白杰，李德芳，陳安國，李建軍，黃思齊，唐慧娟

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙 410205)

HPLC法測定紅麻青貯飼料中的有機(jī)酸

白杰，李德芳*，陳安國，李建軍，黃思齊，唐慧娟

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙 410205)

摘要：運(yùn)用高效液相色譜法對紅麻青貯飼料中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸4種有機(jī)酸的含量進(jìn)行同時測定。采用0.02 mol/L NaH2PO4(pH=2.70)與甲醇作為流動相，在Dionex Ultimate 3000液相色譜儀，色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18柱，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣體積20 μL條件下對青貯樣品有機(jī)酸含量進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，4種待測有機(jī)酸在預(yù)定檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.9982)，精密度變異系數(shù)<5%，樣品回收率在98.73%～102.79%之間。該方法操作簡單準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于紅麻青貯飼料中有機(jī)酸的測定。

關(guān)鍵詞：紅麻；青貯；高效液相色譜法；有機(jī)酸

紅麻(kenaf)，錦葵科木槿族植物(HibiscuscannzzbinusL．)，一年生韌皮纖維植物，廣泛種植于東南亞、歐洲及中國南方部分地區(qū)，被認(rèn)為是多用途作物[1-3]。從上世紀(jì)60年代開始，美國學(xué)者便率先開展了紅麻飼用的研究，國內(nèi)外研究表明，紅麻粗蛋白含量高，產(chǎn)量高，且具有較好的適口性，營養(yǎng)價值很高，適合飼喂家禽和家畜[4-9]。紅麻可以作為一種高營養(yǎng)價值的非糧型飼料原料，用以緩解中國南方地區(qū)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料匱乏的矛盾。

青貯飼料中有機(jī)酸的含量是評定青貯飼料質(zhì)量的重要理化指標(biāo)[10]。青貯過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸主要分為四種，乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)和丁酸(Butyric acid，BA)。其中，乳酸含量是反映青貯飼料品質(zhì)的最重要指標(biāo)，乙酸和乳酸是降低青貯飼料pH值的主要因素，丙酸可以抑制二次發(fā)酵，而丁酸的含量則直接反映了青貯飼料的腐敗程度[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道中已有利用高效液相色譜法測定各種青貯飼料中有機(jī)酸的方法。由于國內(nèi)研究起步較晚，有關(guān)紅麻青貯飼料品質(zhì)的測定評估方法鮮有報(bào)道。本研究旨在利用高效液相色譜法建立一種方便快捷的檢測方法，為紅麻青貯飼料中有機(jī)酸的測定奠定方法基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器、試劑

供試紅麻品種為福紅992，試驗(yàn)材料采集于湖南省長沙市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)基地。紅麻生長期65天進(jìn)行刈割，粉碎機(jī)粉碎至1～1.5 cm，裝罐，密封避光處青貯，青貯60天后取出為紅麻青貯樣。

Dionex Ultimate 3000液相色譜儀，LPG-3400型泵，VWD-3400紫外檢測器，Thermo Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，青貯罐(PE材質(zhì)，體積1000 mL，帶內(nèi)蓋，壁厚不低于1.5 mm，直徑11 cm)。

乳酸、乙酸、丙酸和丁酸均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海晶純(阿拉丁)生化科技股份有限公司；甲醇(色譜純，德國默克)；超純水。

1.2方法

1.2.1樣品浸提液制備提取

充分參考紫花苜蓿和王草[13-14]等作物青貯飼料有機(jī)酸浸提液制備方法，準(zhǔn)確稱取20 g紅麻青貯樣品于250 mL三角瓶中，加入200 mL蒸餾水，攪拌均勻；置于恒溫震蕩箱，震蕩24 h(4℃，120 r/min)；震蕩提取液用4層紗布過濾，再用定量濾紙過濾兩次即得紅麻青貯浸提液，置于-20℃保存；解凍后用0.45 μm水系濾膜[14]過濾，過濾后的浸提液可直接用于色譜分析。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用超純水配制初始濃度為乳酸30 mg/mL，乙酸30 mg/mL，丙酸20 mg/mL和丁酸20 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，然后逐級稀釋成5個梯度(見表1)。將混合標(biāo)準(zhǔn)液用0.45 μm水系濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC分析，所得數(shù)據(jù)用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(峰面積Y對質(zhì)量濃度X求回歸曲線方程和相關(guān)系數(shù))。

表1混合標(biāo)樣溶液中有機(jī)酸濃度

Tab.1The concentration of organic acids of mixed standard organic acids

1.2.3色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為甲醇，流動相B為0.02 mol/L NaH2PO4(磷酸調(diào)節(jié)pH至2.70)。等梯度洗脫，流動相為14% A，86% B，單個樣品運(yùn)行時間25 min，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣體積20 μL。

2結(jié)果分析

2.1有機(jī)酸色譜條件確定

2.1.1檢測波長的確定

供試青貯樣浸提液待檢測組分為乳酸、乙酸、丙酸和丁酸，均屬于有機(jī)一元酸。在205 nm～215 nm范圍內(nèi)對四種酸進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在本試驗(yàn)儀器條件下，波長210 nm時，四種酸出峰情況較其他波長好，因此檢測波長選定為210 nm。

2.1.2流動相與洗脫方法的確定

實(shí)際的文獻(xiàn)報(bào)道中，HPLC測定有機(jī)酸多可利用緩沖鹽溶液以及酸溶液控制流動相的pH。緩沖鹽類中，(NH4)3HPO4-H3PO4，KH2PO4-CH3OH 以及NaH2PO4-H3PO4均有報(bào)道，其pH均控制在2.65左右。酸溶液類中，H3PO4，H2SO4以及HClO4均有報(bào)道，其水溶液pH控制在2.65左右。參考文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)將0.02 mol/L NaH2PO4- H3PO4緩沖液和甲醇作為流動相，試驗(yàn)中當(dāng)NaH2PO4- H3PO4溶液pH為2.70時可以分離出四種有機(jī)酸，且效果好于pH值為2.50、2.60和2.80時的分離效果。

洗脫方法確定過程中，分別加入了6%、8%、10%、12%、14%、16%的甲醇，相對應(yīng)的磷酸鹽緩沖液的含量分別為94%、92%、90%、88%、86%、84%，在上述的六種條件下進(jìn)行測定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甲醇含量為6%、8%時四種有機(jī)酸出峰很小，并且乳酸跟乙酸不能很好分離且丙酸出峰極小，難以達(dá)到良好效果；甲醇含量10%、12%時四種有機(jī)酸峰型得到改善，乳酸跟乙酸峰型得到較好分離，但是丙酸依舊峰型較小；甲醇含量為16%時，基線漂移較大，開始影響檢測準(zhǔn)確度。在本試驗(yàn)檢測儀器的條件下，甲醇含量為14%的時候能夠較好的分離出四種有機(jī)酸，因此，本試驗(yàn)采用0.02 mol/L NaH2PO4- H3PO4和甲醇作為流動相進(jìn)行洗脫。本試驗(yàn)中14%甲醇含量已經(jīng)較高，如果甲醇含量過高可能會影響檢測的準(zhǔn)確性，在該條件下，丙酸的峰型有輕微拖尾現(xiàn)象，因此該色譜條件仍需要進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.1.3流速與柱溫的確定

在柱溫30℃條件下，對0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min五種流速進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)流速過低會導(dǎo)致檢測時間變長，對組分的分離并無明顯影響；而當(dāng)流速過高時，分離時間會明顯縮短，但是柱壓增高明顯，綜合考慮安全和時間因素，采用1.0 mL/min的流速。

溫度的升高可使流動相的粘度降低，提高柱效，降低保留時間。在本試驗(yàn)條件下，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在25℃、30℃、35℃、40℃四種柱溫條件下測試分析表明30℃能很好分離四種有機(jī)酸，峰型合適，因此選定柱溫為30℃。

根據(jù)上述試驗(yàn)篩選條件，混合標(biāo)樣(圖1)和樣品(圖2)中的4種有機(jī)酸均得到了較好的分離。

2.2有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對5個梯度的混標(biāo)溶液進(jìn)行測定分析，所得數(shù)據(jù)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制并計(jì)算回歸方程(表2)，所有回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.9982～0.9997之間，說明在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

Tab.2Linear regression equations, relative coefficients and linearity ranges of four organic acids

2.3檢測方法的精密度與回收率測定

取混標(biāo)樣品一份，重復(fù)測定6次，測算該方法的精密度，結(jié)果顯示該方法檢測結(jié)果變異系數(shù)均在5%以內(nèi)(表3)，說明精密度較高，重現(xiàn)性好，滿足分析要求；取紅麻青貯浸提液適量分成4份，取1份直接測定有機(jī)酸含量，其余3份加入不同質(zhì)量濃度有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液用以測定回收率，結(jié)果顯示樣品回收率在98.73%～102.79%之間(表4)，符合分析要求(95%～105%)。以上分析結(jié)果說明該方法適合檢測紅麻青貯樣品。

表3精密度檢測

Tab.3The precision of mixed standard organic acids

表4樣品回收率

Tab.4The recoveries for organic acids in kenaf silage

3討論與結(jié)論

一元有機(jī)酸因羧基中羰基氧和羥基氧上孤對電子的共軛作用，使其在205 nm～215 nm 處有吸收帶，本試驗(yàn)通過篩選確定檢測波長為210 nm，與前人研究一致[15-17]。有機(jī)酸作為弱酸在水系流動相中容易解離，進(jìn)而不能被非極性鍵合相保留，而酸性磷酸氫鹽溶液能夠抑制有機(jī)酸的解離，改善有機(jī)酸的保留和分離，本試驗(yàn)選用pH=2.70的0.02 mol/mL的磷酸鹽能夠?qū)?種不同的有機(jī)酸得到較好的分離，這與前人研究一致[18-19]。試驗(yàn)最終通過篩選確定的有機(jī)相甲醇比例達(dá)到14%，明顯高于其他研究報(bào)道，理論上有機(jī)相比例過高會影響測定的穩(wěn)定性，但是不同試驗(yàn)以及儀器條件均會使得最后的方案篩選有較大差異，本試驗(yàn)方法能夠較好地分離出紅麻青貯飼料中的4種有機(jī)酸，說明方法可行。由于供試的紅麻青貯飼料樣品中丁酸含量極低，所以在樣品的色譜圖中難以標(biāo)記出，但這同時說明了飼料質(zhì)量高，沒有腐敗的發(fā)生。

利用試驗(yàn)確定方法對紅麻青貯飼料中的有機(jī)酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，乳酸含量較高，且丁酸檢測值很低甚至檢測不到，說明供試紅麻青貯飼料質(zhì)量較好，較易調(diào)制成高質(zhì)量的飼料，這與其他報(bào)道一致[7，20]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用高效液相色譜法測定紅麻青貯飼料中的有機(jī)酸回收率高，精密度高，變異系數(shù)小，分離時間短，分離效果明顯。因此，用高效液相色譜法測定紅麻青貯飼料中的有機(jī)酸是一種簡單、快捷、準(zhǔn)確的分析方法。

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Determination of Organic Acids in Kenaf Silage by HPLC

BAI Jie，LI Defang*，CHEN Anguo，LI Jianjun，HUANG Siqi，TANG Huijuan

(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China)

Abstract:To establish a method of determining four kinds of organic acids(Lactic acid, Acetic acid, Propionic acid and Butyric acid) in kenaf silage by using high performance liquid chromatography (HPLC). Dionex Ultimate 3000 was used to separate organic acids, equipped with a chromatographic column Thermo Hypersil BDS C18. 0.02 mol/mL NaH2PO4(pH=2.70) and methanol was used as mobile phase with a flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature and UV detection wavelength were set at 30℃ and 210 nm, respectively. The results showed that four organic acids can be separated successfully, all the calibration curves for these organic acids displayed a good linear relationship with correlation coefficients above 0.9982(R2≥0.9982), and the coefficient of variation of four kinds of organic acids was less than 5% (n=6). The recovery rates of four organic acids were in the range of 98.73%～102.79%.This method is convenient, rapid, accurate and applicable to determine organic acids in kenaf silage.

Keywords:kenaf; silage; high performance liquid chromatography (HPLC); organic acids

文章編號：1671-3532(2016)03-0105-06

收稿日期：2015-11-11

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-19-E07)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程(ASTIP-IBFC03)；國家青年自然科學(xué)基金(31300240)；長沙市科技計(jì)劃(K1303002-21)

作者簡介：白杰(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧t麻飼用品種選育。E-mail：baijie5266@163.com。 *通訊作者:李德芳(1962-)，男，博士/博士生導(dǎo)師，二級研究員，主要從事一年生麻類作物育種。E-mail:chinakenaf@126.com。

中圖分類號：S563.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A