趙　蕊，呂利華，陳　婷，何自福，何余容(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州5064; 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州50640)

木爾坦棉花曲葉病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法

趙蕊1，2，呂利華2，陳婷2，何自福2，何余容1
(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州510642; 2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

摘要:【目的】木爾坦棉花曲葉病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus(CLCuMV)是為害錦葵科植物的重要雙生病毒之一，本研究的目的是建立CLCuMV定量檢測方法，為進(jìn)一步研究其在寄主植物內(nèi)的增殖動態(tài)、在介體昆蟲內(nèi)循環(huán)和其與寄主、介體間互作機(jī)制提供技術(shù)手段.【方法】以純化的含CLCuMV基因組的質(zhì)粒為模板，利用SYBR Green I熒光定量PCR對不同濃度的質(zhì)粒樣品進(jìn)行CLCuMV擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.依照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算煙粉虱Bemisia tabaci及朱槿Hibiscus rosa-sinensis中CLCuMV的含量.【結(jié)果和結(jié)論】該定量檢測法可檢測到低濃度(5.2×101μL－1)的CLCuMV，其靈敏度是常規(guī)PCR的10倍，可被用于在寄主植物和介體昆蟲體內(nèi)CLCuMV的定量檢測.

關(guān)鍵詞:木爾坦棉花曲葉病毒;錦葵科; SYBR Green I;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;檢測方法

趙蕊，呂利華，陳婷，等.木爾坦棉花曲葉病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(6):87-90.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-10-16

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木爾坦棉花曲葉病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus(CLCuMV)屬雙生病毒科菜豆金黃花葉病毒屬，含DNA-A組分，并伴隨有衛(wèi)星DNA β分子，該病毒是引起棉花曲葉病的主要病原之一［1-2］.該病毒通過煙粉虱Bemisia tabaci進(jìn)行傳播和擴(kuò)散，危害嚴(yán)重［3-6］.已在我國廣東、廣西、海南及云南的棉花Gossypium hirsutum L.［2］、朱槿Hibiscus rosa-sinensis Linn.［7-9］、黃秋葵Abelmoschus esculentu L.［10］、垂花懸鈴木Malvaviscus arboreus Cav.var.penduliflocus (DC.) Schery［11］和紅麻Hibiscus cannabinus［8］等錦葵科植物檢測到該病毒.已有利用測序比對CLCuMV在不同寄主間的變異程度的研究［12］.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR)是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)［12］，被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域［13］，主要包括熒光染料法和探針法.利用RT-PCR探針法定量檢測了發(fā)病番茄葉片和介體昆蟲煙粉虱的番茄黃化曲葉病毒含量［14］、發(fā)病番茄植株中番茄黃化曲葉病毒和番茄黃化皺葉病毒的含量［15］，也檢測了薊馬蟲體內(nèi)番茄斑點(diǎn)枯萎病毒的含量［16］，為解釋病毒共同侵染、預(yù)測病毒傳播提供了有效的依據(jù).目前鮮見利用熒光染料法對CLCuMV定量檢測的報(bào)道.

本文基于SYBR Green I檢測技術(shù)，構(gòu)建CLCuMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測體系，并比較其與常規(guī)PCR定量檢測該病毒的靈敏度差異;定量測定寄主植物朱槿的健康及顯癥植株及介體昆蟲煙粉虱蟲體內(nèi)的CLCuMV含量，為深入研究木爾坦棉花曲葉病的發(fā)病過程、致病機(jī)理以及該病毒與寄主植物、介體昆蟲的互作提供有效的定量檢測技術(shù).

1　材料與方法

1.1材料

2014年7月在廣東省廣州市南沙區(qū)蒲園的綠化地朱槿病株上采集供試感病葉片.病株表現(xiàn)為葉脈膨大且顏色加深，葉片邊緣上卷，有脈突和耳突等木爾坦棉花曲葉病的典型癥狀.對照葉片是在未顯癥狀的健康朱槿植株上采集的.

介體昆蟲為室內(nèi)飼養(yǎng)于朱槿植株上的MEAM1隱種(B型)煙粉虱試驗(yàn)種群.

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有CLCuMV基因組的質(zhì)粒pBin PLUS-1. 85A，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害防控研究室提供.

高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司) ;血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司) ;植物基因組提取試劑盒EasyPureTMPlant Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司) ; 2XGoTaqTMGreen Master Mix(普洛麥格生物技術(shù)有限公司) ; 2×SYBR Green PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司) ; Alpha1506微量分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司).

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒提取與引物設(shè)計(jì)取出保存于－80℃并含有pBin PLUS-1. 85A的農(nóng)桿菌菌株(GV3101)培養(yǎng)后，用試劑盒提取質(zhì)粒pBin PLUS-1. 85A，再將其轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，繼續(xù)培養(yǎng).取D600 nm為0. 6～0. 8的適量菌液，用試劑盒提取質(zhì)粒，微量分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，將該質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品母液，－20℃保存?zhèn)溆?

質(zhì)粒中病毒基因組拷貝數(shù)= N×10－9×ρ/Mr，式中，N為阿伏伽德羅常數(shù)，ρ為核酸質(zhì)量濃度(ng·μL－1)，Mr為相對分子質(zhì)量.由該公式計(jì)算出母液質(zhì)粒濃度為5. 02×109μL－1.

基于CLCuMV的DNA-A基因組序列(GenBank登錄號為: EF465535. 1［17］)，用Primer 5. 0軟件設(shè)計(jì)并合成檢測引物CLCMuV 492-F: 5'-TCCAGATGTCCGCACAAATA-3'，CLCMuV 492-R: 5'-AACCAGGTCAGCACATTTCC-3'.

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及條件常規(guī)PCR反應(yīng)體系(25 μL):2XGoTaqTMGreen Master Mix 12. 5 μL，CLCMuV 492-F和CLCMuV 492-R各1 μL，樣本DNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL.陰性對照不加DNA，加1 μL DEPC(焦磷酸二乙酯)水.反應(yīng)條件: 94℃7 min;94℃35 s，49℃35 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán); 72℃10 min，4℃保存.在10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.

熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、10 μmol·L－1CLCMuV 492-F和CLCMuV 492-R各0. 5 μL、樣本DNA 1 μL、用ddH2O補(bǔ)至20 μL.陰性對照不加DNA，加1 μL DEPC水.反應(yīng)條件: 94℃，7 min; 94℃，35 s，49℃，35 s，72℃，45 s，35個(gè)循環(huán); 95℃，10 s，95℃，5 s.1.2.3 CLCuMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR用DEPC水以10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品母液，獲得8個(gè)供試的質(zhì)粒濃度: 5. 2×108、5. 2×107、5. 2×106、5. 2×105、5. 2×104、5. 2×103、5. 2×102和5. 2×101μL－1，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，獲得質(zhì)粒濃度與其循環(huán)閾值(Ct值)之間關(guān)系，建立其檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線.

CLCuMV以5. 2×109、5. 2×108、5. 2×107、5. 2× 106、5. 2×105、5. 2×104、5. 2×103、5. 2×102、5. 2× 101和5. 2 μL－1為供試濃度，對其進(jìn)行常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，比較其檢測的靈敏度.以不加DNA模板作為陰性對照.1.2.4朱槿顯癥葉片DNA提取及CLCuMV定量檢測選取5株朱槿發(fā)病植株，分別采集顯癥的嫩葉、成熟葉片，分開標(biāo)記編號，每袋1片樣葉，帶回實(shí)驗(yàn)室并保存于－80℃冰箱中.試驗(yàn)時(shí)，試劑盒提取朱槿DNA，用健康朱槿上的葉片作對照.微量分光光度計(jì)測定各樣本的總DNA質(zhì)量濃度，再將其稀釋為100 ng·μL－1，備用.

1.2.4煙粉虱飼毒處理及CLCuMV定量檢測以顯癥的朱槿作為病毒來源，在放置病株的養(yǎng)蟲籠(50 cm×50 cm×50 cm)中釋放B型煙粉虱300頭.接蟲24、48 h后分別從接蟲朱槿植株的上、中、下部葉片上隨機(jī)吸取飼毒成蟲，共10頭，并放于φ為95%的乙醇溶液保存，待測.從健康朱槿植株上飼養(yǎng)的供試成蟲中吸取10頭，作為對照.試劑盒提取介體昆蟲DNA，微量分光光度計(jì)測定各樣本的總DNA質(zhì)量濃度，將其稀釋為10 ng·μL－1，備用.

1.3數(shù)據(jù)處理

采用t檢驗(yàn)對已顯癥狀朱槿嫩葉與成熟葉片處理的CLCuMV含量、飼毒24與48 h煙粉虱蟲體CLCuMV含量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).采用SPSS 19. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2　結(jié)果與分析

2.1 CLCuMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用DEPC水以10倍梯度稀釋質(zhì)粒母液獲得8個(gè)濃度，并對其進(jìn)行熒光定量PCR，獲得8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度與Ct值之間的關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式為y =－3. 75x + 40. 56 (朱槿)、y =－4. 13x + 41. 43(煙粉虱)，其中y為循環(huán)閾值(Ct值)、x為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度拷貝數(shù)的對數(shù)值.

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR檢測CLCuMV的靈敏度

將5. 2～5. 2×109μL－110個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線表明，空白對照無DNA模板，Ct值高于35，當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品為5. 2×109，5. 2× 108、5. 2×107、5. 2×106、5. 2×105、5. 2×104、5. 2× 103、5. 2×102、5. 2×101和5. 2×100μL－1，其Ct值分別為4. 72、8. 56、12. 89、16. 31、20. 05、23. 23、26. 66、29. 65、32. 87和35. 22，其中5. 2 μl－1的Ct值高于35，其余的均小于35，說明利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可定量檢測出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的最低濃度為5. 2 ×101μL－1.利用常規(guī)PCR檢測上述10個(gè)濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，5. 2×109、5. 2×108、5. 2×107、5. 2× 106、5. 2×105、5. 2×104、5. 2×103和5. 2×102μL－1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品可擴(kuò)增出清晰的492 bp的目的條帶(圖1)，判定該方法檢測最低濃度為5. 2×102μL－1.分析表明，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CLCuMV的靈敏度約是常規(guī)PCR的10倍.

圖1　10個(gè)濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的常規(guī)PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of 10 concentrations of plasmid standard samples

2.3朱槿病株的CLCuMV定量檢測

利用上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對供試的朱槿上顯癥的嫩葉、成熟葉及對照進(jìn)行CLCuMV定量檢測.結(jié)果表明，顯癥的嫩葉和老熟葉片的Ct平均值分別為20. 66±0. 89和22. 70±0. 32，均可檢測到病毒，但所有健康葉片樣本的Ct值均大于35，未檢測到病毒.根據(jù)試驗(yàn)所建立的檢測朱槿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得顯癥嫩葉和顯癥老熟葉片的CLCuMV濃度分別為(9. 00±3. 80)×105和(1. 60±0. 25)×105μL－1，雖然后者小于前者，但兩者間無顯著性差異(t =－2. 173，P = 0. 095).

2.4煙粉虱蟲體CLCuMV定量檢測

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對未飼毒和飼毒的單頭煙粉虱蟲體進(jìn)行檢測，結(jié)果表明對未經(jīng)飼毒煙粉虱擴(kuò)增的Ct值均大于35，說明對照中的煙粉虱不帶毒;飼毒后24和48 h煙粉虱的擴(kuò)增Ct值為32. 44 ±0. 24和31. 92±0. 73，說明飼毒24和48 h的煙粉虱均能檢測到病毒，根據(jù)建立的檢測煙粉虱標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出飼毒24和48 h的煙粉虱含有CLCuMV (4. 0±1. 6)×102和(1. 3±0. 2)×102μL－1，前者顯著性地大于后者(t = 2. 445，P = 0. 04).結(jié)果分析表明，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可對介體內(nèi)的CLCuMV進(jìn)行定量檢測.

3　討論與結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測木爾坦棉花曲葉病毒的方法，本方法的靈敏度約是常規(guī)PCR的10倍，檢測最低濃度達(dá)到5. 2×101μL－1.王洪星等［18］應(yīng)用RT-PCR檢測甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒，檢出水平分別為5×102和2. 5×102μL－1.李金磊等［19］建立的RT-PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒靈敏度可達(dá)5×101μL－1，與本試驗(yàn)靈敏度類似.

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測寄主植物及介體昆蟲的CLCuMV帶毒量，檢測的顯癥嫩葉與顯癥老熟葉片的CLCuMV含量并無顯著差異.筆者還發(fā)現(xiàn)將煙粉虱轉(zhuǎn)移到非番茄黃化曲葉病毒寄主植物上時(shí)，隨著時(shí)間延長，昆蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量遞減.本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼毒24 h煙粉虱獲毒量顯著性地高于飼毒48 h煙粉虱獲毒量，但CLCuMV在昆蟲介體煙粉虱中的增殖情況還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證.

建立并完善CLCuMV的檢測體系，將有助于比較CLCuMV在不同寄主植物中的傳播情況，也可以監(jiān)測CLCuMV在昆蟲介體中的繁殖動態(tài)，最終有效預(yù)防木爾坦棉花曲葉病的傳播.

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【責(zé)任編輯霍歡】

A SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR detection method for Cotton leaf curl virus

ZHAO Rui1，2，LüLihua2，CHEN Ting2，HE Zifu2，HE Yuyong1
(1 College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;
2 Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection/Plant ProtectionResearch Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China)

Abstract:【Objective】Cotton Leaf Curl Multan Virus (CLCuMV) is one of the most important viral pathogens of Malvaceae plants.The purpose of this study is to establish an accurate detection method for CLCuMV，which can provide a technological means to study propagation dynamics of viruse in host plants，virus generation cycle inside vector insect，and interaction mechanisms among virus，plant and vector.【Method】The SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR was adopted using CLCuMV-plasmid as template and the standard curve was established.In accordance with the standard curve，the CLCuMV contents in leaves of Hibiscus rose-sinensis and vector bodies of Benisia tabaci were calculated.【Result and conclusion】The detection sensitivity was as low as 5. 2×101μL－1of CLCuMV，which was 10 times as sensitive as conventional PCR.It can be applied to quantitatively detect CLCuMV in host plants and vector insects.

Key words:CLCuMV; Malvaceae; SYBR Green I; real-time fluorescence quantitative PCR; detection method

基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B050300014，2011B031500020)

作者簡介:趙蕊(1990—)，女，碩士研究生，E-mail: 335908457@ qq.com;通信作者:何余容(1963—)，女，教授，博士，E-mail: yrhe@ scau.edu.cn

收稿日期:2015-01-11

文章編號:1001-411X(2015) 06-0087-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:S435.79