郝建勇，秦建如，邱倩倩，袁麗霞，饒明章，廖　明，曹偉勝(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室，廣東廣州510642)

不同樣品對黃羽種雞禽白血病病毒凈化檢測效果的影響

郝建勇，秦建如，邱倩倩，袁麗霞，饒明章，廖明，曹偉勝
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室，廣東廣州510642)

摘要:【目的】評估黃羽種雞禽白血病的凈化工作，比較源于同一雞群不同樣品對禽白血病病毒(ALV)檢測結(jié)果的影響.【方法】采用ALV抗原ELISA方法對廣東一黃羽種雞場采集的2 691枚種蛋進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果采集其中70份不同S/P區(qū)間所對應(yīng)的母雞抗凝血，分離血漿后分別同時接種于CEF和DF-1細(xì)胞，用病毒分離方法進行檢測，并用PCR方法進行亞群鑒定.【結(jié)果和結(jié)論】從送檢種蛋蛋清共檢出ALV p27陽性樣品243份，陽性率為9. 03%(243/2 691) ;蛋清不同ELISA S/P區(qū)間所對應(yīng)的病毒分離情況分別為:蛋清ELISA S/P≥2. 0的雞只其血樣CEF和DF-1細(xì)胞病毒分離率均為100%; 1. 5≤S/P＜2. 0的雞只病毒分離率均為88. 9%; 1. 0≤S/P＜1. 5的雞只病毒分離率均為85. 7%; 0. 2≤S/P＜1. 0的雞只病毒分離率分別為60%～75% (CEF)和40%～50% (DF-1) ; 0. 1≤S/P＜0. 2的雞只病毒分離率為62. 5%(CEF)和50%(DF-1) ; S/P＜0. 1的雞只分別為27. 2%(CEF)和9. 1% (DF-1)的病毒分離率.PCR結(jié)果顯示，所有7份CEF+DF-1－的CEF培養(yǎng)物中有6份為內(nèi)源性ALV-E.研究表明，在蛋清ELISA檢測時，S/P越高的陽性蛋清樣品其對應(yīng)母雞越可能是外源性ALV病毒血癥陽性;有一定比例S/P較低的陽性蛋清樣品是由對應(yīng)母雞體內(nèi)的內(nèi)源性ALV排毒所致;而凈化初期少數(shù)蛋清S/P為陰性的蛋清，其對應(yīng)母雞仍可能檢出外源性ALV，說明在黃羽種雞外源性ALV凈化方案中單獨使用1次蛋清ELISA檢測可能會給禽白血病的凈化檢測造成一定的“誤診”和“漏檢”.

關(guān)鍵詞:黃羽種雞;禽白血病病毒;病毒檢測;凈化

郝建勇，秦建如，邱倩倩，等.不同樣品對黃羽種雞禽白血病病毒凈化檢測效果的影響［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，36(6):29-34.

優(yōu)先出版時間:2015-10-16

優(yōu)先出版網(wǎng)址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20151016.1446.014.html

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的一種禽類腫瘤性傳染病，臨床上多以生產(chǎn)性能下降、免疫抑制、多個器官組織出現(xiàn)腫瘤為特征［1］.通常依據(jù)病毒血清中和試驗、囊膜糖蛋白特性和宿主范圍等將ALV分為A～J共10個亞群，其中只有A、B、C、D、E和J亞群ALV來源于雞.2012年，王鑫等［2］從我國蘆花雞中分離出3株疑似新亞群(K亞群) ALV.

根據(jù)ALV的自然傳播方式和病毒復(fù)制的生物學(xué)特性，可將其分為外源性病毒和內(nèi)源性病毒.外源性ALV是指不會通過宿主細(xì)胞染色體傳遞的病毒，而以病毒粒子形式進行垂直和水平傳播，包括A、B、C、D、J亞群，其中A、B、J是常見的外源性ALV，致病力較強.因此，這些外源性病毒是AL凈化的重要對象.內(nèi)源性ALV是指前病毒cDNA可永久性整合進宿主細(xì)胞染色體基因組的病毒，可通過染色體垂直傳播，主要是指E亞群，一般致病力較弱或不致病，但它可干擾對外源性ALV感染的檢測，給ALV的凈化工作帶來了很大的困難［3］.

近年來，AL在我國各地仍然廣泛流行［4-5］，特別是在2006—2009年間，ALV-J誘發(fā)的血管瘤給我國商品蛋雞造成了巨大的經(jīng)濟損失［6］.在《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020)》和《全國肉雞遺傳育種改良計劃(2014—2025)》中均將AL列入重點防治對象和疾病凈化目標(biāo).為了控制ALV的流行，崔治中等［7］擬定針對我國不同種禽場可選擇實施不同的ALV凈化方案.

外源性ALV的凈化檢測可從感染雞的胎糞、泄殖腔拭子、血液、精液和蛋清等樣品中進行.在不同公司的禽白血病凈化方案中，蛋清通常被列為非常重要的檢測對象，即通過p27抗原ELISA頻度檢測蛋清，根據(jù)檢測結(jié)果淘汰陽性雞，從而盡可能阻止ALV經(jīng)種蛋垂直傳播.但是這種方法的先天不足在于現(xiàn)有商品化試劑盒不能區(qū)分內(nèi)源性和外源性病毒.目前國內(nèi)外公認(rèn)檢測外源性ALV的“金標(biāo)準(zhǔn)”是病毒分離.病毒分離常用血漿樣品，近年來也有研究開始分析不同品種雞蛋清病毒分離的結(jié)果［8-10］.

廣東是黃羽肉雞產(chǎn)業(yè)的重要生產(chǎn)和消費大省.近些年來AL也一直困擾黃羽肉雞產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.可喜的是，廣東省一些黃羽種雞品系相繼啟動了外源性ALV的凈化工作.在對蛋清的凈化檢測結(jié)果分析過程中，有不少黃羽種雞場的管理人員和獸醫(yī)工作者經(jīng)常問到同一個問題:即黃羽種雞場蛋清p27抗原ELISA陽性雞是否真的為外源性ALV帶毒雞.因此，本研究擬對廣東省一黃羽種雞的蛋清樣品進行ALV抗原ELISA檢測，進而采集蛋清ELISA陽性樣品對應(yīng)母雞的血漿樣品分別同時接種CEF和DF-1細(xì)胞進行病毒分離，以比較蛋清ELISA檢測和血漿病毒分離之間的對應(yīng)關(guān)系，從而為該黃羽種雞群中AL的防控及凈化方案提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1蛋清樣品采集

從廣東一黃羽種雞場送檢的2 691枚育種核心群種蛋中逐個吸取蛋清1 mL置于1. 5 mL離心管，－80℃條件下保存?zhèn)溆?

1.2試劑和儀器

ALV抗原檢測試劑盒(ALV Antigen Test Kit)為IDEXX公司產(chǎn)品; DMEM、FBS和Trypsin均為Gibco公司產(chǎn)品; pMD18-T載體、Go Taq DNA聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品; SQ Tissue DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品;大腸埃希菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α購于天根生化科技有限公司; DF-1細(xì)胞為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室保存;雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)使用SPF雞胚(北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司提供)制備; Bio-tek Elx800型酶標(biāo)儀、凝膠成像及分析系統(tǒng)、高速低溫離心機等儀器均由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室提供.

1.3蛋清ALV p27抗原ELISA檢測

將－80℃保存的蛋清反復(fù)凍融3次，參照IDEXX公司ALV抗原檢測ELISA試劑盒使用說明書進行p27抗原檢測，并計算其S/P值.判定標(biāo)準(zhǔn)如下: S/P＜0. 2為陰性，S/P≥0. 2為陽性.

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與病毒分離

參照文獻［11］并有所改進.根據(jù)“1. 3”中檢測結(jié)果，立即采集其中70份不同區(qū)間S/P值(S/P≥2. 0，1. 5≤S/P＜2. 0，1. 0≤S/P＜1. 5，0. 5≤S/P＜1. 0，0. 2≤S/P＜0. 5，0. 1≤S/P＜0. 2，S/P＜0. 1)所對應(yīng)的母雞抗凝血，無菌操作分離血漿后分別同時接種于24孔板中的CEF細(xì)胞懸液(1. 7×105mL－1)和DF-1細(xì)胞懸液(1. 7×105mL－1)中，每孔接種50 μL血漿，每個樣品接種2孔，同時設(shè)立DMEM陰性對照和接種已知ALV的陽性對照各2孔，在37℃體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至單層，換為體積分?jǐn)?shù)1%的FBS細(xì)胞維持液再連續(xù)培養(yǎng)7 d，然后將CEF和DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，5 000 r·min－1離心5 min，離心后的細(xì)胞上清液－80℃條件下保存?zhèn)溆?細(xì)胞沉淀用于提取ALV前病毒基因組DNA.

1.5細(xì)胞上清ELISA檢測與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

細(xì)胞上清ELISA檢測操作方法同“1. 3”.并使用EXCEL軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析.

1.6前病毒DNA的制備

參照“1. 5”中的檢測結(jié)果收集“1. 4”中的CEF陽性且DF-1陰性(CEF+DF-1－)和1份CEF、DF-1均為陰性(CEF－DF-1－)的CEF細(xì)胞沉淀，并隨機選取不同區(qū)間CEF和DF-1均陽性(CEF+DF-1+)的DF-1細(xì)胞沉淀13份(A～F每個區(qū)間2份，G區(qū)間1 份)，按照SQ Tissue DNA試劑盒OMEGA公司說明書提取基因組DNA，－20℃條件下保存?zhèn)溆?

1.7引物合成和ALV亞群鑒定

參照文獻［11］以及GenBank中已公開發(fā)表的ALV序列分別合成用于擴增ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-E的特異性PCR分型鑒定引物，其擴增產(chǎn)物預(yù)計大小分別為690、1 100、1 250、545 bp.

1.8分離株gp85基因的擴增和測序

參考文獻［12］合成擴增ALV-J gp85基因的特異性引物，其擴增產(chǎn)物預(yù)計大小為924 bp.按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行回收，然后將膠回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將經(jīng)菌液PCR鑒定陽性質(zhì)粒送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序.

1.9 gp85基因的序列分析

利用DNAStar7. 1基因分析軟件對測序結(jié)果進行核苷酸序列的剪輯和拼接.將分離株的gp85基因核苷酸序列與GenBank中已公開發(fā)表的國內(nèi)外各參考毒株的gp85基因核苷酸序列進行相似性分析，并用MEGA5. 0繪制分離毒株與各參考毒株gp85基因序列的系統(tǒng)進化圖譜.各亞群ALV參考毒株: RAV-0 (M12172)，RAV-1 (M19113)，RAV-2 (M14902)，PragueC (J02342 )，SR-D (M22730 )，HPRS103 (Z46390)，NX0101(DQ115805)，HN06(HQ900844)，SCAU11-H(KC149972)，SCAU11-XG (KC149971)，ADOL-7501 (AY027920)，CAUGX01 (HM640943)，WLY13 (KJ631311 )，AHaq02 (KF534753 )，ZH08 (HQ316166)，GD06SL1(EF107624).

2　結(jié)果

2.1蛋清樣品ALV抗原ELISA檢測

對來自廣東一黃羽種雞場育種核心群的2 691枚種蛋進行了ALV p27抗原ELISA檢測，其中共檢出243份陽性樣品，則該批送檢種蛋的ALV p27抗原陽性率為9. 03%.

2.2 CEF和DF-1細(xì)胞的病毒分離結(jié)果

根據(jù)“2. 1”中的檢出結(jié)果，參照步驟“1. 4”，將蛋清對應(yīng)編號母雞的血漿樣品分別同時用CEF細(xì)胞和DF-1細(xì)胞進行病毒分離，結(jié)果如表1所示.DF-1細(xì)胞病毒分離總陽性率為60% (42/70)，CEF細(xì)胞病毒分離總陽性率為70% (49/70)，進一步分析后發(fā)現(xiàn)，DF-1細(xì)胞病毒分離陽性的樣品，其CEF細(xì)胞病毒分離結(jié)果也均呈陽性.

表1　血漿樣品細(xì)胞培養(yǎng)物的ALV抗原ELISA檢測結(jié)果1)Tab.1 The results of ALV antigen-ELISA test of plasma cell cultures　　陽性率/%

2.3 CEF和DF-1細(xì)胞病毒分離的相關(guān)性

以DF-1細(xì)胞病毒分離率(x)為橫坐標(biāo)，CEF細(xì)胞病毒分離率(y)為縱坐標(biāo)，建立回歸線性方程(圖1)，線性關(guān)系方程為y =0. 723 7x +0. 275 2，相關(guān)系數(shù)為0. 939 3，說明這2種細(xì)胞的ALV分離結(jié)果符合率高度相關(guān)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠.

圖1　CEF和DF-1細(xì)胞病毒分離相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of virus isolation in CEF and DF-1 cells

2.4 PCR亞群鑒定結(jié)果

對CEF+DF-1－的全部7份CEF細(xì)胞樣品及1 份CEF－細(xì)胞樣品分別標(biāo)記為1～8，另外從7個不同區(qū)間中隨機選取13份CEF+DF-1+的DF-1細(xì)胞樣品標(biāo)記為9～21，然后進行PCR亞群鑒定.8份CEF細(xì)胞樣品中有6份(0. 5≤S/P＜1. 0、S/P＜0. 1區(qū)間各2份，0. 2≤S/P＜0. 5、0. 1≤S/P＜0. 2區(qū)間各1份)擴增片段大小為1 250 bp左右，與ALV-E特異性片段大小相一致，有1份(來自0. 2≤S/P＜0. 5區(qū)間)片段大小為545 bp，與ALV-J亞群特異性片段大小相一致，陰性細(xì)胞沒有條帶(圖2) ;而另13份DF-1細(xì)胞樣品PCR產(chǎn)物的大小均為545 bp，與ALV-J片段大小相一致(圖3)，說明該黃羽種雞育種核心群不僅存在具有復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV，而且存在外源性ALV-J.

2.5 gp85基因PCR擴增結(jié)果

以提取的DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物cDNA為模板，用gp85特異性引物進行g(shù)p85基因的擴增，分離出3株ALV-J，分別命名為GD1401J、GD1402J、GD1403J.其gp85基因大小均為924 bp，與預(yù)期大小一致(圖4).

圖2　CEF細(xì)胞培養(yǎng)物的ALV PCR檢測Fig.2 ALV PCR detection of CEF cell cultures

圖3　DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物的ALV PCR檢測Fig.3 ALV PCR detection of DF-1 cell cultures

圖4　gp85基因的PCR擴增Fig.4 PCR amplification of the gp85 gene

2.6分離株gp85基因的序列分析

利用DNAStar軟件分別對ALV-J分離株GD1401J、GD1402J和GD1403J的gp85基因序列進行剪輯和拼接，結(jié)果顯示這3個毒株的gp85核苷酸序列長度均為924 bp，它們之間的核苷酸相似性達到98. 8%～99. 8%.與GenBank中已公開發(fā)表的國內(nèi)外不同ALV分離株gp85基因核苷酸序列進行相似性比較，發(fā)現(xiàn)這3個分離株的gp85基因與ALVA、B、C、D、E亞群的gp85基因相似性只有49. 3%～49. 9%，與ALV-J的gp85基因相似性高達87. 4%～100%.其中，與國外ALV-J分離株ADOL-7501相似性達87. 4%～87. 5%;與ALV-J原型株HPRS103的相似性為97. 7%～98. 1%;與國內(nèi)廣東地區(qū)部分分離株的相似性為92. 3%～94. 8%，與安徽分離株AHaq02的相似性最高分別為99. 8%、100%、99. 0%.各亞群的gp85基因系統(tǒng)進化樹顯示，3個分離株與AHaq02位于同一個進化分支上，而與J亞群原型株HPRS103位于同一個大的進化分支上(圖5).

圖5　ALV-J gp85基因的核苷酸序列遺傳進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ALV-J gp85 gene

3　討論與結(jié)論

禽白血病是雞群中最常見的腫瘤性疾病之一，它不僅會造成病禽的死亡和淘汰，還會引起雞群生產(chǎn)性能下降、生長遲緩、免疫抑制等現(xiàn)象［1］.近幾年來該病所帶來的損失也趨于嚴(yán)重.廣東省作為我國的養(yǎng)禽大省，有多個優(yōu)質(zhì)的黃羽肉雞地方品系，而AL的防控和凈化已是十分迫切的生產(chǎn)課題.

目前，應(yīng)用于ALV的檢測方法包括病毒分離、ELISA、間接免疫熒光(IFA)等［13-15］，這些方法各有其優(yōu)缺點.在臨床生產(chǎn)上針對雞群AL的流行病學(xué)調(diào)查和凈化，商品化的ELISA檢測試劑盒由于其快速、簡便、可大批量檢測的特點具有不可替代的優(yōu)勢.因為種蛋具有便于收集保存和不易污染的特點，還有可用于病毒分離鑒定等優(yōu)點［8］.使用蛋清ALV抗原ELISA檢測結(jié)果判斷凈化雞群中個體ALV的感染狀態(tài)，目前已在國內(nèi)ALV凈化檢測和流行病學(xué)調(diào)查中被廣泛應(yīng)用.但國內(nèi)外對ALV蛋清樣品病毒分離方面的報道較少，筆者曾對蛋清樣品進行病毒分離發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的蛋清ELISA陽性樣品其實是由內(nèi)源性病毒引起的［9］.但蛋清ALV抗原ELISA檢測為陽性的雞是否全部為外源性ALV病毒血癥陽性，這個問題值得研究，尤其是對內(nèi)源性病毒表達不一的各個黃羽肉種雞品系.

病毒分離鑒定是檢測ALV最有效、可靠的技術(shù)，常用于病毒分離的細(xì)胞有C/O表型的CEF細(xì)胞［16］和源于EV-0系胚胎的DF-1細(xì)胞系［17］，其中CEF細(xì)胞對所有的內(nèi)源性和外源性ALV均易感，而DF-1細(xì)胞系能夠抗內(nèi)源性ALV感染，而對所有外源性ALV易感.本研究通過比較蛋清樣品對應(yīng)母雞的同一份血漿分別在CEF和DF-1不同細(xì)胞的病毒分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋清樣品抗原ELISA檢測S/P越高，其對應(yīng)母雞的血漿樣品在2種細(xì)胞上的病毒分離率也越高.S/P在2. 0以上的蛋清樣品其對應(yīng)母雞的血漿樣品在CEF和DF-1細(xì)胞上病毒分離全部為陽性，而S/P低于2. 0的蛋清樣品對應(yīng)母雞的血漿樣品在CEF和DF-1細(xì)胞上的病毒分離有差異.特別有趣的是S/P小于0. 2的蛋清樣品，參照ALV抗原ELISA檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)該蛋清對應(yīng)的母雞應(yīng)該被判為陰性，但這些蛋清ELISA陰性雞的對應(yīng)血漿樣品仍有26. 3% (5/19)病毒分離為外源性ALV(CEF+DF-1+)感染，有15. 8%(3/19)檢測出內(nèi)源性ALV(CEF+DF-1－)，尤其值得注意的是，蛋清S/P低于0. 1的母雞其對應(yīng)血漿樣品中也有少數(shù)分別分離出了內(nèi)源性和外源性ALV.對2種細(xì)胞病毒分離率進行回歸線性分析，結(jié)果顯示兩者之間的相關(guān)系數(shù)為0. 939 3，表明檢測結(jié)果高度相關(guān)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確.王明月等［8］從蛋清或泄殖腔棉拭子檢測值小于0. 2的雞只中通過病毒分離的方法檢測到有10%外源性ALV，這與本研究結(jié)果基本一致，充分說明了單獨使用蛋清抗原ELISA方法可能會對凈化檢測結(jié)果造成一定程度的“漏檢”.

本研究還對來自不同區(qū)間的7份CEF+DF-1－和1份陰性對照的CEF細(xì)胞沉淀以及13份CEF+DF-1+的DF-1細(xì)胞沉淀進行ALV亞群鑒定，結(jié)果顯示7 份CEF細(xì)胞沉淀中有6份為內(nèi)源性ALV-E，1份為ALV-J(來自0. 2≤S/P＜0. 5區(qū)間)，另13份DF-1細(xì)胞沉淀全部為ALV-J，這與徐海鵬等［3］報道的能夠從種蛋中分離出內(nèi)源性ALV結(jié)果相一致.相對于血漿病毒分離結(jié)果，蛋清S/P小于0. 5的陽性結(jié)果可造成一定比例的“誤判”.這一結(jié)果對于凈化初期來說似乎是可以接受的代價——即“寧可錯殺、不可放過”，但是對于凈化后期、尤其是進行凈化評估驗收或達標(biāo)檢測時，這種僅基于蛋清ELISA的“誤判”可能會給凈化實施單位造成“不公”，而應(yīng)該用更合理的方法或者建立“復(fù)檢機制”.而對于7份CEF+DF-1－中的1份ALV-J PCR陽性結(jié)果，可能是由不同方法的敏感性差異造成的.

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)S/P在1. 0～2. 0之間的蛋清樣品對應(yīng)血漿樣品病毒分離中分別有11. 1%(1/9) 和14. 3% (1/7)的樣品為陰性(CEF－DF-1－)，究其原因，可能是由具有p27抗原表達但無復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV片段(如ev3位點)引起的.研究結(jié)果表明:正是由于ALV的感染和排毒時間的不可預(yù)測性以及各種檢測方法的固有敏感性和特異性差異，無論是蛋清抗原ELISA檢測還是經(jīng)典的病毒分離法，單獨使用1種檢測方法，均不能1次完全檢測出外源性ALV陽性雞，故本研究也進一步提示在進行ALV的凈化過程中需要不同方法組合的多次檢測，甚至是多個世代才能更有效地完成ALV的凈化工作.本研究結(jié)果表明該黃羽肉種雞育種核心群不僅同時存在缺陷的內(nèi)源性ALV和完整的具有完全復(fù)制能力的內(nèi)源性ALV，而且也存在需要凈化的外源性ALV.因此無論是從蛋清p27陽性率，還是外源性ALV的陽性率，均已經(jīng)超過擬定的種禽健康標(biāo)準(zhǔn)，該黃羽肉種雞育種核心群應(yīng)盡快啟動禽白血病的凈化.

本研究還分離出3株病毒ALV-J分別命名為GD1401J、GD1402J和GD1403J，對其gp85基因進行序列分析后發(fā)現(xiàn)，3個分離株之間的核苷酸相似性高達98. 8%～99. 8%.與國內(nèi)外參考毒株的gp85基因進行比較發(fā)現(xiàn)，3個分離株與安徽分離株AHaq02相似性最高，同時與J亞群原型株HPRS103位于同一個大的進化分支上.有趣的是，歷經(jīng)多年的演變，該種雞群分離株的gp85基因與J亞群原型株HPRS103相似性仍高達97. 7%～98. 1%，說明他們可能來自共同的原始毒株，這些毒株的來源仍需進一步的追溯.

致謝:本試驗是與人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室、廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室共同完成.

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【責(zé)任編輯柴焰】

Effects of different samples on avian leukosis virus eradication and detection in yellow feather breeders

HAO Jianyong，QIN Jianru，QIU Qianqian，YUAN Lixia，RAO Mingzhang，LIAO Ming，CAO Weisheng
(College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/Key Laboratory of Veterinary Vaccine Development，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】The avian leukosis (AL) eradication protocol in yellow feather breeders was evaluated and the effects of different albumen samples from the same breeder chickens on the results of avian leukosis virus (ALV) detection were compared.【Method】A total of 2 691 albumen samples collected from a yellow feather breeders of Guangdong Province were tested using ALV p27 antigen ELISA.Seventy plasma samples were collected from corresponding hens based on the different S/P intervals results for virus isolation in CEF and DF-1 cells respectively，and the results were analyzed.PCR was used to identify subgroup.【Result and conclusion】A total of 243 positive samples were detected in this local breederbook=30,ebook=302flock，and the ALV p27 positive rate was 9.03%(243/2 691).The virus isolation ratios (VIR) at different S/P intervals were found as follows: both 100% VIR in CEF and DF-1 cells of hens’plasma samples with albumen S/P≥2. 0; both 88. 9%VIR with 1. 5≤S/P＜2. 0; both 85. 7% VIR with 1. 0≤S/P＜1. 5; 60%－75%(CEF) and 40%－50%(DF-1) with 0. 2≤S/P＜1. 0; 62. 5% (CEF) and 50% (DF-1) with 0. 1≤S/P＜0. 2; 27. 2%(CEF) and 9. 1% (DF-1) with S/P＜0. 1.The PCR detection showed that six of seven CEF+DF-1－proviral DNA were positive with endogenous ALV-E and one positive with ALV-J.The results indicated that in albumen ELISA detection，the higher S/P value of positive albumen samples，the more likely exogenous ALV viremia positive in their corresponding hens.The corresponding hens of low S/P value of positive albumen samples were caused by a certain proportion of endogenous virus; it is noteworthy that exogenous ALV can still be isolated from some ELISA negative chickens at the beginning of eradication.This study suggests some“misdiagnosed”and“missed”chickens may be caused by using only one method of albumen p27 antigen ELISA.

Key words:yellow feather breeder; avian leukosis virus; virus detection; eradication

基金項目:公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203055) ;國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-42-G09) ;廣東省科技計劃項目(2012A020100001)

作者簡介:郝建勇(1987—)，男，碩士研究生，E-mail: haojianyong@ 163.com;通信作者:曹偉勝(1975—)，男，副教授，博士，E-mail: caoweish@ scau.edu.cn

收稿日期:2015-01-31

文章編號:1001-411X(2015) 06-0029-06

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S855. 3