徐文峰+徐碩+馬捷

[摘要] 目的 應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）建立丙酸睪酮注射液中丙酸睪酮的含量測(cè)定方法。 方法 采用Alltima C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以甲醇-水（80∶20，v/v）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm，進(jìn)樣體積10 μL為色譜條件建立丙酸睪酮注射液含量測(cè)定方法，考察方法的線性、精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率情況，并用藥典方法驗(yàn)證該方法含量測(cè)定結(jié)果。 結(jié)果 在本方法中，丙酸睪酮的線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999，線性范圍為120.86～282.01 μg/mL；精密度和穩(wěn)定性良好，RSD均小于1.0%；丙酸睪酮的平均加樣回收率良好，為100.1%（n = 9）；運(yùn)用該方法測(cè)得四個(gè)批號(hào)丙酸睪酮注射液的含量分別為標(biāo)示量的99.5%、97.6%、98.4%、97.1%，相同批號(hào)樣品藥典方法含量測(cè)定結(jié)果為98.2%、98.5%、97.3%、95.9%，說(shuō)明該方法與藥典方法測(cè)定結(jié)果一致。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速，可用于測(cè)定丙酸睪酮注射液中丙酸睪酮的含量。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；丙酸睪酮注射液；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）10（c）-0134-04

[Abstract] Objective To establish a content determination method for testosterone propionate in Testosterone Propionate Injection using high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods An Alltima C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was used for the separation with methanol： purified water （80∶20， v/v） as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min with 241 nm as the detection wavelength and 10 μL as the injection volume. The linearity， precisions， stability and spiked recovery of the established method were inspected and the determination results of this method were verified using the method in Chinese Pharmacopoeia. Results The method showed good linearity with correlation coefficient of 0.9999 for testosterone propionate in the linear range 120.86-282.01 μg/mL. The precisions and stability were satisfactory with the relative standard deviations （RSD） below 1.0%. The average spiked recovery of testosterone propionate was 100.1% （n = 9）. The determination results of four batches of Testosterone Propionate Injection were 99.5%， 97.6%， 98.4% and 97.1% using this method. The contents of the same four batches of Testosterone Propionate Injection were 98.2%， 98.5%， 97.3% and 95.9% measured by the method in Chinese Pharmacopoeia， which suggested that the determination results of this method were consistent with the method of Chinese Pharmacopoeia. Conclusion The established method is accurate， simple and fast， and can be used for determination of testosterone propionate in Testosterone Propionate Injection.

[Key words] HPLC； Testosterone propionate injection； Determination

丙酸睪酮是人工合成的睪酮類雄性激素藥物（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），具有較強(qiáng)的生理活性，藥理學(xué)研究表明丙酸睪酮能抑制雙氧水誘導(dǎo)淚腺上皮細(xì)胞的凋亡，影響缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬、皮層膠質(zhì)原纖維酸性蛋白的表達(dá)，影響大腸桿菌解旋酶結(jié)構(gòu)和功能，影響大鼠胸腺細(xì)胞凋亡及胸腺中B淋巴細(xì)胞瘤-2基因的表達(dá)，拮抗促凋亡基因的表達(dá)等[1-9]。臨床研究表明丙酸睪酮能促進(jìn)男性器官及副性征的發(fā)育、成熟。大劑量時(shí)有對(duì)抗雌性激素作用，抑制子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)及卵巢、垂體功能，還有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及骨質(zhì)形成等作用[10]。注射液是丙酸睪酮唯一一種藥物劑型，被《中國(guó)藥典》2015年版二部收載，主要有1 mL∶10 mg，1 mL∶25 mg，1 mL∶50 mg，1 mL∶100 mg四種規(guī)格[11]。丙酸睪酮注射液臨床適應(yīng)證為原發(fā)性或繼發(fā)性男性性功能減低；男性青春期發(fā)育遲緩；絕經(jīng)后女性晚期乳腺癌姑息性治療等。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局網(wǎng)站的最新數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)共六家企業(yè)生產(chǎn)丙酸睪酮注射液，分別為上海通用藥業(yè)股份有限公司、天津金耀藥業(yè)有限公司、廣州白云山明興制藥有限公司、遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國(guó)）有限公司、河南科倫藥業(yè)有限公司及福州海王福藥制藥有限公司?！吨袊?guó)藥典》2015年版中丙酸睪酮注射液含量測(cè)定的前處理環(huán)節(jié)復(fù)雜，采用了提取、復(fù)溶、離心等方法，整個(gè)過(guò)程操作繁瑣，影響因素較多[11]。結(jié)合文獻(xiàn)[12-20]，本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了丙酸睪酮注射液含量測(cè)定中供試品的前處理方法，簡(jiǎn)化了藥典方法中復(fù)雜的前處理環(huán)節(jié)，收到了滿意的效果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260液相色譜系統(tǒng)，配有G1311C四元梯度泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G4212B DAD檢測(cè)器（Agilent Technologies，美國(guó)）；Mettler XP-205電子天平（Mettler Toledo，瑞士）；KQ-800KDE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（Millipore，美國(guó)）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，批號(hào)：155175，F(xiàn)isher公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；丙酸睪酮對(duì)照品（批號(hào)：100008-201206，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度：99.8%）；丙酸睪酮注射液（規(guī)格：1 mL∶25 mg；產(chǎn)品批號(hào)：1507111、 1411171；天津金耀藥業(yè)有限公司）。丙酸睪酮注射液（規(guī)格：1 mL∶25 mg；產(chǎn)品批號(hào)：130609， 121202；上海通用藥業(yè)股份有限公司）；注射用大豆油（產(chǎn)品批號(hào)：150709；中航（鐵嶺）藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇： 純水（80∶20，v/v）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫為室溫。進(jìn)樣前，所用溶液均用0.22 μm孔徑尼龍濾膜過(guò)濾。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定丙酸睪酮對(duì)照品約200 mg于100 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，即為丙酸睪酮儲(chǔ)備液（2.0 mg/mL）。精密量取丙酸睪酮儲(chǔ)備液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，獲得丙酸睪酮濃度均約為120、160、200、240、280 μg/mL的對(duì)照品溶液。中間濃度的對(duì)照品溶液作為含量測(cè)定用的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備

精密量取本品2 mL（約相當(dāng)于丙酸睪酮50 mg），置50 mL容量瓶中，用甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取注射用大豆油2 mL，按上述方法操作，即得陰性對(duì)照溶液。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)和系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，考察樣品中輔料對(duì)丙酸睪酮定量的干擾。根據(jù)圖2顯示：樣品中輔料不干擾丙酸睪酮的測(cè)定。理論板數(shù)按丙酸睪酮計(jì)算不低于4000。

2.5 線性和靈敏度

對(duì)“2.2”項(xiàng)不同濃度的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到丙酸睪酮的線性方程為Y =27.6083X-9.8635，線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999，線性范圍120.86～282.01 μg/mL，說(shuō)明方法在該范圍內(nèi)，線性相關(guān)性良好。

將對(duì)照品溶液用甲醇逐級(jí)稀釋后，以信噪比（S/N）約為3.0時(shí)的濃度為最低檢測(cè)限（LOD），S/N約為10.0時(shí)的濃度為最低定量限（LOQ），測(cè)得丙酸睪酮的LOD和LOQ分別為0.013、0.032 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

對(duì)中間濃度的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)照品溶液中丙酸睪酮峰面積的RSD（n = 6）為0.18%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)批號(hào)1507111的丙酸睪酮注射液獨(dú)立制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算得到丙酸睪酮含量的RSD（n = 6）為0.56%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取丙酸睪酮注射液1 mL（約相當(dāng)于丙酸睪酮25 mg），置50 mL容量瓶中，用甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中，分別精密加入丙酸睪酮儲(chǔ)備液10.0、12.5、15.0 mL，加甲醇適量，超聲30 min，甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。每個(gè)濃度制備3份樣品，共9份樣品。進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果顯示，丙酸睪酮的平均加樣回收率為100.1%（n=9），RSD為1.46%（n=9），表明方法的加樣回收率良好。見表1。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)批號(hào)1507111的供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算得到24 h內(nèi)丙酸睪酮色譜峰面積RSD（n = 6）為0.27%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 樣品含量測(cè)定

應(yīng)用本研究建立的方法及《中國(guó)藥典》方法[11]對(duì)批號(hào)為1507111、1411171（天津金耀藥業(yè)有限公司）、130609、121202（上海通用藥業(yè)股份有限公司）的丙酸睪酮注射液進(jìn)行含量測(cè)定，每個(gè)樣品制備2份，取平均值。測(cè)定結(jié)果顯示該方法與藥典方法含量測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明方法準(zhǔn)確可靠，可用于丙酸睪酮注射液的含量測(cè)定。見表2。

3 討論

3.1 提取過(guò)程更簡(jiǎn)便

藥典方法選擇乙醚作為提取溶劑，需要將乙醚水浴揮散后甲醇復(fù)溶提取物，并需要通過(guò)多次振搖后離心的方式去除溶解在乙醚而不溶于甲醇的輔料成分[11]，操作相對(duì)繁瑣；本實(shí)驗(yàn)采用甲醇直接超聲提取丙酸睪酮，操作簡(jiǎn)單，盡可能減少操作中引入的誤差及減少輔料中的成分對(duì)丙酸睪酮含量測(cè)定時(shí)的干擾。

3.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程更快捷

藥典方法需要用甲醇振搖4次（5、5、5、3 mL）復(fù)溶丙酸睪酮乙醚提取物，每次需振搖10 min，之后還需離心15 min，處理一份樣品共計(jì)100 min[11]。本實(shí)驗(yàn)超聲提取一份樣品僅需30 min，方法更快捷。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠

本實(shí)驗(yàn)在保證丙酸睪酮注射液供試品的取樣量（約相當(dāng)于丙酸睪酮50 mg），稀釋倍數(shù)（250倍），對(duì)照品溶液濃度（200 μg/mL），流動(dòng)相的選擇（甲醇-水，80∶20），檢測(cè)波長(zhǎng)（241 nm），丙酸睪酮峰的保留時(shí)間（約12 min）均與藥典方法一致的前提下，對(duì)供試品前處理方法加以優(yōu)化，保證測(cè)試結(jié)果只受樣品前處理方法的影響。結(jié)果顯示該方法與藥典方法含量測(cè)定結(jié)果一致，說(shuō)明方法準(zhǔn)確可靠，可用于丙酸睪酮注射液的含量測(cè)定。

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（收稿日期：2016-07-10 本文編輯：趙魯楓）