劉元偉 鄧妙 岑加萍 張紅艷 張治芬

●論 著

PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性研究

劉元偉 鄧妙 岑加萍 張紅艷 張治芬

目的 探討纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族多囊卵巢綜合征（PCOS）發(fā)病、胰島素抵抗及肥胖的關(guān)系。方法選擇浙江地區(qū)漢族PCOS患者120例和健康對照者102例，分別測量兩組身高、體重、腰圍，并計(jì)算BMI和腰臀比；采用PCR技術(shù)檢測兩組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性分布；采用ELISA法檢測PCOS患者空腹胰島素，采用葡萄糖氧化酶法檢測PCOS患者空腹血糖，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Homa-IR）。再根據(jù)BMI、Homa-IR將PCOS患者分為肥胖組（54例）與非肥胖組（66例），以及胰島素抵抗組（49例）與非胰島素抵抗組（71例），分別比較兩組基因型頻率。結(jié)果PCOS患者組PAI-1基因啟動子區(qū)4G/4G基因型頻率明顯高于健康對照組（P＜0．05）。PCOS患者PAI-1基因啟動子區(qū)4G/4G基因型頻率為胰島素抵抗者、非肥胖者分別高于非胰島素抵抗者、肥胖者（P＜0．05）。結(jié)論P(yáng)AI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族PCOS發(fā)病、胰島素抵抗及肥胖有關(guān)；其中4G/4G基因型可能是PCOS發(fā)病、PCOS患者胰島素抵抗的危險因素，且可能影響非肥胖型PCOS患者病情發(fā)展。

多囊性卵巢綜合征 纖溶酶原激活物抑制劑1 基因多態(tài)性胰島素抵抗 肥胖

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌、代謝系統(tǒng)和卵巢局部調(diào)控因素異常的異質(zhì)性疾病，主要病理生理機(jī)制是高胰島素血癥和胰島素抵抗，在育齡期女性中發(fā)病率為4%～18%，在無排卵性不育癥患者中發(fā)病率高達(dá)30%～60%[1-2]，臨床上主要表現(xiàn)為不同程度的月經(jīng)異常、不孕、多毛、痤瘡、肥胖等[2-3]。PCOS確切病因尚未明確，有研究認(rèn)為PCOS患者存在一定的血栓傾向，纖溶系統(tǒng)受損是重要原因，其中血漿纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）與PCOS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。有研究表明PCOS患者PAI-1水平明顯高于正常組。PAI-1是纖溶系統(tǒng)活性的主要調(diào)控者，是防止血栓形成的重要保護(hù)機(jī)制，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，高胰島素血癥與PAI-1水平升高、活性增強(qiáng)同時存在[4-5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)PAI-1基因啟動子區(qū)域一個堿基插入或缺失，均會影響PAI-1水平及活性，其中4G/ 4G基因型會升高PAI-1水平及活性，促進(jìn)PCOS、糖尿病、冠心病和心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-7]。本研究旨在探討浙江地區(qū)漢族PCOS患者PAI-l基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病、胰島素抵抗及肥胖的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2013年6月至2014年6月在杭州市第一人民醫(yī)院婦科門診就診的PCOS患者120例為PCOS組；選擇同期健康體檢婦女102例作為健康對照組；PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003年歐洲人類生殖協(xié)會和美國生殖協(xié)會共同推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。PCOS組與健康對照組均排除高血壓、下丘腦性閉經(jīng)、卵巢腫瘤、感染和自身免疫性疾病；接受試驗(yàn)前3個月未使用影響生殖激素、胰島素、血糖、血脂等藥物，未實(shí)行計(jì)劃性減肥，無手術(shù)及創(chuàng)傷史，無影響凝血功能改變的疾??；所有對象均為漢族，無親緣關(guān)系。參照2000年WHO制定的亞太地區(qū)診斷標(biāo)準(zhǔn)（BMI≥25 kg/m2為肥胖），將PCOS患者分為肥胖組54例和非肥胖組66例。采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（Homa-IR）評估胰島素敏感性（Homa-IR≥2.0為胰島素抵抗），并將PCOS患者分為胰島素抵抗組49例和非胰島素抵抗組71例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集空腹靜脈血，離心，分別提取血漿和血細(xì)胞，分離血漿用于檢測空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），要求所有受試者在采血前晚低糖、低脂飲食，采血當(dāng)日清晨空腹。

1.2.2 體格測量 測量身高、體重、臀圍、腰圍。BMI=體重/身高2；腰臀比=腰圍/臀圍。

1.2.3 生化檢測 采用ELISA法檢測FINS，采用葡萄糖氧化酶法檢測FBG；均由我院中心實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.2.4 基因分析 （1）細(xì)胞DNA的提?。菏褂肈NA純化試劑盒（美國AXYGEN公司）抽提DNA；（2）PCR法目的片段擴(kuò)增；（3）引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物序列（上海輝睿生物科技有限公司），PAI-1基因啟動子區(qū)引物序列：①5G引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGG-3′；②4G引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGA-3′；③共同下游引物序列：5′-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3′；④陽性對照上游引物：5′-AGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3′。4G和5G分別在2個反應(yīng)體系中進(jìn)行：一管加入引物①、③、④；另一管加入引物②、③、④。經(jīng)PCR反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳，電泳分型：含4G、5G的PCR產(chǎn)物長度均為135bp，陽性對照段PCR產(chǎn)物長為256bp，若只出現(xiàn)4G則為4G/4G基因型；只出現(xiàn)5G則為5G/ 5G基因型；4G、5G同時出現(xiàn)為4G/5G基因型。由于本研究5G/5G基因型較少，故將4G/5G和5G/5G合并為5G基因型、4G/4G基因型作為4G基因型進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病的關(guān)系 PCOS組與健康對照組平均年齡為（24.10±5.51）、（26.10±5.21）歲，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者BMI分別為（24.62±8.07）、（21.03±4.96）kg/m2，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。222例漢族婦女基因分析結(jié)果顯示，PAI-1基因啟動子區(qū)4G基因型頻率為42.79%（95/222），5G基因型頻率為57.21%（127/222）；其中PCOS組與健康對照組5G基因型頻率分別為53.33%（64/120）和61.76%（63/102）；4G基因型頻率分別為46.67%（56/120）和38.24%（39/102），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 PAI-l基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與胰島素抵抗的關(guān)系 胰島素抵抗組與非胰島素抵抗組PCOS患者腰臀比分別為0.83±0.45、0.79±0.12，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者BMI分別為（25.14±4.76）、（23.26±1.97）kg/m2，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組患者Homa-IR分別為2.71±0.81、1.98±0.54，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胰島素抵抗組與非胰島素抵抗組5G基因型頻率分別為48.98%（24/49）和56.34%（40/71）；4G基因型頻率分別為51.02%（25/49）和43.66%（31/71），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與肥胖的關(guān)系 肥胖組BMI、腰臀比和Homa-IR分別為（28.3± 3.0）kg/m2、0.87±0.14和2.6±1.3，均分別高于非肥胖組（22.1±1.2）kg/m2、0.81±0.06和2.1±0.9，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。肥胖組與非肥胖組5G基因型頻率分別為59.26%（32/54）和48.48%（32/66）；4G基因型頻率分別為40.74%（22/54）和51.52%（34/66），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

PAI-1基因啟動子區(qū)上游675堿基位點(diǎn)上存在鳥嘌呤插入或缺失，表現(xiàn)出4G/4G、4G/5G和5G/5G等3種基因型；而PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與血漿PAI-1水平升高、活性增高有關(guān)。4G等位基因附近只有轉(zhuǎn)錄激活物作用位點(diǎn)；5G等位基因附近不僅有轉(zhuǎn)錄激活物作用位點(diǎn)，還有轉(zhuǎn)錄抑制物作用位點(diǎn)；因此，4G等位基因轉(zhuǎn)錄活性高于5G等位基因。

PCOS患者血漿PAI-1活性明顯增高，可能與PAI-1 4G等位基因密切相關(guān)，因此推測PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病有關(guān)。目前國內(nèi)外相關(guān)研究存在爭議：Sales等[9]對巴西地區(qū)PCOS患者與健康對照人群各79例進(jìn)行PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性檢測，PCOS組4G/4G基因型頻率明顯高于健康對照組，但兩組間4G/5G、5G/5G基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示4G基因型可能與PCOS發(fā)病相關(guān)。Kilicci等[10]對土耳其地區(qū)PCOS患者與健康對照組各100例的相同基因位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測，兩組間4G、5G等位基因和3種基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者PAI-1基因啟動子區(qū)4G/4G基因型頻率明顯高于健康人群，5G/5G基因型頻率低于健康人群，亦提示4G基因型可能與PCOS發(fā)病有關(guān)[11-12]。Lee等[13]報道在歐洲、土耳其及亞洲人群中，PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS易感性顯著相關(guān)。Liu等[14]報道在亞洲人群中PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS發(fā)病具有明顯相關(guān)性，但在高加索人群中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性分布存在種族和地域的差異。本研究對浙江地區(qū)漢族PCOS患者PAI-1基因型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PCOS組以4G基因型為主，健康對照組以5G基因型為主，提示4G基因型可能與浙江地區(qū)漢族PCOS發(fā)病有關(guān)；但本研究PCOS組與健康對照組間BMI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能排除BMI對PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性分布的影響。

胰島素可激活人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而影響PAI-1的生物合成；這揭示了胰島素誘導(dǎo)下絲裂原活化蛋白激酶的激活對PAI-1的調(diào)節(jié)作用。Lopez-Alemany等[15]首次在研究中提及PAI-1與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，以及αvβ3整合素對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而起到調(diào)節(jié)作用；PAI-1與αvβ3整合素競爭，與玻璃體結(jié)合蛋白結(jié)合，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中PAI-1阻止αvβ3整合素與胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)的協(xié)同作用，減弱胰島素誘導(dǎo)的蛋白激酶B磷酸化作用，使得血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)和細(xì)胞遷移，進(jìn)一步加重胰島素抵抗。PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性通過升高血漿PAI-1水平及活性，從而影響胰島素的敏感性，與胰島素抵抗密切相關(guān)。胰島素抵抗是PCOS重要的生理、病理機(jī)制，且PCOS患者存在纖溶系統(tǒng)失衡、血漿PAI-1水平升高等，間接提示PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性可能與PCOS患者胰島素抵抗有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS胰島素抵抗組4G/4G基因型頻率明顯高于非胰島素抵抗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這提示PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS患者胰島素抵抗存在一定聯(lián)系。Sales等[9]在探討PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與PCOS的關(guān)系中指出，PCOS患者PAI-1水平為4G/4G基因型高于4G/5G、5G/5G基因型，且與胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

近年來研究表明，脂肪組織分泌的多種細(xì)胞因子可促進(jìn)PAI-1合成，推測PAI-1與肥胖關(guān)系密切[16]。Ma等[17]一項(xiàng)動物研究發(fā)現(xiàn)，缺乏PAI-1的老鼠可完全防止肥胖的發(fā)生，提示PAI-1與肥胖可能存在直接的因果關(guān)系。Tarkun等[18]研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者無論是否肥胖，PAI-1水平及活性均明顯升高；瘦型PCOS患者PAI-1水平及活性升高不依賴于BMI，與胰島素抵抗直接相關(guān)。趙君利等[19]研究表明PCOS肥胖患者的Homa-IR、BMI和腰臀比均高于非肥胖者，肥胖者的Homa-IR低于非肥胖者，這說明肥胖者胰島素抵抗程度較非肥胖者嚴(yán)重，而非肥胖患者PAI-1基因啟動子區(qū)4G基因型頻率高于肥胖者。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS肥胖患者BMI、Homa-IR均明顯高于非肥胖者，表明PCOS肥胖患者胰島素抵抗程度明顯高于非肥胖者；非肥胖者4G/4G基因型頻率明顯高于肥胖組。以上結(jié)果與Tarkun等[18]、趙君利等[19]報道一致。因此，我們推測4G基因型可能是PCOS非肥胖患者血漿PAI-1水平及活性升高的重要因素，肥胖和胰島素抵抗可能是影響PCOS肥胖患者PAI-1水平及活性的重要因素。此外，本研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者4G/ 4G基因型頻率為胰島素抵抗組高于非胰島素抵抗組、非肥胖組高于肥胖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是本研究樣本量偏小、PCOS患者非肥胖且胰島素抵抗患者的比例偏高所致。因此，重視PCOS肥胖患者的體重控制外，應(yīng)長期監(jiān)測帶有4G基因型的PCOS非肥胖患者的Homa-IR及PAI-1水平，并及時關(guān)注血糖、纖溶凝血系統(tǒng)等改變，這對預(yù)防糖尿病、心腦血管疾病等遠(yuǎn)期并發(fā)癥具有重要意義。

綜上所述，PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族PCOS的發(fā)病有關(guān)，而4G/4G基因型可能是PCOS發(fā)病的危險因素。4G/5G基因型分布與PCOS胰島抵抗、肥胖等因素有關(guān)，其中4G/4G基因型可能是影響浙江地區(qū)漢族PCOS患者糖代謝異常發(fā)生、PCOS非肥胖患者病情發(fā)展的危險因素。因此，對不利基因型個體進(jìn)行隨訪與深入研究，將有利于PCOS患者的防治。此外，我們認(rèn)為測定血漿PAI-1水平對早期發(fā)現(xiàn)血栓前狀態(tài)、早期預(yù)防和早期治療，提高PCOS患者遠(yuǎn)期生存質(zhì)量具有良好的指導(dǎo)作用。

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Correlation of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1 gene promoter region with polycystic ovarian syndrome

LIU YuANWEI. DENG Miao. CEN Jiaping. et al. Department of Gynecology. Hangzhou Women's Hospital. Hangzhou 310008. China

Objective To investigate the correlation of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator-1(PAI-1)gene promoter region with polycystic ovary syndrome(PCOS)in Zhejiang Han population．MethodsOne hundred and twenty patients with PCOS and 102 healthy women(control group)were enrolled from Zhejiang Han population．Body mass index(BMI)and waist-to-hip ratio(WHR)were determined．The 4G/5G polymorphism of the PAI-1 gene promoter region was amplified by the polymerase chain reaction(PCR)．Blood samples of PCOS patients were obtained,fasting insulin was detected by ELISA and fasting glucose was measured by glucose oxidase method,and insulin resistance index(Homa-IR)was calculated．Based on the BMI,PCOS patients were divided into obese(n=54)and non-obese(n=66)groups．Based on Homa-IR,the patients were divided into insulin resistant(IR,n=49)and non-IR(n=71)groups．ResultsThe rate of PAI-1 gene promoter region 4G/4G genotype was significantly higher in the PCOS patients than that in control group(P＜0．05)．The rate of 4G/4G genotype was significantly higher in the IR and non-obese groups than that in non-IR and obese groups(P＜0．05)．ConclusionThe genotype 4G/4G in PAI-1 gene promoter region may be associated with the pathogenesis of PCOS in Zhejiang Han population,which may be involved in the development of IR and PCOS,especially in non-obese patients．

Polycystic ovary syndrome Plasminogen activator inhibitor-1 Gene polymorphism Insulin resistance Obese

2015-04-20）

（本文編輯：陳丹）

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009C33114）

310008 杭州市第一人民醫(yī)院集團(tuán)杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn