競爭受體內(nèi)源性激動劑的結(jié)合位點或占據(jù)發(fā)揮特定變構(gòu)調(diào)節(jié)作用的結(jié)合位點產(chǎn)生偏倚作用，目前配體偏倚的研究多圍繞受體內(nèi)源性配體或某些常用的藥物相關(guān)信號通路進行。其中正位偏倚配體可能是參與完全激動劑引發(fā)的部分受體構(gòu)象變化而產(chǎn)生對下游信號通路的功能選擇性。而變構(gòu)偏倚配體則可能是通過作用于一個非標準的結(jié)合位點使受體直接穩(wěn)定在特定的“活性”構(gòu)象（變構(gòu)激活）或者通過正位激動劑使受體不能形成某些特定構(gòu)象（變構(gòu)調(diào)節(jié)）而實現(xiàn)其功能選擇性，如CRTH2配體可以在不影響G蛋白信號通路的情況下阻斷激動劑對β-arrestin信號通路的激活效應(yīng)、M1受體變構(gòu)調(diào)節(jié)劑BQCA可以促進β-arrestin的結(jié)合以及NK2受體的配體LPI805促進Gαs的解離和Gαq的結(jié)合等[10-12]，這種類似于變構(gòu)調(diào)節(jié)的功能選擇性被稱為“偏倚變構(gòu)調(diào)節(jié)”，在偏倚配體新藥研究中得到了廣泛應(yīng)用。

3 心血管受體的重要偏倚配體

心血管系統(tǒng)GPCR是目前新藥研究最成功的靶點，其中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1R）、β腎上腺素能受體（β-Adrenergic Receptor,β-AR）以及煙酸受體是目前研究最多的心血管系統(tǒng)GPCR，也是偏倚配體新藥研究最具臨床應(yīng)用潛力的作用靶點。

3.1 AT1R AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵產(chǎn)物之一，能夠作用于AT1R等GPCR調(diào)節(jié)血管收縮和醛固酮分泌，在水電解質(zhì)平衡過程中發(fā)揮重要作用。AT1R主要通過偶聯(lián)Gαq介導(dǎo)下游信號通路，對細胞內(nèi)調(diào)節(jié)進行精細調(diào)控并廣泛參與其他信號通路的活化，包括PKC與GPCR激酶（G-protein-coupled receptor kinase, GRK）的磷酸化、受體內(nèi)化、β-arrestin的募集與信號通路的活化、表皮生長因子受體的反式激活以及Src蛋白和JAK/STAT的激活等[13-14]。

AT1R介導(dǎo)的信號通路并不完全依賴于G蛋白，可以被偏倚配體活化。目前研究主要是通過誘導(dǎo)關(guān)鍵氨基酸突變來研究AngⅡ?qū)T1R構(gòu)象的影響及其信號通路，如大鼠AT1aR的DRY模體（氨基酸125-127）突變可以阻斷其與Gαq偶聯(lián)但不影響AngⅡ引起的受體磷酸化、內(nèi)化以及β-arrestin的募集等過程[15]，AT1R第2個胞內(nèi)環(huán)突變會阻斷其與Gαq或Gαi的偶聯(lián)等[16]。體外siRNA干擾或體內(nèi)基因敲除β-arrestin1或β-arrestin2的研究則表明β-arrestin參與了AT1R介導(dǎo)的ERK1/2、RHO、Mnk1、MDM2等多條信號通路活化過程[17-18]。研究還發(fā)現(xiàn)機械拉伸作用可以激活β-arrestin2而非G蛋白依賴性的信號通路，與ARB作用類似，AT1R或β-arrestin2敲除均會促進拉伸誘導(dǎo)的細胞凋亡，說明β-arrestin2在AT1R介導(dǎo)的藥理過程中發(fā)揮保護心臟的作用[19]。

使用選擇性激活β-arrestin信號通路的偏倚配體可以強化β-arrestin對AT1R的功能影響，如最為常用的AT1R偏倚配體1Sar-4Ile-8Ile-AngⅡ（SⅡ）可以通過偶聯(lián)β-arrestin促進AT1R磷酸化、內(nèi)化及ERK的活化，卻不會偶聯(lián)G蛋白而避免促磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）在細胞膜上的翻轉(zhuǎn)[20]。另外，SⅡ偶聯(lián)β-arrestin后介導(dǎo)的ERK1/2信號通路可以促進蛋白質(zhì)合成、生長與增殖，減少細胞凋亡以及增強心臟收縮力等，而不會出現(xiàn)AngⅡ結(jié)合后ERK1/2活化引起的心肌肥厚。這表明利用SⅡ等偏倚配體與內(nèi)源性AngⅡ競爭AT1R，可以在拮抗部分AT1R不良反應(yīng)的同時選擇性增強偏倚配體信號通路的藥理效應(yīng)。之后，研究者們最近發(fā)現(xiàn)了一種比SⅡ效力更強的選擇性激活β-arrestin信號通路的AT1R偏倚配體TRV120027[21]，其優(yōu)勢在于拮抗AngⅡ引起的高血壓的同時更高效地競爭AT1R從而增加心肌收縮力，改善心臟功能。相比之下，經(jīng)典ARB與TRV120027的降壓效果相當，但無法改善心臟功能甚至在某些情況下會導(dǎo)致心臟功能的惡化[21]。對犬心力衰竭模型的研究表明，TRV120027可以降低動脈血壓和肺毛細血管楔壓，同時增加心輸出量、保護腎功能并改善急性心力衰竭癥狀，有望成為偏倚配體臨床藥物開發(fā)的典范[22-23]。

因此，從信號通路研究有效性的角度來看，AT1R是一個偏倚配體作用有效、藥理學(xué)效力明確的可用于新藥研究的成功例證。其偏倚配體如TRV120027不僅具有ARB抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)降血壓的功能，還具備β-arrestin信號通路激活的特定藥理學(xué)作用，可能對急性心力衰竭、心功能下降以及神經(jīng)內(nèi)分泌過度活化和系統(tǒng)性全身血管阻力升高等疾病具有良好的治療或保護作用[24]。

3.2 β-AR β-AR阻滯劑自發(fā)現(xiàn)以來一直都是臨床上最重要的心血管系統(tǒng)藥物之一，能夠抑制內(nèi)源性兒茶酚胺激活心臟β1-AR信號通路產(chǎn)生的變時、變力、變傳導(dǎo)作用，是目前臨床上治療心肌梗死、心律失常以及高血壓等心血管疾病的最常用藥物。相反，β2-AR激動劑能夠激活β2-AR信號通路而降低外周血管張力，也可降低氣道收縮性治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病。

β-AR阻滯劑的療效非常顯著，以致于人們一度認為偏倚配體增強其療效的利用空間十分有限。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)β1-AR通過偶聯(lián)β-arrestin可以磷酸化EKR1/2、反式激活EGF受體，發(fā)揮心臟保護作用[25]。進一步β1-AR基因突變研究發(fā)現(xiàn)，長期異丙腎上腺素刺激對GRK磷酸化位點表達缺失的GRK-β1AR[26]轉(zhuǎn)基因小鼠（不能募集β-arrestin）的心臟功能有損傷作用，而不會對PKA磷酸化位點缺失的PKA-β1AR轉(zhuǎn)基因小鼠（不能通過PKA脫敏）的心臟功能產(chǎn)生影響，提示β1-AR偶聯(lián)的G蛋白和β-arrestin信號通路之間存在一個與細胞凋亡相關(guān)的長期正性肌力作用和心臟保護作用之間的平衡。在β-arrestin信號通路缺失、平衡被打破的情況下，單獨偶聯(lián)G蛋白介導(dǎo)的信號通路會增加細胞凋亡并損傷心臟功能。另一條β1-AR激動劑相關(guān)的信號通路是心肌梗死后Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/ calmodulin-dependent kinaseⅡ,Ca2+/CaMKⅡ）的活化。研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin2對β1-AR募集激活Ca2+/CaMKⅡ并活化下游信號通路引起心臟功能的下降是十分必要的[27]，理論上這條通路可以抵消β1-AR偶聯(lián)β-arrestin發(fā)揮的心臟保護作用。但由于β1-AR偶聯(lián)β-arrestin激活Ca2+/CaMKⅡ的過程中需要cAMP，這條通路不大可能是由拮抗G蛋白通路cAMP生成的β-arrestin介導(dǎo)，β-arrestin偏倚配體的總藥理效應(yīng)還應(yīng)該是發(fā)揮心臟保護作用的。因此，非G蛋白依賴性偶聯(lián)β-arrestin信號通路的偏倚配體具有拮抗β1-AR信號通路、降低心臟功能的潛力。在最近一項研究測試的20種β-AR阻滯劑中，只有卡維地洛和阿普洛爾能夠激活β-arrestin介導(dǎo)的EGF受體反式激活信號途徑，發(fā)揮心臟保護作用[28]。研究表明，卡維地洛在治療心肌梗死后的心血管事件以及降低病死率方面具有較其他β-AR阻滯劑更大的優(yōu)勢[29]。

4 偏倚配體新藥研究的驗證與挑戰(zhàn)

與傳統(tǒng)藥物靶點相比，偏倚配體的藥物開發(fā)更為復(fù)雜，因為它不僅需要驗證新藥靶點的相關(guān)性及其調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)的潛力，還至少要檢測一條受體后不良反應(yīng)相關(guān)的信號通路，從而在疾病中選擇最佳的藥物干預(yù)措施。盡管目前發(fā)現(xiàn)AT1R、β-AR及GPR109a等心血管系統(tǒng)重要受體具有獨立的藥理學(xué)作用和新的偏倚配體開發(fā)潛力，但總體而言配體偏倚新藥研究的成功案例非常少，可供參考的研究資料極為有限。其中的一個難點就在于缺乏區(qū)別內(nèi)源性配體偏倚、特定條件下的功能選擇性或者不同研究體系之間功能差異的簡便判斷標準。從功能選擇性的角度，對偏倚配體基礎(chǔ)研究的吸引力在于檢測激動劑是否可以通過開發(fā)偏倚配體而“拯救”用于新藥研究的受體靶點。GPCR偏倚配體研究，尤其是對那些具有實際臨床意義但不良反應(yīng)明顯的“問題”配體將具有重要的實用價值[30]。

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2016-02-22）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學(xué)基金面上項目（81470518，81170092）

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院心內(nèi)科（陳挺、鄭興）；中國藥科大學(xué)信息管理與信息系（張雪）；溫州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院ICU（翁海旭）；第二軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系（馬超群、肖良）

肖良，E-mail：hormat830713@hotmail.com