杜勇李浩渤

E-cadherin在口腔扁平苔蘚中的表達(dá)及意義

杜勇李浩渤

【摘要】目的口腔扁平苔蘚(OLP)是常見的口腔黏膜病變，部分OLP病例可發(fā)生癌變，E-cadherin是參與細(xì)胞間粘附連接的主要分子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起到重要的作用，成為預(yù)示腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在檢測(cè)E-cadherin在口腔扁平苔癬中的表達(dá)，探討E-cadherin在OLP發(fā)病及癌變中的作用，為口腔扁平苔蘚癌變的早期診斷和治療提供依據(jù)。方法本研究使用52例口腔扁平苔蘚標(biāo)本蠟塊和41例口腔正常黏膜標(biāo)本蠟塊。運(yùn)用SP免疫組織化學(xué)法，以E-cadherin單克隆抗體作為一抗，用已知的E-cadherin陽性的正?？谇火つ?biāo)本作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，對(duì)切片標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，觀察陽性染色的分布及強(qiáng)度，對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行研究分析。結(jié)果在52例口腔扁平苔蘚標(biāo)本中25例呈正常陽性表達(dá)，27例呈現(xiàn)異常陽性表達(dá)，異常陽性率為51.92%;在41例正常口腔黏膜標(biāo)本中39例呈正常陽性表達(dá)，2例呈現(xiàn)異常陽性表達(dá)，異常陽性率為4.88%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論E-cadherin在口腔扁平苔蘚標(biāo)本中的異常陽性表達(dá)率明顯高于正常口腔黏膜，提示E-cadherin在口腔扁平苔蘚惡變的過程中發(fā)揮著一定作用，進(jìn)一步證實(shí)口腔扁平苔蘚具有潛在惡變的可能。

【關(guān)鍵詞】口腔扁平苔蘚; E-鈣粘蛋白;免疫組化

【中圖分類號(hào)】R 781.5+9

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002－7386(2015)16－2426－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.007

通訊作者:作者單位: 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科李浩渤，050000河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科;E-mail: lhbkn@126.com

【Abstract】Objective To investigate the expression of E-cadherin in oral lichen planus(OLP)and to explore the role of E-cadherin in pathogenesis and carcinomatous change of OLP in order to provide scientific evidences for early diagnosis and treatment of OLP canceration.Methods Fifty-two OLP specimens were collected，at the same time，41 normal oralmucousmembrane specimens were served as control group.Using E-cadherinmonoclonal antibody as primary antibody，taking E-cadherin-positive normal oralmucousmembrane specimen as positive controls and using PBS as negative controls instead of primary antibody，these specimens were detected by immmunohistology(SP)to observe the distribution and intensity of positive staining，moreover，the expression of E-cadherin was analyzed.Results Twenty-five specimens out of the 52 OLP specimens showed normal positive expression of E-cadherin，however，the other 27 specimens showed abnormal positive expression of E-cadherin，with abnormal positive rate being 51.92%.However in control group，39 out of 41 specimens showed normal positive expression and 2 specimens showed abnormal positive expression，with abnormal positive rate being 4.88%，there was a significant difference between two groups.Conclusion The abnormal positive expression rate of E-cadherin in OLP is significantly higher than that in normal oralmucousmembrane，which suggests that E-cadherin plays a certain role in the canceration of OLP，and it is further confirmed that OLP is possible to be cancerated.

收稿日期:(2015－02－10)

Expression and significance of E-cadherin in oral lichen planus

DU Yong，LI Haobo.Department of Stomatology，The Second Hospital of Hebeimedical University，Shijiazhuang 050000，China

【Key words】oral lichen planus; E-cadherin; immunohistochemistry

口腔扁平苔蘚(OLP)是一種常見的口腔黏膜病變，具體發(fā)病機(jī)制不詳，可能包括抗原特異性和非特異性兩種?？乖禺愋詸C(jī)制包括基底角質(zhì)細(xì)胞抗原提呈和CD+8細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷抗原特異性角質(zhì)細(xì)胞。非特異性機(jī)制包括肥大細(xì)胞脫粒和口腔扁平苔蘚病變區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶被激活。研究發(fā)現(xiàn)部分OLP病例可發(fā)生癌變，癌變率為1%～2%［1－3］，同時(shí)某些癌基因或抑癌基因在OLP的異常表達(dá)也提示OLP具有癌變的危險(xiǎn)性，故WHO將其列入“潛在惡性病變”的范疇［1，4］。研究表明，OLP癌變是多種因素共同作用導(dǎo)致上皮細(xì)胞增殖和凋亡的失衡，致癌基因、抑癌基因或某些信號(hào)通路出現(xiàn)異常，最終誘使OLP向惡性方向發(fā)展［5－7］。近年，部分學(xué)者對(duì)OLP是否癌變產(chǎn)生了疑問和爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為OLP與其他口腔黏膜良性損害相比，并不存在更高的癌變危險(xiǎn)性，并且認(rèn)為OLP的上皮組織與潛在惡性病變或癌變的口腔組織不同，而與其他良性口腔病變相似，OLP的3個(gè)主要抑癌基因位點(diǎn)與輕、重度異常增生及口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)相比有明顯差異，與良性纖維瘤基本一致［8］。因此，若能發(fā)現(xiàn)與OLP癌變趨勢(shì)相關(guān)的生物標(biāo)記物，則可以對(duì)OLP患者的癌變風(fēng)險(xiǎn)做出科學(xué)評(píng)估。目前臨床上判斷癌變可能性的主要依據(jù)是通過病理切片來評(píng)價(jià)上皮異常增生的組織學(xué)形態(tài)，近年來，生物標(biāo)記物的發(fā)展有助于更加客觀地判斷OLP患者所處的疾病階段，并預(yù)

測(cè)癌變的潛在危險(xiǎn)性，但是如何提高生物標(biāo)記物的特異性和可靠性是該領(lǐng)域研究的難點(diǎn)之一。因此，若能發(fā)現(xiàn)OLP向口腔鱗癌轉(zhuǎn)變趨勢(shì)的生物標(biāo)記物，則可以對(duì)OLP患者的癌變風(fēng)險(xiǎn)做出科學(xué)評(píng)估。目前關(guān)于E-cadherin在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中的表達(dá)已有報(bào)道，但它在OLP中的表達(dá)情況鮮見報(bào)道，E-cadherin在OLP癌變過程中是否發(fā)揮作用有待研究。本研究擬采用免疫組化方法研究E-cadherin在OLP中的表達(dá)，旨在探討E-cadherin在OLP發(fā)病及癌變中的作用，以期為口腔扁平苔蘚癌變的早期診斷和臨床治療提供更多的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2005至2012年口腔扁平苔蘚蠟塊標(biāo)本52例(所有患者在取標(biāo)本前未經(jīng)任何治療)，每例標(biāo)本均進(jìn)行HE染色后經(jīng)病理醫(yī)師閱片后確診。本組患者中男28例，女24例;年齡38～73歲，平均年齡52.6歲。對(duì)照組:正常口腔黏膜組織41例，均取自囊腫旁及牙槽骨整形手術(shù)時(shí)切除的正常黏膜組織，每例均進(jìn)行HE染色后經(jīng)病理醫(yī)師閱片后確診。其中男22例，女19例;年齡21～68歲，平均年齡31.6歲。2組一般資料具有均衡性。

1.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)用已知的E-cadherin陽性的正?？谇火つ?biāo)本作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3實(shí)驗(yàn)方法運(yùn)用SP免疫組織化學(xué)法，以E-鈣粘蛋白單克隆抗體作為一抗，對(duì)切片標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，觀察陽性染色的分布及強(qiáng)度，對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行研究分析。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟重新包埋后，將每個(gè)蠟塊切為5 μm的切片，共切3張，1張HE染色，1張E-鈣粘蛋白染色，1張作為陰性對(duì)照。一抗:兔抗人E-cadherin單克隆抗體、二抗:生物素標(biāo)記羊抗兔IgG。

操作步驟如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水; 3% H2O2甲醇振洗25min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性;微波抗原修復(fù)，(92～98)℃×15min，室溫冷卻;正常山羊血清封閉，37℃孵育30min;傾去血清，滴加一抗，4℃過夜;滴加生物素化二抗，37℃孵育25min;滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃孵育20min; DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。

上述步驟中，除正常山羊血清封閉一步，其余每步后均以PBS振洗5min×3次。實(shí)驗(yàn)中主要試劑:一抗:兔抗人E-cadherin單克隆抗體(購自中國(guó)武漢博士德生物公司)、二抗:生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(購自中國(guó)武漢博士德生物公司)、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑、多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)防脫片劑(購于河北博海生物有限公司)。

1.4結(jié)果判定E-cadherin以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色膜性染色作為正常陽性表達(dá)的標(biāo)記。而位于細(xì)胞漿中或胞膜與胞漿共同有連續(xù)線狀或斑點(diǎn)狀黃色至棕黃色顆粒沉積者為異常陽性表達(dá)，無染色者為陰性表達(dá)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 E-cadherin在口腔正常黏膜和扁平苔蘚中的表達(dá)在41例正?？谇火?biāo)本中39例呈正常陽性表達(dá)，2例呈異常陽性表達(dá)，異常陽性率為4.88%;在52例口腔扁平苔蘚標(biāo)本中25例呈正常陽性表達(dá)，27例呈現(xiàn)異常陽性表達(dá)，異常陽性率為51.92%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.64，P＜0.05)。見表1，圖1、2。

圖2　E-cadherin在扁平苔蘚中的表達(dá)(SP×400)

圖1　E-cadherin在正常黏膜中的表達(dá)(SP×400)

表1　E-cadherin在2種黏膜中表達(dá)比較　例

2.2 E-cadherin的表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系在性別和年齡的對(duì)照中，E-cadherin在口腔扁平苔蘚中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2　E-cadherin的表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系　例

3　討論

OLP是口腔黏膜的一種免疫性炎癥性疾病，其病因與局部慢性損傷、藥物刺激、精神緊張、全身性疾患、細(xì)菌、病毒感染等有關(guān)。目前認(rèn)為OLP是一種由外源性抗原或自身抗原導(dǎo)致的、由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的口腔黏膜基底角質(zhì)細(xì)胞的慢性免疫破壞性疾病。目前多數(shù)學(xué)者支持口腔扁平苔蘚是癌前狀態(tài)，是一種具有惡性轉(zhuǎn)變風(fēng)險(xiǎn)的慢性口腔黏膜病，經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程可能轉(zhuǎn)變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌(OSCC)。OLP癌變是多種

因素共同作用的結(jié)果，在局部免疫制劑、病毒感染、致癌劑和細(xì)胞因子等因素的共同作用下，組織發(fā)生癌基因活化、染色體突變和抑癌基因的異常，最終導(dǎo)致組織發(fā)生癌變。近些年關(guān)于OLP癌變機(jī)制及有關(guān)基因的研究受到廣泛重視，對(duì)于OLP癌變的早預(yù)防、早診斷和早治療都具有重要意義。

E-cadherin是一類介導(dǎo)同源細(xì)胞間粘附的鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，屬于鈣依賴性的Ⅰ型細(xì)胞粘附分子，主要存在于人和動(dòng)物上皮細(xì)胞，是哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中第一個(gè)表達(dá)的鈣粘蛋白。E-cadherin影響胚胎發(fā)育中細(xì)胞的分化，參與組織器官的形成，在細(xì)胞間粘附中發(fā)揮著細(xì)胞極性和組織完整性的功能，對(duì)維持上皮細(xì)胞形態(tài)和組織完整性發(fā)揮重要作用。E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附力減弱，使細(xì)胞獲得浸潤(rùn)性和游走性遷移能力，從而有利于腫瘤細(xì)胞在繼發(fā)部位生長(zhǎng)增殖，形成新的病灶。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin介導(dǎo)了多種細(xì)胞的不貼壁生長(zhǎng)，而且E-cadherin裂解片段在許多病變中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞連接的破壞、細(xì)胞遷移、侵襲及信號(hào)的激活，提示E-cadherin同時(shí)具有著促癌的作用［9，10］。研究已證實(shí)在多種上皮來源的惡性腫瘤中，如結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮癌等均發(fā)現(xiàn)E-cadherin的異常表達(dá)［11－13］，提示E-cadherin與腫瘤的病理特征和生物學(xué)行為密切相關(guān)。E-cadherin不僅在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用，而且在癌前病變的發(fā)展中也發(fā)揮了重要的作用，如口腔黏膜白斑、宮頸癌的癌前病變上皮內(nèi)瘤樣病變中也發(fā)現(xiàn)了E-cadherin的異常表達(dá)［14，15］，可以作為腫瘤早期診斷和預(yù)防的可靠指標(biāo)。

E-cadherin是一種鈣依賴性的細(xì)胞粘附分子，編碼基因定位于16q21，其N端位于細(xì)胞外而C端位于細(xì)胞內(nèi)，屬于鈣粘蛋白超家族，是一種重要的細(xì)胞粘附分子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附反應(yīng)，維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)和完整性。E-cadherin介導(dǎo)的粘附連接在維持上皮細(xì)胞極性和抑制細(xì)胞遷移能力方面發(fā)揮著重要的作用［17，18］。作為是一種重要的抑癌分子，E-cadherin主要通過加強(qiáng)細(xì)胞間的粘附和抑制細(xì)胞增殖來發(fā)揮抑癌功能。E-cadherin基因表達(dá)改變?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展過程及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起到重要的作用，與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率密切相關(guān)，成為預(yù)示腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一［19，20］。通過對(duì)多種腫瘤中E-cadherin表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中均伴有E-cadherin基因的突變和功能改變，呈現(xiàn)表達(dá)減少或消失，同時(shí)伴有癌組織侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增加［21－23］，證明了E-cadherin的減少或丟失可以成為上皮細(xì)胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變的標(biāo)志性變化，細(xì)胞外的信號(hào)通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制活化不同的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)下游蛋白的表達(dá)，E-cadherin作為這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，通過改變腫瘤細(xì)胞的表型使遷移到新的位置的腫瘤細(xì)胞獲得上皮樣的表型，在繼發(fā)部位生長(zhǎng)增殖，形成新的病灶，在腫瘤的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用［24－26］。OLP作為OSCC的癌前病變，E-cadherin是否在其發(fā)生、發(fā)展及惡變過程中起到一定作用，罕見文獻(xiàn)報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了E-cadherin在41例正常口腔黏膜標(biāo)本和52例口腔扁平苔蘚標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示E-cadherin在2組中的表達(dá)具有顯著差異，在口腔扁平苔蘚標(biāo)本中E-cadherin的膜性表達(dá)率明顯低于在正常黏膜中的表達(dá)，膜性表達(dá)的喪失提示E-cadherin在口腔扁平苔蘚惡變的過程中發(fā)揮著一定作用，口腔扁平苔蘚具有潛在惡變的可能，據(jù)此我們支持OLP具有癌變危險(xiǎn)性的觀點(diǎn)，認(rèn)為OLP是一種潛在惡性病變?？谇话装吲cOLP同樣為常見的口腔黏膜癌前病變，已證實(shí)口腔白斑中E-cadherin呈現(xiàn)異常表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，在一定程度上佐證了本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

總之研究已證實(shí)E-cadherin涉及多條致癌通路，本研究以E-cadherin作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，觀察其在OLP中的表達(dá)情況，對(duì)E-cadherin在口腔扁平苔蘚癌變中的作用做進(jìn)一步的探討，以期為口腔扁平苔蘚癌變的早期診斷和臨床治療提供更多的理論依據(jù)。

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